Целевые epigenome ДНК, редактирования представляет собой мощный терапевтический подход. Этот протокол описывает производства, очищения и концентрации все-в-одном лентивирусные векторы, укрывательство трансген ТРИФОСФАТЫ dCas9-DNMT3A для epigenome редактирование приложений в человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC)-производных нейронов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Лентивирусные вектор платформа для эффективной доставки Epigenome-инструменты для редактирования в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток болезни моделей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Использование производных hiPSC клеток представляет собой ценный подход к изучению человека нейродегенеративных заболеваний. Здесь мы описываем оптимизированный протокол для дифференциации hiPSCs, производного от пациента с постулатов Локус гена (SNCA) альфа synuclein в болезнь Паркинсона (PD)-отношение дофаминергической нейрональных популяций. Накопление доказательств показывает, что высокий уровень SNCA каузативных для развития PD. Признавая неудовлетворенных необходимо создать новые терапевтические подходы для PD, особенно направленными на регуляцию экспрессии SNCA , мы недавно разработанных ТРИФОСФАТЫ/dCas9-ДНК Метилировани-на базе системы эпигеномно модулировать транскрипции SNCA , обогащая уровень метилирования в регионе нормативных Интрон 1 SNCA . Чтобы доставить система, состоящая из мертвых (отключен) версия Cas9 (dCas9) сливается с каталитического домен 3A фермента ДНК метилтрансфераза (DNMT3A), используется лентивирусные вектор. Эта система применяется к ячейкам с постулатов Локус SNCA и уменьшает SNCA-мРНК и уровни белка, около 30% через целевые метилирования Интрон SNCA 1. Доработаны Даунрегуляция SNCA уровней спасает сотовой фенотипов, связанных с болезнью. В текущем протоколе мы стремимся описать пошаговую процедуру для дифференциации hiPSCs в нейронных прогениторных клеток (НПС) и создание и проверка пиросеквенирования анализов для оценки профиля метилирования в SNCA Интрон 1. Более подробно изложить человека ТРИФОСФАТЫ/dCas9 система, используемая в этих экспериментах, этот протокол описывает, как производить, очищают и сконцентрировать лентивирусные векторы и подчеркнуть их пригодности для epigenome - и -изменения генома приложений, использующих hiPSCs и НПС. Протокол может быть легко адаптирована и могут быть использованы для производства высокого титра lentiviruses для приложений в vitro и in vivo.
Введение
Epigenome редактирования платформ недавно была разработана для любых последовательностей ДНК в регионах, которые контролируют ген выражение1,2. Созданные инструменты редактирования epigenome предназначены для (i) регулируют транскрипцию, (ii) изменять Посттрансляционная гистона модификации, (iii) изменения метилирования и (iv) модулировать регуляторные элементы взаимодействия. Подход к якорь транскрипция/хроматина модификаторы списанного (мертвый) Cas9 (dCas9) поднял из ранее развитых epigenome редактирования платформ, таких как цинк палец белки (ZFPs) и транскрипции активатор как эффекторов (сказки), укрывате....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. системы проектирования и производства вирус
- Плазмиды проектирование и строительство
Примечание: Строительство вектор LV-gRNA-dCas9-DNMT3A все-в-одном осуществляется с помощью производства- и оптимизированный выражение выражение кассеты, опубликованные Ортинский et al.30. Вектор кассеты носит повторение признание сайта транскрипционный фактор Sp1 и удаления состояние искусства в непереведенные (U3') региона терминал 3'-Лонг повторить30,(LTR) (рисунок 2A)36. Было установлено, что вектор позвоночника эффективно....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Проверка производства титры LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro векторов, по сравнению с коллегой GFP наивно
Мы исполняли p24gag ELISA для сравнения между физической титры LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro с коллегами GFP/Puro наивными. Представитель результаты, представленные в Рисунок 5A, продемонстрировать, что физическая урожайности векторов, создается с использованием протокола здесь го.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
LVs начали появляться как транспортное средство выбора для редактирования epigenome, особенно в контексте генетических заболеваний, главным образом из-за их способности (i) размещения больших нагрузок ДНК и (ii) эффективно передают широкий спектр деления и nondividing клетки. Крупногабаритная тара эффективность LVs особенно полезно для приложений, связанных с упаковки ТРИФОСФАТЫ/dCas9 систем, которые являются негабаритных. С этой точки зрения LVs представляют собой платформы оф выбор для доставки все-в-одном ТРИФОСФАТЫ/C.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Университет Дьюка подал предварительной патентной заявки, связанные с настоящим исследованием.
