Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Расширение дрожжи один гибрид экраны для определения фактора транскрипции, привязка к последовательности ДНК человека

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59192

⸱

11 февраля 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем расширенной дрожжи один гибрид скрининг протокол для выявления факторов транскрипции (TFs), которые можно привязать к человеческой ДНК региона интерес. Этот метод использует высокопроизводительного скрининга трубопровода, который может допрашивать связывание > 1000 TFs в одном эксперименте.

Аннотация

Определение набора факторов транскрипции (TFs), которые регулируют каждого человека ген является сложной задачей, которая требует интеграции многочисленные экспериментальные и расчетные подходы. Один из таких методов является дрожжи пробирного один гибрид (Y1H), в котором взаимодействие между TFs и ДНК регионах тестируются в обстановке дрожжи ядра с помощью репортер генов. Y1H анализы включают два компонента: «ДНК приманка» (например., промоутеров, усилители, глушители и т.д.) и «TF-добычу,» которые могут проверяться для активации Репортер ген. Наиболее опубликованные протоколы для выполнения Y1H экраны основаны на преобразования библиотеки TF-добычу или массивов в ДНК приманка штаммов дрожжей. Здесь мы описываем трубопровода, называется расширенной Y1H assays (eY1H), где допрашивают TF-ДНК взаимодействия путем спаривания ДНК приманка штаммы с выстроились коллекции штаммов TF-добычу, используя массив высокой плотности (HDA) Роботизированная платформа, которая позволяет скрининга в 1536 колонии формат. Это позволяет резкое увеличение пропускной способности (60 последовательностей ДНК приманка против > 1000 TFs занимает две недели за исследователь) и воспроизводимость. Мы иллюстрируют различные виды ожидаемых результатов путем тестирования человека промоутер последовательности против массив 1086 человека TFs, а также примеры вопросов, которые могут возникнуть во время экраны и способы их устранения.

Введение

Центральная проблема в области биомедицины, является определение механизмов, которыми регулируется каждого человека ген. Транскрипция является первым шагом в борьбе уровни выражения гена, и он регулируется наборы факторов транскрипции (TFs), которые являются уникальными для каждого гена. Учитывая, что люди кодировать для > 1500 TFs1,2, определить полный набор TFs, которые контролируют выражение каждого гена остается открытым вызовом.

Два типа методов может использоваться для сопоставления TF-ДНК взаимодействий: TF-центре и ДНК центру методы3 (рис. 1A). TF-центру методов TF интереса является зондируемой для привязки геномной ДНК регионов или для определения его специфика связывания ДНК. Эти методы включают в себя иммунопреципитации chromatin (чип) следуют высокопроизводительного секвенирования, microarrays протеина привязки и SELEX4,5,6. В ДНК центру методов последовательность ДНК интереса является зондируемой определить набор TFs, привязанные к последовательности ДНК. Наиболее широко применяемым из таких методов является дрожжи один гибрид анализов (Y1H), в которых взаимодействия между TFs и ДНК регионах тестируются в среде дрожжи ядра с помощью репортер генов7,8,9.

Y1H анализы включают два компонента: «ДНК приманка» (например, промоутеров, усилители, глушители и т.д.) и «TF-добычу,» которые могут проверяться для Репортер ген активации9,10 (рис. 1B). ДНК приманка клонируется вверх по течению два репортера генов (LacZ и HIS3) и оба ДНК bait::reporter конструкции интегрированы в геноме дрожжи для создания chromatinized ДНК приманка штаммов. TF-добычу, закодированные в плазмиды, выражающий TF сливается для активации домена (AD) дрожжей Gal4 TF, вводится в штамм ДНК приманка для ловли TF-ДНК взаимодействия. Если TF-добычу связывает последовательности ДНК приманка, AD, присутствующих в TF-добычу приведет к активации как репортер генов. В результате клетки с позитивного взаимодействия может выбран для роста на пластины не хватает гистидина, а также преодоление конкурентный ингибитор, 3-амино-1,2,4-триазола (3-AT) и визуализируется как синий колоний в присутствии X-Гал. Потому что мощным дрожжи Gal4 объявление используется, Y1H анализов может обнаруживать взаимодействия с участием transcriptional активаторы, а также подавляющего. Кроме того учитывая, что TF-preys выражаются от сильного дрожжи промоутер (ADH1), взаимодействия могут быть обнаружены даже для TFs, которые имеют низкий эндогенного выражение уровней, которые являются сложными для обнаружения на чип11,12.

