Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Assaying Circuit Специфическое регулирование взрослых гиппокампальных нейронных клеток-предшественников

6.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59237

⸱

24 июля 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of North Carolina Chapel Hill, 2Neuroscience Center, University of North Carolina Chapel Hill, 3Neuroscience Curriculum, University of North Carolina Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

Целью данного протокола является описание подхода к анализу поведения взрослых нервных стволовых/протеже клеток в ответ на хемогенетические манипуляции определенной локальной нейронной цепи.

Аннотация

Взрослый нейрогенез – это динамический процесс, при котором вновь активированные нервные стволовые клетки (Нск) в подгранулярной зоне (СГЗ) зубной извилины (ДГ) генерируют новые нейроны, которые интегрируются в существующую нейронную цепь и способствуют специфическим функциям гиппокампа . Важно отметить, что взрослый нейрогенез очень восприимчив к экологическим стимулам, что позволяет для активности-зависимых регуляции различных когнитивных функций. Широкий спектр нейронных цепей из различных областей мозга организует эти сложные когнитивные функции. Поэтому важно понять, как конкретные нейронные цепи регулируют нейргенез взрослых. Здесь мы описываем протокол для манипулирования нейронной цепной активности с помощью дизайнера рецептора исключительно активируется дизайнер наркотиков (DREADDs) технологии, которая регулирует NSCs и новорожденных потомства у грызунов. Этот всеобъемлющий протокол включает в себя стереотаксические инъекции вирусных частиц, хемогенетическую стимуляцию конкретных нейронных цепей, аналоговое администрирование тимидина, обработку тканей, маркировку иммунофлюоресценции, конфокальную визуализацию и визуализацию анализ различных стадий нейронных клеток-предшественников. Этот протокол содержит подробные инструкции по методам поиска антигена, используемым для визуализации NSCs и их потомства и описывает простой, но эффективный способ модулировать мозговые цепи с помощью клозапина N-оксида (CNO) или CNO-содержащей питьевой воды и DREADDs-выражающие вирусы. Сила этого протокола заключается в его адаптивности для изучения широкого спектра нейронных цепей, которые влияют на взрослых нейрогенеза, полученные из NSCs.

Введение

Взрослый нейрогенез является биологическим процессом, с помощью которого новые нейроны рождаются во взрослом возрасте и интегрированы в существующие нейронные сети1. У людей этот процесс происходит в зубной извилине (DG) гиппокампа, где около 1400 новых клеток рождаются каждый день2. Эти клетки находятся во внутренней части ГД, которая таит в себе нейрогенную нишу, именуемую субгралярной зоной (СГЗ). Здесь гиппокампа взрослых нервных стволовых клеток (NSCs) проходят сложный процесс развития, чтобы стать полностью функциональными нейронами, которые способствуют регуляции конкретных функций мозга, в том числе обучения и памяти, регулирование настроения, и стресс ответ3 ,4,5,6. Чтобы влиять на поведение, взрослые НСК строго регулируются различными внешними стимулами в деятельности, зависимой от этого, реагируя на массив местных и дистальных химических сигналов. Эти химические сигналы включают нейротрансмиттеров и нейромодуляторов и действовать в цепи определенным образом из различных областей мозга. Важно отметить, что широкая конвергенция этих химических сигналов на НСК позволяет проводить уникальную и точную регуляцию активации стволовых клеток, дифференциацию и судьбу решений.

Одним из наиболее эффективных способов допроса регулирования схем взрослых NSCs in vivo является сопряжение иммунофлуоресценции анализа с цепью широкие манипуляции. Иммунофлуоресценция анализ взрослых НСК является широко используемым методом, где антитела против конкретных молекулярных маркеров используются для обозначения стадии развития взрослых НСК. Эти маркеры включают в себя: nestin как клетка радиальной глии и ранний нейронный маркер прародителя, Tbr2 как промежуточный маркер прародителя, и dcx как нейробласт и незрелый маркер нейронов7. Кроме того, путем введения тимидина аналогов, таких как BrdU, CidU, Idu, и Edu, популяции клеток, проходящие фазу S могут быть индивидуально помечены и визуализированы8,9,10. Объединив эти два подхода, широкий спектр вопросов может быть исследован, начиная от того, как распространение регулируется на конкретных стадиях развития, как различные сигналы влияют на дифференциацию НСК и нейрогенез.

