Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Протеома анализ, который призван определить весь набор белковых молекул, выраженные в ячейке, является ценным подход в текущих биологических и медицинских исследований. Этот анализ обычно полагается на масс-спектрометрии, который идентифицирует видов белков, основанный на спектры, порожденных через белка ионизации^1,2,3. Альтернативный метод для анализа протеома-электрофорез, включая электрофореза геля полиакриламида (страница), капиллярного электрофореза и двухмерные (2D) гель-электрофорез. Этот метод полагается на неспецифические люминесцентные маркировки всех белковых молекул в анализируемом клетках, следуют электрофоретического разделения и обнаружения и количественного определения каждого вида белка. Для достижения требуемых неспецифических белков маркировки, одна из стратегий заключается в использовании флуоресцентных красителей, которые могут связываться с белками через электростатический и гидрофобных взаимодействий, например Кумасси синим и рубиново-Sypro^4,5,6 . Альтернативная стратегия заключается в использовании ковалентных маркировки с красителями, содержащих эфира N-оксисукцинимидного (NHS) или maleimide, который можно ковалентно связывать белков через общие остатков таких первичных аминов и тиолы, соответственно^{7, 8}.

Тем временем чувствительность флуоресценции обнаружения идеально подходит для анализа низкой обилие протеинов и небольшое количество клеток. Одной молекулы флуоресценции изображений является одним из наиболее чувствительных методов, что позволяет обнаружения отдельных флуоресцентных красителей и обозначенные протеины в пробирке и в естественных условиях^{9,10,11,12, 13,14,15}. Ожидается, что применение этого метода визуализации для анализа на основе электрофорез протеома включить весьма деликатного и количественных анализов, считая индивидуальных белков-дневно обозначенных. Однако остается неясным, является ли маркировки с флуоресцентными красителями достаточно однородной во всех белковых молекул, и как эта однородность зависит от видов различных белков (рис. 1). Простые решения массовых измерений могут использоваться для получения молярное соотношение флуоресцентных красителей белков под названием «муфты эффективность»⁸ или «маркировки эффективности», но это свойство не содержится информации о однородность маркировки среди белковых молекул.

Здесь мы описываем протокол assay расследовать маркировки однородности для всех видов белка в ячейку (рис. 2)¹⁶. Два ключевых шагов этот assay очищение протеина и изображений. На первом шаге дневно помечены всех белков в клетках и биотинилированным, затем извлекали отдельно с помощью электрофореза геля следуют electroelution. На втором шаге флуоресценции свойства отдельных белковых молекул в извлеченной образцы оцениваются на основе изображений одной молекулы. Из этих данных, параметры, важные для подсчета анализа, такие, как процент белков помечены с по крайней мере одно краситель, который мы называем маркировки размещение (LO)¹⁶, и среднее количество флуоресцентных красителей привязаны к одной белковой молекулы (n̄ _краска), можно охарактеризовать. В протоколе оптимизированная процедура для маркировки клеток HeLa протеома краской NHS основе цианиновые 3 (Cy3) представлена в качестве примера и может быть изменен с другими маркировки процедур согласно желаемой исследовательских целей.

1. Подготовка клетки

1. Культивировать клетки HeLa в 10 см блюдо при 37 ° C под 5% CO₂ в Дульбекко модифицированная орла в среде, содержащей плода бычьим сывороточным 10%.
2. Соберите экспоненциально растущей клетки, как только они достигли 70% confluency, следуя инструкциям ATCC¹⁷.
   1. Промойте клетки с 5 мл 1 x-фосфатный буфер (PBS) (рН 7,4). Удаление PBS.
   2. Добавьте 1 мл 0,1% трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). Инкубировать 5 минут при 37 ° C.
   3. Контролировать прогрессирование диссоциации клеток при микроскопии.
   4. После того, как клетки становятся раунд и отдельно от блюдо, добавить 4 мл среднего роста и разорвать клеток агломерации, закупорить.
   5. Подсчитать количество ячеек с помощью счетчик соматических клеток.
   6. Центрифуга на 150 x g 10 мин в пластиковых пробирок. Удалите носитель и Ресуспензируйте клетки лепешка с 5 мл 1 x PBS (рН 7,4).
   7. Повторите шаг 1.2.6. Ресуспензируйте клетки в однократном ПБС (рН 7,4) до конечной концентрации 10⁶ клеток/мл с помощью граф количество на шаге 1.2.5.
      Примечание: Суспензию клеток может быть aliquoted и хранятся при температуре-80 ° C в течение нескольких месяцев. Следует избегать повторения цикла замораживания/оттаивания.