Наиболее опубликованные протоколы для выполнения Y1H анализы основаны на внесении TF-preys в ДНК приманка штаммов дрожжей путем преобразования пуле TF-добычу библиотек, последующим выбор, колонии комплектации и последовательности для определения взаимодействующих TF, или Преобразование отдельных клонов8,9. Это трудоемкий протоколы, ограничивая число последовательностей ДНК, которые могут быть проверены на исследователь. Недавнее улучшение анализов Y1H, называется расширение Y1H (eY1H), резко возросли скрининга пропускную способность с помощью высокой плотности массив (HDA) Роботизированная платформа для каждого выражения разных мат штаммов дрожжей ДНК приманка с коллекцией штаммов дрожжей TF-добычу10,13 (рис. 1 c). Эти экраны используют 1.536 колонии формат, позволяющий проверить большинство человеческих TFs в составленном, используя только три пластины. Кроме того, учитывая, что TF-ДНК взаимодействия тестируются на основе pairwise, этот подход позволяет для сравнения взаимодействий между ДНК приманок (например, два варианта некодирующей единичных нуклеотидных) и между различными TFs или TF варианты11,12 ,14.

С помощью eY1H анализов, мы разделенное крупнейший человека и Caenorhabditis elegans TF-ДНК, ДНК центру взаимодействия сетей к дата. В частности мы определили 2,230 взаимодействий между 246 человеческого развития усилителей и 283 TFs12. Кроме того мы использовали eY1H анализов для выявления измененных TF привязки 109 единичных нуклеотидных некодирующей варианты, связанные с генетическими заболеваниями, такими как пороки развития, рак и неврологических расстройств. Совсем недавно мы использовали eY1H для разграничения сети, состоящей из 21,714 взаимодействий между 2576 C. elegans генным стимуляторам и 366 TFs11. Эта сеть была инструментальная раскрыть функциональные роли десятки C. elegans TFs.

Протоколы для создания ДНК приманка пятна и оценивать уровни фоновой активности репортер были сообщила других15,16,17. Здесь мы описываем eY1H трубопровода, которые могут использоваться для экран любого человека геномной ДНК региона против массив 1086 человека TFs. После того, как формируется дрожжей штамма ДНК приманки и TF-добычу массив выставляется на соответствующий пластин, весь протокол могут быть выполнены в две недели (Таблица 1). Что еще более важно протокол можно распараллелить так, что один исследователь может одновременно экрана 60 последовательностей ДНК приманки. Чтобы продемонстрировать протокол, мы экранированный промоутеров двух генов цитокинов, CCL15 и IL17F. Кроме того мы показываем результаты от неудачных экранов проиллюстрировать типы проблем, которые могут возникнуть при выполнении eY1H анализов и способы их устранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