Существует несколько вариантов эффективного управления нейронными схемами, включая электрическую стимуляцию, оптогенетику и хемогенетику, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Электрическая стимуляция включает в себя обширную операцию, где электроды имплантируются в конкретную область мозга, которые позже используются для передачи электрических сигналов для модулирования целевой области мозга. Однако, этот подход не хватает как клеточной и цепи специфики. Оптогенетика включает в себя доставку вирусных частиц, которые кодируют свет активированный рецептор, который стимулируется лазером, испускаемым через имплантированное оптическое волокно, но требует обширных манипуляций, больших затрат и сложных операций11. Хемогенетика включает в себя доставку вирусных частиц, которые кодируют дизайнерский рецептор, исключительно активированный дизайнерскими препаратами или DREADDs, которые впоследствии активируются специфическим и биологически инертным лигандом, известным как клозапин N-оксид (CNO)12 . Преимущество использования DREADDs для манипулирования локальными нейронными схемами, которые регулируют взрослые НСК, заключается в легкости и различных маршрутах управления CNO. Это позволяет менее трудоемкий подход с сокращением обработки животных, который легко адаптируется для долгосрочных исследований, чтобы модулировать нейронных цепей.

Подход, описанный в этом протоколе, представляет собой всеобъемлющий набор различных протоколов, необходимых для успешного допроса схемы регулирования взрослых гиппокампа нейрогенеза, который сочетает в себе как методы иммунофлюоресценции и схемы манипуляций с помощью хемогенетики. Метод, описанный в следующем протоколе, подходит для стимулирования или ингибирования одной или нескольких цепей одновременно in vivo, чтобы определить их регулирующую функцию на взрослых нейрогенеза. Этот подход лучше всего использовать, если вопрос не нуждается в высокой степени временного разрешения. Вопросы, требующие точного временного контроля стимуляции / ингибирования на определенной частоте, могут быть лучше решены с помощью оптогенетики13,14. Описанный здесь подход легко адаптируется для долгосрочных исследований с минимальным обращением с животными, особенно в тех случаях, когда стресс является серьезной проблемой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, включая животных субъектов были одобрены институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC) в Университете Северной Каролины Чапел-Хилл.

1. Стереотаксическая инъекция вирусных частиц

  1. Определите нейронные цепи, о котором идет речь. Это определит вирус и линию мыши, используемую для следующей процедуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, контралатеральные мхомклетки проекции стимулируются для анализа его воздействия на взрослых нейрогенеза. Вирусные частицы, кодируя AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry поставляются в DG 5ht2A-Cre мышей15.
  2. Администрирование мелоксикама (5 мг/кг, подкожно) по крайней мере 30 мин предварительно оперативно, чтобы обеспечить упреждающий анальгезии 8-недельного мужчины heterozygous 5ht2A-Cre мыши.
  3. Анестезия мыши с помощью 4% изофруран кислородной смеси, пока его дыхание замедляется и мышь без сознания с помощью изофрурановой камеры. Toe ущипнуть мышь, чтобы убедиться, что он не реагирует.
  4. Поместите мышь в стереотаксис на небольшой косяк для нагрева ния для тепловой регуляции и нанесите смазку для глаз к каждому глазу. Уменьшите изолюран до 1,5%, как только животное находится внутри стереотаксиса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение ухо бар на этом этапе имеет важное значение. Убедитесь, что голова находится на уровне после размещения ушной прыжек. Более подробные инструкции можно найти в Гейгер и др.16.
  5. Поместите продукт удаления волос на голову и дайте ему сидеть до 1 мин максимум. Удалите волосы, вытирая голову этанол салфетки. Если волосы не полностью удалены, повторите этот процесс, пока верхняя часть головы не будет волосатой.
  6. Дезинфицировать лысую область с повидон-йодраствор омейд решение по крайней мере 3 раза.
  7. Поместите актуальный раствор лидокаина на лысую кожу головы и ждите 1 мин. Снимите актуальный лидокаин с головы и сделайте небольшой разрез на голове от начала глаза до начала ушей около 2 мм с помощью хирургического скальпеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Toe щепотку мыши, чтобы убедиться, что она полностью успокоительное, прежде чем делать какие-либо разрезы.
  8. Уречку кожи головы и очистить соединительную ткань на верхней части головы с помощью стерилизованных ватных тампонов, пока bregma легко идентифицировать.
  9. Найдите bregma и отрегулируйте головку так, чтобы bregma и lambda оба на одной плоскости путем устанавливать сверло на обоих координатах и уверяя они выравнивают. Кроме того, выровнять левое и правое полушарие, поместив сверло влево / вправо области между bregma и lambda.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг очень важен; неправильно выровненое размещение головы нарушит стереотаксические координаты.
  10. Просверлите следующие координаты брегмы с помощью 0,5-мм сверла бит: передняя задняя ось (AP) -2,00 мм, медиальная боковая ось (ML) 1,50 мм. Сделайте отверстие для бурения диаметром от 0,5 мм до 1 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измените этот шаг с координатами, специфичными для рассматриваемой схемы. Этот пример нацелен на одностороннюю зубную извилинку, содержащую мшистые клетки, и определяет их влияние на взрослые нервные стволовые клетки на контралатеральной стороне.
  11. Переключите сверло на шприц 5 л и на иглу 26-33 G. Ноль в брегме, а затем вводят в следующих координатах, поместив иглу в отверстие для сверления на передней задней оси -2,00 мм, медиальной боковой оси -1,50 мм, рзавской вентральной оси -2,3 мм.
  12. Налейте 500 nL адено-ассоциированного вируса (AAV) из вирусного ядра или коммерческого источника в соответствующее полушарие, при 50-100 нл/мин с помощью инфузионного насоса (Таблица материалов). Подождите, по крайней мере 5 минут после инъекции, прежде чем медленно удалить иглу из мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти координаты могут потребовать корректировки в зависимости от возраста и размера мыши. Некоторые вирусные серотипы имеют различные модели диффузии, лучше всего выполнять экспериментальные эксперименты для тестирования вирусного распространения до полного эксперимента.
  13. Очистите кожу головы и кожу вокруг разреза с помощью физраствора, затем уплотнение разреза с помощью клейки ткани (Таблица материалов) при проведении кожи вместе с пинцетом. Выполняйте все послеоперационные процедуры, такие как наблюдение во время восстановления на грелке до тех пор, пока мышь не активится, нанесение анальгетика на рану и введение обезболивающих в течение двух дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многие эксперименты требуют 2-4 недели ожидания времени после вирусного вливания для надлежащего вирусного выражения.