2. ячейки лизис и люминесцентные маркировки

1. Сделать 10 мл лизировать буфер (0,1 М Борат, лаурилсульфат натрия 1% (СДП) и 1% 20 анимации). Приспособиться к рН 12, используя 2 M NaOH.
   Предупреждение: Концентрации NaOH коррозионные. Надевайте защитные перчатки и очки при подготовке этого решения.
   Примечание: Лизировать буфер может храниться до одной недели при комнатной температуре.
2. Смесь 100 мкл лизировать буфер с 1 мкл 1 М Дитиотреитол (DTT) и 4 мкл 50% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (главы).
3. Смешайте 1 мкл клеточной культуры (приблизительно 1000 ячеек) с смешанные лизировать буфер из шага 2.2. Однородный раствор, медленно закупорить избежать пузырей. Инкубируйте в темноте при комнатной температуре на 5 мин с нежным агитации. Повторно однородный раствор, закупорить медленно.
4. Добавьте 1 мкл 2 мкг/мл Cy3 ГСЗ Эстер красителя. Однородный раствор, медленно закупорить избежать пузырей. Инкубируйте 5 мин в темноте при комнатной температуре с нежным агитации.
   Примечание: Высокий рН этого буфера вызывает нейтрализация остатков лизина в белках, приводит к более высокой реактивности.
5. Повторите Добавление 1 мкл 2 мкг/мл Cy3 ГСЗ Эстер красителя. Однородный раствор, медленно закупорить избежать пузырей. Проинкубируйте втечение 10 мин в темноте при комнатной температуре с нежным агитации.
   Примечание: Это повторные добавления красителя ГСЗ Эстер может увеличить маркировки энергоэффективности, потому что некоторые из красителя Cy3 ГСЗ Эстер гидролизованный и обезвредили высоким pH буфера реакции.
6. Приспособиться к рН 7,2, добавив 100 мкл 0,8 м 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES)-NaOH рН 7,2 утолить реакции. Однородный раствор, медленно закупорить избежать пузырей.
7. Добавить 20 мкл 19 мг/мл биотин-(полиэтилен гликоль (PEG))₂-Амин и 5 мкл 20 мг/мл 1-этил - 3-(3-dimethylaminopropyl) Карбодиимиды (EDC). Однородный раствор, медленно закупорить избежать пузырей. Инкубируйте 1 час в темноте при комнатной температуре с нежным агитации.
   Примечание: Этот шаг biotinylation необходимо исправить белковых молекул на Микроскоп coverslip на фиксированной плотности и с без смещения для видов белков.
8. Удаление непрореагировавшего маркировки реагентов и сконцентрировать образца с помощью столбца ультрафильтрации с 10 кДа отсечения, следуя инструкциям производителя.
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Образец может храниться при температуре-80 ° C в течение нескольких недель.