  1. SC −U −H плиты (Петри 150 мм)
    Примечание: Эти пластины будет использоваться для выращивания штаммов дрожжей ДНК приманки.
    1. Растворите отсева микс, дрожжи азота базы (YNB), аденин hemisulfate и сульфат аммония в 920 мл воды и pH 5.9 с 5 M NaOH (примерно 1 мл на литр СМИ; см. таблицу 2 для композиции). Залейте 2 Л колбу и добавить панель перемешать.
    2. В второй колбе 2 Л, добавить агар 950 мл воды (не добавить панель перемешать, как он вызовет агар кипеть в автоклаве).
    3. Автоклав для 40 мин на 15 psi на основе жидкого цикла.
    4. Сразу Вылейте содержимое первой колбе, включая бар перемешать, в агар, содержащие колбу. Добавьте глюкозы, смесь хорошо на тарелку, перемешать и охладить до 55 ° C на водяной бане.
    5. Добавьте лейцина и триптофана в средствах массовой информации. Смесь хорошо на тарелку, перемешать и вылить в стерильных Петри 150 мм (~ 80 мл на блюдо). Сухой для 3-5 дней при комнатной температуре, завернуть в пластиковые мешки и хранят при комнатной температуре до 6 месяцев.
  2. YAPD прямоугольной пластины
    Примечание: Эти пластины будет использоваться для выращивания газона для штамма ДНК приманки и для спаривания с TF массив-коллекцию.
    1. Распустить порошков (см. таблицу 3 для композиции), за исключением агар, 950 мл воды в колбу 2 Л и добавить панель перемешать.
    2. В второй колбе 2 Л, добавить агар 950 мл воды (не добавить панель перемешать, как он вызовет агар кипеть в автоклаве).
    3. Автоклав для 40 мин на 15 psi на основе жидкого цикла.
    4. Сразу Вылейте содержимое первой колбе, включая бар перемешать, в агар, содержащие колбу.
    5. Добавьте глюкозы, смесь хорошо на пластину перемешать и здорово 55 ° C. Налить СМИ в прямоугольной пластины (см. Таблицу материалов; ~ 70 мл на пластину) с использованием перистальтического насоса (5 мл/сек) и трубку 6 мм. Сухой за 1 день при комнатной температуре, обернуть в пластиковые мешки и хранят в холодной комнате на срок до 6 месяцев.
      Примечание: Хотя объем предлагаемых СМИ 70 мл на тарелку, 50-80 мл на табличке может использоваться. Три важнейших вопросов для рассмотрения когда лить пластины являются 1) что они выровнены, так что агар СМИ имеет такой же толщины по всей пластине (использовать выдвинутые таблицы или поверхности для наливания пластины и не наливайте в штабеля более чем семи пластин) 2) для обеспечения отсутствия пузырьков в агар СМИ (пузыри должны быть выскочил с помощью стерильной иглой) и 3) сушки пластин на только один день и упаковка плит в пластиковые мешки, чтобы избежать сбоев в закрепление дрожжей.
  3. SC-−Trp и СК −U −Trp прямоугольной пластины
    Примечание: Эти пластины будет использоваться для выращивания коллекции массива TF (Sc −Trp) и выбрать диплоидных дрожжей после спаривания (Sc −U −Trp).
    1. Распустить отсева микс, YNB, аденин hemisulfate и сульфат аммония в 920 мл воды и pH 5.9 с NaOH 5 М (примерно 1 мл на литр СМИ) (см. таблицу 4 для композиции). Залейте 2 Л колбу и добавить панель перемешать.
    2. В второй колбе 2 Л, добавить агар 950 мл воды (не добавить панель перемешать, как он вызовет агар кипеть в автоклаве).
    3. Автоклав для 40 мин на 15 psi на основе жидкого цикла.
    4. Сразу Вылейте содержимое первой колбе, включая бар перемешать, в агар, содержащие колбу. Добавьте глюкозы, смесь хорошо на тарелку, перемешать и охладить до 55 ° C.
    5. Добавьте лейцина, гистидина и урацилом (пропустить урацила для пластин −Trp −U Sc).
    6. Смесь хорошо на тарелку, перемешать и вылить в прямоугольной пластины (~ 70 мл на пластину) с использованием перистальтического насоса (5 мл/сек) и трубку 6 мм. Сухой за 1 день при комнатной температуре, обернуть пластины в пластиковые мешки и хранят в холодной комнате на срок до 3 месяцев.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + X-Гал прямоугольной пластины
    Примечание:     эти пластины будет использоваться как индикация плиты для eY1H анализов.
    1. Распустить отсева микс, YNB, аденин hemisulfate и сульфат аммония в 850 мл воды (см. таблицу 5 для композиции). Сделать не рН. Залейте 2 Л колбу и добавить панель перемешать.
    2. В второй колбе 2 Л, добавить агар 850 мл воды (не добавить панель перемешать, как он вызовет агар кипеть в автоклаве).
    3. Автоклав для 40 мин на 15 psi на основе жидкого цикла.
    4. Подготовка 10 x Бу соли (1 Л), объединив 900 мл воды, 70 г Na2HPO4∙7H2O и 34,5 g NaH2PO4∙H2O. микса с помощью функции бар stir распустить порошков и Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с помощью 5 M NaOH. Добавьте воду, довести до 1 Л и автоклав.
    5. Приготовляют раствор X-Гал, добавив 3.5 g порошка X-галлон пластиковый Тюбик 50 мл, содержащие 42,5 мл диметилформамид. Добавить порошок X-Гал диметилформамид для более легко растворяются (это занимает 30 минут). Стоковый раствор Храните в темноте (использование непрозрачной 50 мл трубки или обложки фольгой). Хранить при температуре от-20 ° C.
    6. Сразу Вылейте содержимое первой колбе, включая бар перемешать, в агар, содержащие колбу. Добавьте глюкозы и 10 x Бу солей (см. таблицу 5 для композиции), смесь хорошо на тарелку, перемешать и охладить до 55 ° C.
    7. Добавьте лейцина, 3AT и X-Гал (см. таблицу 5 для композиции).
    8. Смесь хорошо на тарелку, перемешать и вылить в прямоугольной пластины (~ 70 мл на пластину) с использованием перистальтического насоса (5 мл/сек) и трубку 6 мм. Сухой за 1 день при комнатной температуре, завернуть в пластиковые мешки и хранить в холодной комнате покрыты алюминиевой фольги (3AT и X-Гал являются светочувствительных) сроком до 1 месяца.