2. Клозапин N-оксид администрации

  1. Подготовьте стоковый раствор CNO путем растворения 10 мг CNO в 100 л диметилсулькоксида (DMSO) и вихря.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если раствор не растворяется полностью, увеличьте объем ДМСО, но слишком много DMSO может сделать воду горькой. Не превышать 0,1% DMSO в водном растворе CNO или более 200 л DMSO для раствора 200 мл. Стоюсc CNO может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение двух недель.
  2. Добавьте 10-50 л 10 мг/100 л CNO штепсила раствор омование воды для конечной концентрации 1'5 мг/200 мл. Приготовьте водную смесь CNO свежие каждый день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые группы дополнили до 1% сахарина в воде, чтобы замаскировать горечь, если мыши воздерживаются от питья. Исследованная схема показала иную реакцию, основанную на степени активации. В целом, 1 мг CNO/200 мл достаточно, чтобы стимулировать большинство схем17.
  3. Поместите раствор CNO в фольгу, покрытый или защищенный от света, при введении мышам через две недели после восстановления после стереотаксической инъекции с шага 1.13 в течение 4 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CNO светочувствительный; уменьшить воздействие света в течение всего процесса.
  4. Измеряйте и записывайте потребляемый водяной раствор CNO каждый день при подготовке свежего раствора CNO. В среднем, взрослая мышь потребляет около 4 мл смеси воды CNO. Кроме того, запись веса мыши ежедневно, чтобы убедиться, что они пьют.
  5. Убедитесь, что для каждого эксперимента используются надлежащие элементы управления. Включите как CNO, так и DREADD-контроль. Примером экспериментальной установки будет включать в себя: (1) автомобиль - автономный автомобиль-амфибия (AAV) с вирусным репортером не DREADD, (2) CNO и AAV с вирусным репортером не DREADD, и (3) CNO и AAV DREADD.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все группы включают DMSO в решение. Контроль DMSO не включен, потому что животные получают менее 0,1% DMSO, который не был показан, чтобы иметь неблагоприятное воздействие на взрослых нервных стволовых клеток у мышей. Если есть опасения относительно использования DMSO в питьевой воде, добавьте дополнительный не DMSO и солевой контроль.