3. протеома разделения и восстановления

1. Добавьте 4 x буфер образца SDS (200 мм трис-HCl рН 6,8, 4% SDS, глицерина 4% и 0,4% бромфеноловый синий).
   Примечание: Чтобы избежать повреждения краски, образец протеина не должен нагреваться как в стандартных SDS-PAGE и должны храниться при комнатной температуре.
2. Выполнение стандартных SDS-PAGE для Образец протеина и трапом молекулярного, с использованием 20% гель акриламида. Перенести образец в гель при постоянном напряжении (160 V) до миграции фронт просто выходит из геля.
3. Изображения гель для определения местоположения белка полосы (рис. 3).
4. Вырежьте части гель, включая белковых фракций интерес, используя острый нож, основанный на местах группы. Фракционирование на 16, 23, 55 и 120 кДа вершины и на 19 – 25, 25-32, 32-42, 42 – 54, 54-69, 69-97, 97 – 136 и 136 – 226 кДа, регионы, показаны на рисунке 3.
5. Экстракт белков с помощью диализатор, electroelution с порами размером 6-8 кДа, следуя инструкциям производителя.
   Примечание: Извлеченные образец может храниться при температуре-80 ° C в течение нескольких недель.

4. Микроскоп coverslip подготовка

1. Подготовка 200 мкл буфера авидин (5 мм HEPES-NaOH pH 7.2, 10 нг/мл авидином и 2 мг/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА)) для каждого образца.
2. Подготовка coverslips 22 x 22 мм и 0,15 мм толщиной. Разоблачить coverslips воздуха с помощью плазмы чистых за 1 мин чистить и активировать их поверхности плазмы.
3. Пальто coverslips с авидин, спин покрытие 200 мкл авидин буфера с помощью спин coater 5 секунд на 500 об/мин, после чего 30 секунд при 1000 об/мин. Инкубируйте coverslips 15 мин при комнатной температуре, чтобы позволить им высохнуть.
4. Подготовка coverslips образец протеина.
   1. Разбавьте образец протеина (от 3,5) 100 раз в 5 мм HEPES-NaOH pH 7.2.
   2. Место 100 мкл разбавленного образца на поверхности в центре авидин покрытием coverslip (из шага 4.3).
   3. Инкубируйте в темноте за 15 мин при комнатной температуре.
5. Подготовьте положительный контроль.
   1. Место 100 мкл 10 нг/мл очищенной флуоресцентные биотина в 5 мм HEPES-NaOH рН 7,2 в центре авидин покрытием coverslip (из шага 4.3).
   2. Инкубируйте в темноте за 15 мин при комнатной температуре.
      Примечание: Этот положительный контроль coverslip обеспечивает плотность авидин точек привязки, который используется для вычисления LO.
6. Подготовьте отрицательного контроля.
   1. Спин пальто плазменной очистки coverslip с 200 мкл 5 мм HEPES NaOH и 2 мг/мл BSA (без авидин).
   2. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре в сухом.
   3. Добавьте 100 мкл 10 нг/мл очищенной флуоресцентные биотина в 5 мм HEPES-NaOH pH 7.2.
   4. Инкубируйте в темноте за 15 мин при комнатной температуре.
      Примечание: Этот отрицательный контроль coverslip обеспечивает количество привязки неспецифической флуоресцентный биотина для coverslip без авидин.
7. Промойте каждый coverslip с 200 мкл дистиллированной воды, дозирование по краям coverslip, чтобы не прикоснуться к середине coverslip с наконечником. Повторите это мыть три раза.
   Примечание: После аспирационных воды на coverslip, воды следует немедленно помещаться обратно на coverslip, чтобы предотвратить его от высыхания полностью.
8. Разоблачить воздуха плазмы на такое же количество coverslips как в шаге 4.2.
9. Уборка coverslip место на coverslip образца граница с шагом 4.7, чтобы избежать высыхания.