2. кровянистые выделения в массив TF

  1. Размораживание TF-добычу массив
    1. Оттепель дрожжи глицерин запасов пластины с TF-добычу массива на льду.
      Примечание: TF-добычу массивы могут быть созданы как ранее опубликованные10,12,13,18.
    2. Ресуспензируйте дрожжей, используя 12-канальный дозатор в течение 1-3 мин до следующего шага.
  2. Кровянистые выделения дрожжей в Sc −Trp прямоугольной пластины
    1. В роботе HDA (см. Таблицу материалы), выберите несколько хорошо 96 пластины как источник, 96 плиты агара как целевых, так и 96 длинные пин пады.
      Примечание: Пин-пады не пригодны для повторного использования и должен быть уничтожен.
    2. Выберите Реплицировать многие программу, чтобы сделать две копии каждой 96-луночных пластины. Не использовать корзины или пересмотреть параметры, чтобы избежать возврата загрязнения запасов замороженных.
    3. Выберите параметр для вихрем вверх и вниз в источнике Смешать дрожжи.
    4. Мешок пятнистый массив и Инкубируйте агар стороне вверх на 30 ° C на 2-3 дней.
  3. Создание 384 колонии массивы в Sc −Trp прямоугольной пластины
    1. В робота выберите 96 плиты агара в качестве источника, 384 агар пластины как цель и 96 короткие пин пады.
    2. Выберите программу массива 1:4 . Таким образом четыре 96 колонии пластины (каждый из которых содержит различные TF) будут объединены в один 384 колонии пластины. Не использовать корзины или пересмотреть параметры, чтобы избежать загрязнения между различными пластинами.
    3. Пакет пластин и инкубировать пятнистый 384-колонии массив агар стороне вверх при 30 ° C на 2 дня.
  4. Создание 1.536 колонии массивы в Sc −Trp прямоугольной пластины
    Примечание: Это приведет к массивы, содержащие четыре колонии для каждого TF-добычу.
    1. В робота выберите 384 плиты агара в качестве источника, 1.536 агар пластины как цель и 384 короткие пин пады.
    2. Выберите программу единого источника пробирного 1:4. Цель заключается в копировании каждой колонии в четыре колонии для получения quadruplicates. Использование корзины и пересмотреть параметры, как это предполагает копирование четыре раза каждой колонии.
    3. Пакет пластин и инкубировать пятнистый 1536-колонии массив агар стороне вверх при 30 ° C в течение 3 дней.
  5. Усиливая 1.536 колонии массив в Sc −Trp прямоугольной пластины
    1. В робота выберите 1.536 плиты агара в качестве источника, 1.536 плиты агара как цель и 1536 короткие пин пады.
    2. Выберите Реплицировать многие программу повторить 3 – 4 копии. Использование корзины и пересмотреть вариант, но выбросить pad при переключении на другой плиты массива, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
    3. Пакет пластин и Инкубируйте пятнистый 1536-колонии массив агар стороне вверх на 30 ° C в течение 3 дней, чтобы использовать для спаривания шаги (см. ниже). После этого Держите пластины при комнатной температуре и копирования снова после 7 дней для нового раунда скрининга.