Благодарности
Эта работа частично финансируется Кан нейротехнология развития премию (O.C.) и национальных институтов из здравоохранения/Национальный институт от неврологических расстройств и инсульта (NIH/NINDS) (R01 NS085011 для O.C.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ультрацентрифуга | Beckman Coulter | A99839 | |
| 0.22 μ Фильтрующий блок M, 1 л | Corning | 430513 | |
| 0,45-μ m фильтрующий блок, 500 мл | Corning | 430773 | |
| 100 мм Чашка для культур, обработанная TC, | Corning | 430167 | |
| конические центрифужные пробирки 15 мл | Corning | 430791 | |
| 150 мм Чашки для клеточных культур, обработанные TC, с сеткой 20 мм Corning | 353025 | ||
| 50 мл конические центрифужные пробирки | Corning | 430291 | |
| 6-луночные планшеты | Corning | 3516 | |
| Aggrewell 800 | StemCell Technologies | 34811 | |
| Настольная центрифуга Allegra 25R | Beckman Coulter | 369434 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Конические донные ультрацентрифужные трубки | Seton Scientific | 5067 | |
| Конические адаптеры для трубок | Seton Scientific | PN 4230 | |
| Слайды Eppendorf для визуализации клеток | Eppendorf | 30742060 | |
| 96-луночные планшеты с высоким связыванием | Corning | 3366 | |
| Инвертированный флуоресцентный микроскоп | Leica | DM IRB2 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Обратимый сетчатый фильтр | StemCell Technologies | 27215 | |
| Ротор SW32Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
| VWR® Одноразовые серологические пипетки, стеклянные, непирогенные | VWR | 93000-694 | |
| VWR® Вакуумные фильтрационные системы | VWR | 89220-694 | |
| xMark™ Считыватель абсорбционных пластин | Bio-Rad | 1681150 | |
| Название< | strong>Company | Номер в каталоге | Comments |
| Реагенты для клеточных культур | |||
| Клетки эмбриональной почки человека 293T (HEK 293T) ATCC | CRL-3216 | ||
| Accutase | StemCell Cell Technologies | 7920 | |
| Раствор для полоскания против адгезии | StemCell Technologies | 7010 | |
| Антитело против FOXA2 | Abcam | Ab60721 | |
| Антитело против нестина | Abcam | Ab18102 | |
| Антибиотик-антимикотический раствор, 100x | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Добавка B-27 (50x), за вычетом витамина А | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BES | Sigma Aldrich | B9879 - BES | |
| Фракция бычьего альбумина V (7,5% раствор) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
| CHIR99021 | StemCell Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 08-774-552 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
| DMEM, среда с высоким содержанием глюкозы | Gibco | 11965 | |
| DNeasy Blood & Набор для салфеток | Qiagen | 69504 | |
| EpiTect PCR Control DNA Набор | Qiagen | 596945 | |
| EZ Набор для метилирования ДНК | Zymo Research | D5001 | |
| Желатин | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Гентамицин | Thermo Fisher Scientific | 15750078 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| человека рекомбинантный bFGF | StemCell Technologies | 78003 | |
| Человеческий рекомбинант EGF | StemCell Technologies | 78006 | |
| Человеческий рекомбинантный Shh (C24II) | StemCell Technologies | 78065 | |
| MEM Раствор заменимых аминокислот (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| N-2 Добавка (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
| Нейробазальная среда | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| заменимые аминокислоты (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| PyroMark PCR Kit | Qiagen | 978703 | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Пируват | натрияSigma Aldrich | S8636-100ML | |
| STEMdiff Нейроиндукционная среда | StemCell Technologies | 5835 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium | StemCell Technologies | 5838 | |
| TaqMan Assay FOXA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232764 | |
| TaqMan Assay GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs9999905 | |
| TaqMan Assay Nestin | Thermo Fisher Scientific | HS04187831 | |
| TaqMan Assay OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
| TaqMan Assay PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| Y27632 | StemCell Technologies | 72302 | |
| Name | Company | Каталожный номер< | strong>Комментарии |
| p24 реагенты ELISA | |||
| Моноклональный анти-p24 антитела | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Козья пероксидаза хрена кролика IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Рабочая концентрация 1:1500 |
| Сыворотка козья, стерильная, 10 мл | Sigma | G9023 | Рабочая концентрация 1:1000 |
| ВИЧ-1 Стандарты | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Нормальная мышиная сыворотка, стерильная, 500 мл | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Поликлональная кроличья анти-p24 антитела | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| Пероксидазный субстрат TMB | KPL | 5120-0076 | Рабочая концентрация 1:10,000 |
| Название< | strong>Company< | strong>Номер в каталоге | >Comments |
| Plasmids | |||
| pMD2.G | Addgene | 12253 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
| psPAX2 | Addgene | 12259 | |
| Name< | strong>Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| Ферменты рестрикции | |||
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
Ссылки
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