5. наблюдение с одной молекулы микроскопии флуоресцирования

1. Запустите микроскопом флуоресценции-поля или затухающих поля.
   Предупреждение: Прямые или рассеянного лазерного излучения может вызвать глаз или повреждения кожи. Носите подходящие защитные очки и щит на пути света лазера.
   Примечание: Для установки Микроскоп, пожалуйста, обратитесь к нашей предыдущей публикации¹⁶. Вкратце оснащен мощной 488 нм лазер возбуждения, высокая числовая апертура объектива и высокая чувствительность камеры микроскопа флуоресценции-поля или затухающих поле может использоваться для этого измерения. Кроме того для автоматического измерения, управляемая компьютером стадии трансляционная образца XY, механические шторки для лазерной возбуждений и автоматический пистолет фокус системы рекомендуется установить.
2. Установите coverslip на микроскопе и найти фокус.
3. Выполните проверку плитки, чтобы получить по крайней мере 100 изображений.
   Примечание: Лазер освещения должны контролироваться с механическими жалюзи подвергаются образца только тогда, когда записи изображения с камеры, чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание. Если существует множество образцов, рекомендуется автоматизированное измерение, используя компьютерную программу для управления устройствами микроскопа. Каждое изображение обычно включает в себя 100 – 500 точек одной молекулы при использовании объектива 60 x.

6. анализ и извлечение информации изображений

1. Если изображение имеет неровности благодаря лазерной подсветки шаблон, осуществляют это исправить¹⁸обработки изображений.
   1. Приобрести эталонный образ путем измерения с образцом coverslip, состоящий из равномерно распространение красители, с помощью камеры установка же шаг 5.3.
   2. Приобрести смещения изображения путем измерения с без лазерного возбуждения, используя те же настройки камеры.
   3. Вычтите значение каждого пикселя в каждый образец изображения и изображения ссылки со значением смещения изображения.
   4. Разделите значение каждого пикселя в вычитается образец изображения по значению в вычитается эталонного образа.
2. Собирать должным образом приобретенные изображения и удалить фон изображения.
   1. Удаление изображений, содержащих большие флуоресцентные агрегатов вручную.
   2. Удаление фонового изображения, применив алгоритм шар преткновения¹⁹ с шар радиусом 50 пикселей с помощью ImageJ²⁰.
   3. Резкость изображения путем вычитания размытые изображения, используя ImageJ (резкость изображения функция).
3. Найти и проанализировать одной молекулы пятна в изображениях.
   1. Определите места одной молекулы с²¹ иен алгоритм порога с помощью ImageJ.
   2. Фильтр пятна с менее чем два пикселей, чтобы исключить темные шум камеры и пятна более 20 пикселей, чтобы исключить агрегаты белков с помощью ImageJ (ROI менеджер).
   3. Подсчитать количество точек в каждом изображении. Использование освещения, исправленные изображения (шаг 6.1.4), анализа всего интенсивности пикселей для каждого пятна с помощью ImageJ.
4. Вычислите маркировки размещение (LO), с использованием следующей формулы:
   LO = (число отсчетов в выборке / число отсчетов в положительный контроль) x 100
5. Вычислите среднее количество флуоресцентных красителей, привязаны к одной белковой молекулы (n̄_краска).
   1. Проанализируйте гистограмму интенсивности каждого пятна.
      Примечание: Гистограмма обычно имеет несколько пиков, и каждый пик представляет различное количество красителя молекул, связан с белком. Первый, второй и третий пик в гистограмме соответствует 1, 2 и 3 молекулы, соответственно.
   2. Расчет средней интенсивности от гистограммы. Также вычислить пика интенсивности первый пик, применяя Гаусса фитинга.
   3. N̄_краска Рассчитайте путем деления средней интенсивности с максимальной интенсивностью.

Рисунок 4 представляет изображения raw данные для различных низкомолекулярных фракций белков от lysate клетки HeLa, а также положительной и отрицательной контроля. Хотя как положительные, так и образец протеина управления выставка 100 – 500 пятна на изображении, негативные элемент управления отображает ни одна или несколько пятен, показаны, что протокол достаточно подавляет неспецифической привязки красителей на coverslip поверхность. Пятно света гистограммы для образцы протеина и позитивного управления представляют несколько пиков, представляющие стохастических привязки красителей для первичных аминов в белках и авидин Тетрамер структур22, соответственно. Все пятна показан мигающий и ступенчатой Фотообесцвечивание с непрерывной лазерного возбуждения, подчеркнув наблюдения на уровне одной молекулы (Рисунок 5AB).