3. eY1H экран

  1. Подготовка газонов штамма ДНК приманка для спаривания
    1. Найди дрожжи ДНК приманка штаммов на плите −H −U Sc и расти на 3 дня при температуре 30 ° C.
    2. Полоска дрожжи в 15 см Sc −U −H пластину с помощью стерильных зубочисткой, таким образом, чтобы каждая пластина помещается 12 – 16 различных штаммов. Инкубировать один день на 30 ° C.
    3. Полоска дрожжи в 15 см Sc −U −H пластину с помощью стерильных зубочисткой, таким образом, чтобы каждая пластина помещается 4 различных штаммов. Инкубируйте на один день на 30 ° C.
    4. Очистите с помощью стерильных зубочисткой, не забудьте очистить любые агар и добавить в 1,5 пробирку с 500 мкл стерильной воды дрожжи.
    5. Добавьте 10-15 стерильные стеклянные бусы на YAPD прямоугольной пластины. Добавить дрожжи подвеска на пластину и тщательно встряхнуть во всех направлениях за 1 мин, чтобы убедиться, что дрожжи распространяется через все пластины.
    6. Инвертировать плиты немедленно и коснитесь так что бисер пойти к крышке. Удаление и переработку бисер.
    7. Пакет пластин и инкубировать агар стороне вниз на 1 – 2 дня при температуре 30 ° C. Затем перейти к шагу спаривания.
  2. Спаривания дрожжей ДНК приманки и TF массив штаммов
    1. Передача массива TF YAPD прямоугольной пластины с роботом. Выберите пластину 1.536 агар как источник и цель и 1536 короткие пин-падом. Выберите Реплицировать многие программы. Каждая пластина TF массива может использоваться для передачи до 3-4 YAPD пластин (в зависимости от количества знаков в массиве). TF массив пластин, используемых для спаривания должна быть 2-3 дней, но не больше, как спаривание может быть неэффективным.
    2. Передача газон штамма ДНК приманка для пластин YAPD, уже содержащий массив TF с роботом. Выберите пластину 1.536 агар как источник и цель и 1536 короткие пин-падом. Выберите Реплицировать многие программы. Использовать случайное смещение в источнике с радиусом ~0.6 мм, чтобы избежать принятия дрожжи из того же места и смешайте на цель для облегчения контактов между штаммов дрожжей. Используйте газон, содержащие ДНК приманка штаммы (раздел 3.1) как источник и YAPD пластин, содержащий массив TF, заметили в шаге 3.2.1 как цель.
    3. Пакет пластин и инкубировать агар стороне до 30 ° c за 1 день.
  3. Выбор диплоидных дрожжей
    1. Передать растяжением дрожжей из плит YAPD Sc −U −Trp плиты с роботом. Выберите пластину 1.536 агар как источник и цель и 1536 короткие пин-падом. Выберите реплицировать программу. Mix на источник и на цель.
    2. Пакет пластин и инкубировать агар стороне до 30 ° c на 2-3 дней (длительный инкубационный приводит к высокой фоновой активности репортер).
  4. Передать индикация пластины
    1. Передать диплоидных дрожжей из плиты −Trp −U Sc индикация прямоугольной пластины Sc −U −H −Trp + 5 мм 3AT + 0,4 мм X-Гал с помощью робота. Выберите пластины 1.536 агар как источник и цель и 1536 короткие пин-падом. Выберите реплицировать программу.
    2. Пакет пластин и проинкубируйте агар стороне до 30 ° c до 7 дней.
  5. Томографии индикация пластин
    1. Для ДНК приманка штаммы с высоким уровнем фоновой активности репортер сфотографироваться на 2, 3 и 4. В противном случае принимать фотографии на 4 и 7 дней. Положительных взаимодействий обозначаются роста и синий цвет дрожжей колоний и может определяться вручную, или он может быть определен с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Три основные факторы следует учитывать при анализе результатов от eY1H анализов: фоновой активности репортер штамма ДНК приманка, сила репортер деятельности соответствующего взаимодействия TF-ДНК и количество положительных колоний. Репортер фоновой активности (например, autoactivity) штамма ДНК приманка ссылается на общий рост и цвет дрожжей колоний в индикации пластины, даже в отсутствие хищных TF. В идеале не autoactive штаммов Показывать фон белый или светло-коричневого цвета, с колониями позитивного взаимодействия, б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Робот eY1H спаривания скрининг подход, описанный здесь значительно увеличивает пропускную способность для определения набора TFs, привязанные к ДНК региона интерес, по сравнению с предыдущей библиотеки скрининга или выстроились скрининг подходы, основанные на преобразование. Кроме того TF-ДНК взаимодействия определяется eY1H, которую анализов высокую воспроизводимость как 90% взаимодействий обнаружен положительный для всех четырех колоний проверяются на TF, и 90% взаимодействий тестирование в независимых экран же штамм д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения [R35-GM128625 до J.I.F.B.].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-Амино-1,2,4-триазол (3АТ) ~95 % TLCSigmaA8056-100GКонкурентный ингибитор для продуктов гена HIS3