3. Тимидин Аналоговая маркировка

  1. В день сбора тканей, через 4 дня после введения CNO, этикетка размножающихся клеток, выполняя серию тимидина аналога, 5-этинил-2'-deoxyuridine (Edu) интраперитонеальных инъекций.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Этот протокол использует Edu. Тем не менее, Есть несколько аналогов тимидина, которые могут эффективно этикетки размножающихся популяций клеток, включая Brdu, Idu, и Cidu8.
    1. Взвесить Edu и растворить в ветеринарном классе 0,9% раствора инъекции хлорида натрия при 4 мг/мл путем вихря и размещения на роторе в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тимидин аналоги токсичны и светочувствительны. Следите за листами данных о безопасности материалов (MSDS) при обработке и крышке решения от воздействия света с использованием алюминиевой фольги.
    2. Вводя Edu интраперитоневически при 40 мг/кг или 0,1 мл/10 г массы тела 4 мг/мл Эду 4 раза каждые 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дозы выше 50 мг/кг достигают около уровня насыщения и не увеличивают количество помеченных размножающихся клеток значительно18. Очень важно, чтобы все мыши получают одинаковое количество инъекций Эду, так как неправильная маркировка может исказить результаты.

4. Подготовка и обработка тканей

  1. Через два часа после последней инъекции Edu, анестезирует мышь с помощью изофрурановой камеры, пока дыхание значительно снижается и ног щепотку, чтобы убедиться, что она полностью успокоительное.
  2. Защищайте мышь на поверхность с помощью игл и сделайте небольшой разрез, обнажающий сердце. Вставьте 25 G иглу левой аорты и вырежьте правый желудочек для перфузии транскардиала с помощью раствора фосфатного солевого раствора (PBS) со скоростью потока 1,4 м/мин до тех пор, пока ткань печени не будет очищена.
  3. Переключите перфузийный раствор на 4% параформальдегид (PFA) и надоете около 15-20 мл, чтобы исправить ткани мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробные инструкции по процессу перфузии можно найти в Gage et al.19. Подземные толчки животных будут наблюдаться, когда сделано правильно.
  4. Удалите голову с помощью больших ножниц, а затем выполнить ряд осторожных разрезов, чтобы освободить мозг от черепа. Храните ткани мозга при 4 градусах По области при 4% ПФА на ночь, чтобы продолжить фиксацию.
  5. Удалить ткани мозга из 4% PFA раствор и поместить в 10% сахарозы раствор в PBS криопротектора ткани в течение 24 ч при 4 C. Затем перенесите ткань в 30% раствор сахарозы PBS еще на 24 ч при 4 градусах Цельсия перед секцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг ткани будет тонуть в сахарозе, когда готовы для микротома секции. Ткань мозга может храниться в долгосрочной перспективе в 30% сахарозы.
  6. Секция мозговой ткани коронально в 40 мкм разделов с помощью микротома. Соберите секции, начинающиеся в начале зубной извилины, около -1,20 мм от брегмы, и заканчивая пластиной, в комплекте с первым разделом, наиболее передней и последней секции является наиболее задней. Обратитесь к атласу мозга мыши, чтобы точно определить DG и начальные координаты сбора тканей.
  7. Последовательно хранить каждый раздел в ряды 6 в 48 хорошо пластины заполнены антифриз решение (Таблица 1).
Решение для борьбы с антифризомЭтилен-гликоль 150 мл сахароза 150 г, заливка до 500 мл 0,1 МБ на 500 мл раствора
Цитрат Буфер9 мл лимонной кислоты запаса 41 мл трехнатриевого цитрата буфера 450 мл ddH2O
Кусок цитровой кислоты0,1 М Кислота 21 г/1 L ddH2O
Три натрия цитрат запасов0,1 М Три натрия цитрат 29,4 г/1 L ddH2O
Трис Бафферед Солин-Тритон (TBS-Тритон)0.05% 100-x Тритон в TBS
Пермякибационный буфер0.5% 100-x Тритон в TBS
Блокирование буфера0.33 мл осла сыворотки в 10 мл TBS-Тритон
Edu Реакция РешениеСделайте решение CuSO4х5H2O, добавив 1 мг CuSO4Х5H2O в растворе 4 мл в размере 0,1 Мз РН 8,5. Затем добавьте 1:40 раствора Alexa488-azide 600 мкм и 10 мг/мл L-Naи аскорбата в раствор CuSO4х5H2O перед нанесением на ткани.

Таблица 1: Решения, используемые для иммуногистохимии.

