Методическая статья

Визуализация обесценения эндотелия и глиальных барьеров нервно-сосудистого подразделения во время Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит в естественных условиях

DOI:

10.3791/59249

⸱

26 марта 2019 г.

 , 
1Theodor Kocher Institute, University of Bern

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протоколы для расследования ухудшение нервно-сосудистого подразделения во время Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит в естественных условиях. Мы конкретно рассмотреть способы определения проницаемости гематоэнцефалического барьера и gelatinase деятельности в лейкоцитарной миграции через глиальная мембрана.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нервно-сосудистого единицы (NVU) состоит из микрососудистой эндотелиальных клеток, образующих гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), эндотелиальные базальной мембраны с встроенный pericytes, и глиальная составе Паренхиматозный базальной мембраны и Астроцитарная конец канал охватывает аспект abluminal микрососудов центральной нервной системы (ЦНС). Помимо поддержания ЦНС гомеостаза NVU управляет людьми иммунных клеток в ЦНС. Во время immunosurveillance ЦНС низкое количество активированных лимфоцитов могут пересекать эндотелиальный барьер не вызывая BBB дисфункции или клинического заболевания. В отличие от этого во время neuroinflammation такие как рассеянный склероз или его животной модели Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) большое количество иммунных клеток могут пересекать BBB и впоследствии глиальная, в конечном счете достигая паренхимы ЦНС приводит к клинического заболевания. Миграция иммунных клеток в ЦНС паренхимы является таким образом двухэтапный процесс, который включает последовательные миграции через эндотелиальные и глиальных барьер NVU, используя собственный молекулярных механизмов. Если после их прохождения через эндотелиальный барьер, Т-клетки сталкиваются их родственных антигена на периваскулярной антиген представляющих клеток, их местные оживление будет инициировать последующих механизмов, ведущих к фокуса активации gelatinases, который позволят Т-клетки пересечь глиальных барьер и ввести ЦНС паренхимы. Таким образом оценки, BBB проницаемость и деятельность ММР в пространственной корреляции для накопления иммунных клеток в ЦНС при ЕАЕ позволяет указать потеря целостности эндотелия и глиальных барьеров NVU. Мы здесь показать, как вызвать ЕАЕ мышей C57BL/6, активная иммунизация и как впоследствии анализировать BBB проницаемости в естественных условиях, используя сочетание экзогенных Люминесцентные индикаторы. Мы также показать, как визуализировать и локализовать gelatinase активность в мозге ЕАЕ, на месте zymogaphy, в сочетании с immunofluorescent stainings BBB подвале мембран и CD45 + вторжение иммунных клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Центральной нервной системы (ЦНС) координирует все тело и психических функций в позвоночных, и имеет важное значение для надлежащей коммуникации нейронов ЦНС гомеостаза. CNS гомеостаза оправдывается блок нервно-сосудистых (NVU), который защищает ЦНС от меняющейся обстановке поток крови. NVU состоит из ЦНС микрососудистой эндотелиальных клеток, которые биохимически уникальны и создании гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в непрерывная связь с pericytes, астроциты, нейроны и компонентов внеклеточного матрикса (ECM), создания двух собственный подвал мембраны1. Эндотелиальные базальной мембраны, ensheathes, abluminal аспект BBB эндотелиальных клеток укрывает большое количество pericytes и состоит из Ламинин α4 и α5 Ламинин, помимо других ECM белки2. В противоположность этому Паренхиматозный базальной мембраны состоит из Ламинин α1 и α2 Ламинин и обнял Астроцитарная конце-ноги. Паренхиматозный базальной мембраны вместе с конца ноги экзоцитоз сочиняет глиальная который сегрегирует ЦНС нейронной сети из спинномозговой жидкости заполнены периваскулярной или субарахноидального пространства3. Благодаря уникальной архитектуре NVU иммунных клеток в ЦНС отличается от что в периферических тканях как он требует двухэтапный процесс с иммунных клеток, сначала нарушение эндотелиальных BBB и впоследствии глиальная мембрана для того чтобы достигать ЦНС паренхимы.