Аденин сульфат (гемисульфат), дигидратUS BiologicsA0865Необходим для правильного роста дрожжей
Агар Высокая Сила Геля - Бактериологический сортАмериканский Международный ХимическийAGHGUPПитательная среда для роста дрожжей
Сульфат аммонияUS BiologicalsA1450Источник азота в синтетических дрожжевых средах
D+ Глюкоза безводнаяUS BiologicalsG3050Требуется для роста дрожжей
Drop-Out Mix минус His, Leu, Tryp и Uracil, богатая аденином без дрожжевого азота ОсноваUS BiologicsD9540-02Синтетическая полноценная среда, необходимая для роста дрожжей
по краю Многопараметрический pH-метрHanna InstrumentsHI2020-01Для измерения рН селективных сред
Плоские зубочистки 750 каратАлмазДля нанесения дрожжей на петриды
Стеклянные бусиныWalter Stern100CДля распыления дрожжей при создании газонов
Глицерин > 99%Millipore SigmaG9012-1LТребуется для создания запасов замороженных дрожжей
L-гистидинUS BiologicalsH5100Для селекции роста дрожжей в селективных средах
L-лейцинUS BiologicalsL2020-05Для селекции роста дрожжей в селективных средах
L-триптофанSigmaT-0254Для селекции роста дрожжей в селективных средах
N, N-диметилформамидSigma319937-1LДля приготовления X-gal раствора
Omnipense EliteWheatonW375030-AДля дозирования точных объемов среды в пластины Singer
Пептон, BacteriologicalAmerican International ChemicalPEBAUPИсточник белка, необходимый для роста дрожжей
Чашка Петри, 150 мм x15 ммVWR10753-950Для выращивания дрожжей приманки для скрининг
PlusPlatesSinger InstrumentsPLU-003Для изготовления прямоугольных агаровых пластин для использования с Singer Robot
Precision Низкотемпературный БПК Холодильный инкубаторThermoFisher ScientificPR205745RДля инкубации дрожжевых пластин при постоянной температуре
RePads 1,536 короткийSinger InstrumentsREP-005Для переноса массива TF-добычи, дрожжей мата и переноса дрожжей на диплоидные селекторные и считывающие пластины
RePads 384 shortSinger InstrumentsREP-004Для переноса массива TF-добычи с 384 на 1,536 колоний
формата RePads 96 longSinger InstrumentsREP-001Для переноса массива TF-добычи с глицеринового приклада на агаровую пластину
RePads 96 короткихSinger InstrumentsREP-002Для переноса массива TF-prey с 96 на 384 колоний
формата Singer HDA RoToR роботSinger InstrumentsДля переноса дрожжей высокопроизводительным способом
Гидроксид натрия (Pellets/Certified ACS)FisherS318-1Для регулировки pH селективных сред
Sodium Phosphate двухосновной гептагидратSanta Cruz Biotechnologysc-203402CТребуется для репортера LacZ на X-gal 
Моноосновной моногидрат фосфата натрияSanta Cruz Biotechnologysc-202342BТребуется для деятельности репортера LacZ на X-gal 
UracilSigmaU0750-100GДля селекции роста дрожжей в селективных средах
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)Gold BiotechnologyX4281C100&бета;-галактозидаза окрашивает бесцветный X-gal в синий цвет для обнаружения взаимодействия белка и ДНК
Экстракт дрожжейUS BiologicalsY2010Питательная среда для роста и размножения дрожжей
Дрожжевая азотная основа (порошок) без АК, углеводов и без АСиБСП;US BioпрепаратыY2030необходимы для активного роста дрожжей

Ссылки

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884(2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50(2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682(2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459(2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Дрожжевой одногибридный анализштаммы с ДНК-приманкоймассив TF-добычимассив высокой плотностироботизированная платформаформат 1536 колонийсреда SC без триптофанаактивация репортерного генафункциональная геномика
Расширение дрожжи один гибрид экраны для определения фактора транскрипции, привязка к последовательности ДНК человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.