LO рассчитывается от отношение числа мест в каждый образец протеина, позитивного управления. Ло измеряется от lysate образец клеток HeLa, варьировались от 50% меньший молекулярный вес (16 kDa) фракции до 90% для выше молекулярный вес дроби (120 кДа) и составила 72% для всего протеома образца без разделения (рис. 6). Соответственно n̄красителя , как правило, с увеличением молекулярной массы. Эти тенденции повышения считаются происходят из-за более широкого числа остатков лизина, приводит к увеличению ГСЗ Эстер красителя привязки. Например 23 кДа фракция имеет высокое значение LO из-за большого количества остатков лизина в гистоновых белков, содержащихся в этой фракции.

Рисунок 1: эффект протеома маркировки однородность на белок номер подсчета. Граф количество белка во многом зависит, насколько сильно и однородно помечены белковых молекул, вместо того, чтобы число соотношение белков к красителям. Однородность может быть забит с помощью параметра назвал размещение маркировки (LO), который определяет вероятность помечены белковых молекул против всего белковых молекул. Это значение обеспечивает эффективность белка подсчета (т.е. выше Ло урожайность выше количество чисел (слева) и вице-обратно (справа)). Хотя значение LO 100% идеально, Ло из < 100% может обеспечить коэффициент затухания для оценки числа абсолютным белка. Эта цифра была изменена от Леклерк et al.16 авторских 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: процесс Assay. Во-первых coverslips () и (b) обрабатываются авидин для достижения фиксированного плотности. Во-вторых, дневно меченых образца белки биотинилированным и придает coverslip () через взаимодействие авидин биотин. Параллельно почти 100%-дневно обозначенных очищенный биотина иммобилизованных на coverslip (b). В-третьих coverslips отражаются по микроскопии флуоресцирования сингл молекула получить номер и яркость распределение пятна флуоресценции. Наконец параметр однородности, Ло, рассчитывается из соотношения пятно чисел в (), (b). Эта цифра была изменена от Леклерк et al.16 авторских 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: разделение клеток HeLa протеома образца с помощью SDS-PAGE. Дневно помечены lysate клетки биотинилированным были перенесены на двух различных гелях (20% акриламида) и белки, визуализируется с использованием геля зрителя, с 5 мин и 10 мин время экспозиции для гель 1 и гель 2, соответственно. Красные прямоугольники представляют гель регионов, которые были вырезать и извлечены. Эта цифра была изменена от Леклерк et al.16 авторских 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Одноместный молекулы изображения образцов протеома. Флуоресценции пятно изображения (слева) и гистограммы пятно света (справа), полученные из различных низкомолекулярных фракций протеома. Линейки шкалы — 10 мкм. Стрелки в положительных управления указывают различные маркировки шаг авидин. Эта цифра была изменена от Леклерк et al.16 авторских 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Фотообесцвечивание флуоресцентные пятна. (A) промежуток времени изображения флуоресцентные пятна под непрерывной лазерного возбуждения. (B) время следы интенсивностью флюоресценции в разных местах. Следы показывают, либо один или два шаг Фотообесцвечивание, в о том, что соответствующие номера красителей были соединены к протеину в месте очищенный BSA образца. Эта цифра была изменена от Леклерк et al.16 авторских 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: маркировки однородности выборок протеома. Ло (синий) и n̄краситель (темно-красный) получены из различных низкомолекулярных фракций. Данные выражаются как средний ± с.е., 98, 46, 27, 77, 44, 39, 62, 101, 65, 62, 82, 61 и 70 изображений были проанализированы для клеточных lysate, 16, 23, 55, 120, 19 – 25, 25-32, 32-42, 42 – 54, 54-69, 69-97, 97 – 136 и 136 – 226 кДа фракций , соответственно. Эта цифра была изменена от Леклерк et al.16 авторских 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы заявляют следующие конкурирующих финансовых interest(s): RIKEN подал заявку на патент на эти результаты с с.л. и ю.ц., названный как сопредседатель изобретателей.