5. Иммуногистохимия

  1. Базовый плавающий протокол
    ПРИМЕЧАНИЕ: При окрашивании гнездина пропустите раздел 5.1 и перейдите в раздел 5.2. Основной плавающий протокол для Tbr2 или doublecortin (DCX) только без тимидина аналогового edu окрашивания.
    1. Передача секций от раствора антифриза к раствору Tris-buffered saline (TBS) в серийном порядке в 48 скважинной пластине.
    2. Вымойте разделы дважды в TBS-тритон (0,05% TBS-тритон, таблица 1) в течение 5 минут, аспирируя решение каждый раз во время тряски или на рокер на низких скоростях.
    3. Пермяки разделы с использованием буфера пермяки (0,5% TBS-тритон, таблица 1) для 20'30 мин при встряхивании на низких скоростях.
    4. Сделайте блокирующий буфер, добавив 0,33 л сыворотки осла до 10 мл TBS-тритона. Сделать свежее и использовать в течение 3 дней.
    5. Аспирный буфер permeabilization и инкубировать разделы в блокируя буфере на 30 мин до 1 ч при комнатной температуре (RT).
    6. Сделать первичное решение антитела в блокировании буфера и добавить к каждому хорошо. 500 л/ну достаточно для того, чтобы все участки ткани были полностью погружены в воду. Инкубировать ночь на RT на рокер или шейкер.
    7. Аспирный раствор и промыть секции в TBS-тритон 3x в течение 10 минут каждый, чтобы удалить следы первичных антител.
    8. Инкубировать в фторфоре спрягать вторичные антитела против первичных антител, подготовленных в блокировании буферного раствора в течение 2 ч на RT на рокер.
    9. Вымойте разделы 3x для 5 мин каждый в TBS-тритон, а затем инкубировать разделы в 4 ",6-диамидино-2-фенилиндинол (DAPI) раствор (300 мкм раствор в 1:100) разбавленного в PBS в течение 15 мин.
    10. Вымойте разделы 3x в PBS и смонтировать секции поддержания последовательного порядка от передней до задней на положительно заряженном слайде. Пусть ткани высохнут на RT, пока влага заметно исчезли, как правило, около 2'5 мин, прежде чем coverslipping с монтажом средств массовой информации.
  2. Извлечение антигена
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел требуется только для nestin. Если окрашивание гнездина, выполните этот раздел до тимидина аналогового окрашивания (раздел 5.3). Перейти на Tbr2 или DCX окрашивания с Edu.
    1. Поместите секции тканей в PBS и установите 5-8 секций на положительно заряженном слайде, поддерживающем серийный порядок от передней до задней. Пусть секции тканей высохнут на RT, чтобы полностью придерживаться слайдов, что занимает около 2-5 мин. Ткань должна быть заметно отсутствует влаги.
    2. Подготовка цитрат буфера (Таблица 1) в контейнере, как правило, 1000 л пипетки отзыв поле.
    3. Нагрейте буфер цитрата в микроволновой печи (1000 Вт) в течение 5 мин до кипения раствора. В то время как решение нагревается, поместите установленные секции в 20-слайдное стеклянное держатель слайда. После 5 минут, осторожно поместите держатель слайда с разделами в коробку пипетки.
    4. Установите микроволновую печь мощность юаней до 50% и варить время в течение 7 мин. Запустите таймер в течение 7 минут и смотреть микроволновой печи. В течение этих 7 минут, остановить микроволновую печь, когда раствор начинает кипеть и продолжить микроволновую печь после кипения останавливается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага состоит в том, чтобы держать температуру воды прямо под температурой кипения в течение 7 мин. Остановка после таймер иссякнут, даже если время приготовления на микроволновой печи не закончилось. Более подробные инструкции можно найти в Hussaini и др.20.
    5. Выньте теплую коробку с цитратом буфера и ткани слайды и поместите его в ведро со льдом, чтобы охладить. Обложка, чтобы предотвратить попадание льда или других материалов в раствор. Подождите около 30 минут или до тех пор, пока решение прохладно на ощупь.
    6. Приступить к тимидин аналоговый этап окрашивания 5.3.2 при использовании аналога тимидина.
  3. Тимидин аналоговое окрашивание
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начните здесь, если окрашивание Edu и Tbr2 или Edu и DCX.
    1. Поместите секции тканей в PBS и установите 5-8 секций на положительно заряженном слайде, поддерживающем серийный порядок от передней до задней и той же ориентации. Пусть ткани разделы высохнуть, чтобы полностью придерживаться слайдов, а затем нарисовать границу с помощью гидрофобной ручкой или PAP перо.
    2. Пермяки с буфером пермяки (0,5% TBS-triton) на 20–30 мин. Затем мыть разделы 2x с помощью TBS-тритон в течение 5 минут каждый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пермябилизация способствует проникновению внутриклеточного антитела. Время пермяки может быть скорректировано в зависимости от толщины ткани и эффективности антител. Кроме того, можно увеличить концентрацию моющего средства для увеличения пермяки потенции. Тем не менее, следует позаботиться, чтобы не пронизать слишком долго, так как хрупкость тканей увеличивается с длительным временем permeabilization.
    3. Подготовка решения реакции Edu в соответствии с таблицей 1. Окончательная концентрация Alexa488-azide составляет 15 мкм в 1 мл реакционного раствора Edu.
    4. Инкубировать разделы в растворе реакции Edu в течение 30 мин до 1 ч, а затем мыть 3x в TBS-тритон в течение 5 мин каждый. Обложка слайды в алюминиевой фольге, чтобы защитить от света после этого шага. На этом этапе проверить, если реакция Edu работает с помощью флуоресцентного микроскопа. Эду помеченные клетки будут флуоресцировать под эпифлюоресцентным микроскопом.
  4. Протокол секции коней
    1. Блок ткани разделы установлены на слайде от шага 5.3.4 с помощью блокирующего буфера, поднятые в тех же животных, как вторичное антитело, например, осла сыворотки, в течение 30 мин до 1 ч, а затем мыть 2x в TBS-тритон в течение 5 минут каждый.
    2. Подготовка первичного антитела (т.е. курица анти-нестхин) раствор во время блокирования шаг путем смешивания первичных антител в блокировании буферного раствора в 1:200. 250 л на слайд достаточно, чтобы гарантировать, что ткань полностью погружена в раствор.
    3. Инкубировать участки тканей в первичном растворе антитела в одночасье на RT после блокирования смещения. Измените этот шаг в зависимости от используемого первичного антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если антитела имеют высокий фон или неспецифические связывания, инкубации при 4 градусах цельсия вместо RT могут улучшить результаты. Антитела с плохим проникновением тканей можно оставить для инкубации в течение 2 дней, если это необходимо.
    4. Инкубировать ткани разделов 3x в TBS-тритон в течение 5 минут, чтобы удалить избыток первичных антител. Затем инкубировать секции тканей в фторфоре конъюгированных вторичных антител (т.е. Alexa 647 анти-курица в 1:200), подготовленных в блокирующем буферном растворе для 2 ч на RT.
    5. Инкубировать ткани разделов 3x в TBS-тритон в течение 5 минут, чтобы удалить избыток вторичных антител и применять 300 мкм DAPI раствор в 1:100 в PBS в течение 15 мин на RT.
    6. Инкубировать ткани разделов 3x в PBS в течение 5 минут, чтобы удалить избыток DAPI и удалить круг пап пера вокруг ткани с помощью ватного тампона или деликатной задачи протрите. Пусть разделы высохнуть, а затем применить монтаж амносов и покрытия скольжения. Пусть монтаж носителя сухой до изображения слайдов.

6. Коллекция изображений

  1. Слепые экспериментальные группы из контрольных групп, покрывая слайд-метки и изображение той же стороне DG с помощью конфокального микроскопа(Таблица материалов) с 40x маслом увеличения оптического объектива на 1 мкм размер шага или 20x 2x зум на 1 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение масла 40x даст увеличенное разрешение но примет более длиной чем зум 20x 2x.
  2. Установите объектив объективного объектива в 40x, а затем нажмите на вкладку найти в верхнем левом углу в confocal программного обеспечения (Таблицаматериалов) и установить желаемый раздел DG в середине поля зрения.
  3. Найдите DG, переключитесь на вкладку приобретения в верхнем левом углу, и проверьте следующие коробки: й-стек, плитка-сканирование, и положение.
  4. Установите настройки канала между приростом от 600 до 750, интенсивностью лазера от 1%до 15% и смещением от 1до 100. Не превышать 20% интенсивности лазера для любого из каналов. Убедитесь, что при настройке прироста и интенсивности пикселей пиксели не перенасыщены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти диапазоны будут варьироваться в зависимости от эффективности оборудования, использованного и эффективности окрашивания.
  5. Установите плитки до 7 горизонтальных на 3 вертикальных в окне сканирования плитки и нажмите сканирование обзор изображения с использованием тех же параметров, как те, которые в настоящее время используются. Например, используйте 7 горизонтальных по 3 вертикальные и 20x цель с 2x зум.
  6. Убедитесь, что DG полностью находится в пределах ожидаемого изображения после сканирования обзора. Если нет, отрегулируйте представление DG до тех пор пока оно полностью не в изображении обзора в виду того что это репрезентивное изображение которое одно будет получать.
  7. Установите глубину изображения, прокручивая различные стеки с помощью тонкой ручки фокусировки. Убедитесь, что весь DG находится в пределах начальной и конечных точек. Предполагая размер шага 1 мкм, каждое изображение должно быть примерно 40 шагов.
  8. Установите скорость сканирования до 9 с двунаправленным сканированием и не усреднение в окне режима приобретения. Затем добавьте положение в окне положения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаги 6.3'6.8 для изображения нескольких DG одновременно. Увеличение скорости сканирования снижает качество изображения, но сокращает общее время изображения. Если качество изображения слишком низкое, уменьшите скорость сканирования или увеличьте усреднение.
  9. Нажмите кнопку запуска эксперимента, когда это будет готово. Сканирование 5 разделов DG на мышь вдоль передней части задней оси. Например, если левая DG изображена для раздела 1, изображение следующего наиболее заднего слева DG для раздела 2.
  10. Сшивайте отдельные изображения вместе, чтобы сформировать полное изображение зубной извилины с помощью функции стежка под вкладкой процесса в конфокальном программном обеспечении. Кроме того, используйте FIJI (ImageJ), чтобы сшить изображения вместе, чтобы сформировать полную зубную извилине.
  11. Сохранить сшитые изображения для количественной оценки.

7. Анализ изображений

  1. Откройте каждое изображение каждого раздела зубной извилины, используя FIJI как максимальную проекцию и как композитное изображение с каналами, слитыми в различные цвета, чтобы легко визуализировать колокализацию.
  2. Измерьте область DG для каждого раздела максимального проекционного изображения с помощью инструмента выбора полигона (третья коробка слева) и запишите для каждого раздела каждой мыши. Это будет область ГД, используемая для расчета плотности.
  3. Запись количества клеток в DG из композитного изображения, которые coлокализации первичных антител (т.е. nestin) и тимидин аналог Edu, с помощью счетчика плагина FIJI ячейки найти под плагинами проанализировать счетчик ячеек и счетчик клеток. Кроме того, запишите общее количество положительных и гнездовых положительных клеток с радиальным процессом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае с гнездом очень важно обратить внимание на морфологию. Если количественно нервных стволовых клеток, убедитесь, что только клетки с радиальным процессом количественно. При количественной оценке зубных секций извилины, применять те же критерии для всех, особенно при визуализации клеток за пределами фокусной плоскости. Если клетки не находятся в фокусной плоскости, не подсчитывайте их. Более подробные инструкции по стериологической количественной оценке у западных и др.21.
  4. Введите количество ячеек в программном обеспечении электронной таблицы для компиляции всех фрагментов данных для анализа позже.
  5. Рассчитайте плотность colocalized клеток для каждого раздела, разделив общее количество colocalized клеток на общий объем для каждого раздела в каждом животном. Например, получить плотность стволовых клеток путем деления суммы клеток nestin/edu в одном животном на сумму объема DG в одном животном. Рассчитайте объем каждого раздела, умножая область общими шагом приращения, предполагая, что каждый шаг составляет 1 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, общее количество шагов должно быть близко к 40, так как ткань разделена на 40 мкм. Убедитесь, что каждое животное является точкой данных, поскольку цель этого подхода заключается в оценке общего количества colocalized клеток в одном полушарии гиппокампа.
  6. Выполните дополнительные необходимые расчеты для вопроса, который один пытается решить. В этом примере вычислите общее количество размножающихся клеток, общую популяцию стволовых клеток и процент ы пролиферации стволовых клеток после стимуляции контралатеральных мшистых клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После экспериментальных процедур, описанных выше(Рисунок 1A,B), мы смогли определить эффекты стимулирования контралатеральных мшистых клеток проекции на нейрогенной нише в гиппокампе. Используя Cre-зависимый Gq-coupled стимулирующий вирус DREADD в паре с мшистой клеточной маркировкой 5-HT2A Cre-line, мы смогли выборочно активировать возбуждающие проекции из мшистых клеток на контралатеральный DG и определили, что сильные мшистые клетки стимуляция способствовала quiescence ст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Цель этого протокола заключается в оценке того, как манипулирование конкретными нейронными схемами регулирует гиппокампа нейрогенеза в виво с помощью ряда методов иммуногистохимии. Анализ активности зависимой регуляции взрослого нейрогенеза, опосредоченного конкретными нейронными схемами, является ценным методом с большим потенциалом для модификаций для изучения широкого спектра нейронных цепей. Успех этих типов экспериментов зависит от нескольких факторов, включая точную вирусную доставку, правильный вирусный отбор для ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Л.Д.З. была поддержана Национальным институтом психического здоровья Национальных институтов здравоохранения в соответствии с дополнением к разнообразию R01MH111773, а также грантом T32 на обучение T32NS007431-20. Этот проект был поддержан из грантов, присужденных J.S. от NIH (MH111773, AG058160 и NS104530).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24 Луночная пластинаThermo Fisher Scientific07-200-84
48 Луночная пластинаDenville ScientificT1049
5-этинил-2'-дезоксиуридин (Edu)КарбосинтNE08701
спирт 70% изопропилThermo Fisher Scientific64-17-5
Спиртовые прокладкиThermo Fisher Scientific13-680-63
Alexa-488 AzideThermo Fisher ScientificA10266
Anti-Chicken NestinAvesNES; RRID: AB_2314882
Anti-Goat DCXSanta CruzCat# SC_8066; RRID: AB_2088494
Anti-Mouse Tbr2Thermo Fisher Scientific14-4875-82; RRID: AB_11042577
раствор бетадина (повидон-йод)Запас амазонской
цитировой кислоты [.1M] Лимонная кислота (21 г/л лимонной кислоты)Sigma-Aldrich251275
клозапин N-оксидSigma-AldrichC08352-5MG
Конфокальное программное обеспечение (Zen Black)Zeiss MicroscopyZen 2.3 SP1 FP1 (черный)
Сульфат меди (II) ПентагидратThermo Fisher ScientificAC197722500
ватные палочкиAmazon
CoverslipDenville ScientificM1100-02
Деликатная салфетка для задач KimwipesKimtech Science7557
Сверло 0,5 ммИнструменты для тонкой науки19007-05
этиленгликольThermo Fisher ScientificE178-1
Игла Гамильтона 2 дюймаHmailton Company7803-05
Шприц Гамильтона 5 μ L Модель 75 RNHmailtonКомпания Ref: 87931
Высокоскоростная дрельForedom1474
Инфузионный насосГарвардский аппарат70-4511
Инъекционный физиологический растворMountainside Health CareNDC 0409-4888-20
Инсулиновый шприцBD Ультратонкие инсулиновые шприцы
ИзофлуранГенри Schein29405
Stereotax для мелких животныхKOPF InstrumentsМодель 942
Leica M80Leica
Leica MicrotomeLeicaSM2010 R
LSM 780Zeiss Microscopy
Nair (средство для удаления волос)Nair
параформальдагид 4%Sigma-Aldrich
Plus заряженный предметный стекDenville ScientificM1021
фосфатный буферный раствор (PBS)Thermo Fisher Scientific10010031
Puralube Vet OmatmentPuralube
Slide Rack 20 предметный блокЭлектронная микроскопияНаука 70312-24
Держатель для слайдовЭлектронная микроскопия Наука70312-25
Грелка для мелких животныхK& H
СахарозаSigma-AldrichS0389
Super PAP Pen 4 мм наконечникPolySciences24230
Хирургический скальпельMedPride47121
Трис Буферный раствор (TBS)Sigma-AldrichT5912
Три-натрия цитрат сток [0,1 M] Три-натрия цитрат (29,4 г/л три-натрия цитрат)Sigma-AldrichC8532
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
ПинцетAmazon
Vet Bond Клей для тканей3M1469SB
158127

Ссылки

  1. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
  2. Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
  3. Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
  4. Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
  5. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
  6. Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1(2018).
  7. Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
  8. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
  9. Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
  10. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
  11. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  12. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  13. Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
  16. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
  17. Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  18. Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
  19. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
  20. Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
  21. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
  22. Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
  23. Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
  24. Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Нейрогенез во взрослом возрастенейральные стволовые клеткитехнология DREADDстереотаксическая инъекцияхемогенетическая стимуляцияаналог тимидинаиммунофлуоресцентное мечениеконфокальная микроскопиядемаскировка антигеновмоховидные клетки
Assaying Circuit Специфическое регулирование взрослых гиппокампальных нейронных клеток-предшественников
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.