Рассеянный склероз (РС) является распространенным заболеванием neuroinflammatory центральной нервной системы, в которой большое количество циркулирующих иммунных клеток введите ЦНС и вызвать neuroinflammation, демиелинизации и фокуса потеря целостности BBB4. Потеря целостности BBB является ранней отличительной чертой МС, как указано наличие контраст гадолиния повышения поражений ЦНС как визуализированное магнитно-резонансная томография (МРТ)5. Лейкоцитарные кровоподтек в ЦНС происходит на уровне postcapillary венул; Однако точные механизмы, участвующие в иммунных клеток диапедез через BBB базальной мембраны и впоследствии глиальных барьер по-прежнему быть изучены. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) служит животной модели для MS и внесла существенный вклад в наши текущие знания о патогенезе MS. Например с использованием модели ЕАЕ было обнаружено, что кровоподтек лейкоцитов происходит в многоэтапный процесс, включая первоначальный захват и подвижного шаг при посредничестве селектинов и молекулами муцина как например P селектина гликопротеина лиганда (PSGL) -1, следуют Интегрин зависимые фирмы арест и ползать Т-клеток на BBB эндотелиальных клеток разрешительной стороны для диапедез6.

После того, как Т-клетки пересекли эндотелиальных BBB и эндотелиальных базальной мембраны, они должны столкнуться их родственных антигена на макрофаги и дендритные клетки, стратегически локализованы в лептоменингеальных или периваскулярные пространства. Это взаимодействие индуцирует фокуса производства про воспалительных медиаторов, триггер, последующие механизмы, необходимые для вторжения ткани ЦНС иммунных клеток через глии limitans7,8,9. Фокуса Активация матрицы металлопротеиназ (СПП) -2 и MMP-9 изменяет хемокиновых активации и индуцирует Деградация внеклеточного матрикса рецепторов на конце экзоцитоз-ноги, которая является предпосылкой для иммунной клетки миграции через глиальная в Паренхима ЦНС и побудить появления клинических симптомов ЕАЕ10,11.

Сочетая обнаружения ЦНС, проникнув иммунных клеток с BBB утечки и gelatinase активность в разделах ткани ЦНС предоставляет ценную информацию о функциональной целостности эндотелия и глиальных барьера в контексте neuroinflammation. К примеру, мы недавно исследовали учредительного потеря эндотелиальной туго Джанкшен молекулы соединительной Межмицеллярная молекула (JAM)-B людьми иммунных клеток в ЦНС в контексте ЕАЕ. По сравнению с здоровых мышей C57BL/6 одичал типа, здоровый джем-B-недостаточным однопометники показал не нарушение целостности BBB как показано в естественных условиях проницаемость оценки с использованием как внутреннего, так и экзогенных Трейсеры12. В контексте ЕАЕ мышей C57BL/6 джем-B-недостаточным показали улучшенное болезни симптомы, который был связан с треппинга воспалительных клеток в лептоменингеальных и периваскулярные пространства12. Для изучения этого явления мы применили в situ Зимография, позволяя определение gelatinase активности для того чтобы проверить если отсутствие gelatinase активности в джем-B-недостаточным мышей может нести ответственность за снижение числа иммунных клеток способны нарушить глии limitans12.

Учитывая наличие различных генетически модифицированные мыши модели отсутствует, например, различные BBB жесткие соединения молекул, которые могут вызвать изменения в функции BBB, методологии для расследования BBB целостности имеют важное значение. Кроме того недавно разработанные препараты могут повлиять на NVU барьеров. Здесь мы покажем, как побудить ЕАЕ мышей C57BL/6 путем активной иммунизации с миелина Олигодендроциты гликопротеина (MOG)-пептидные aa35-55 в полной Фройнд адъювантов. Мы затем объяснить, как локализовать иммунных клеток инфильтрата через эндотелиальные и глиальных барьеры NVU и как учиться в естественных условиях эндотелия и глиальных барьер целостность, на месте обнаружения экзогенных Трейсеры и gelatinase деятельности, соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все исследования были проведены в соответствии с руководящими принципами согласно швейцарского законодательства о защите животных и были утверждены Управлением ветеринарных кантона Берн, Швейцария (разрешение чисел: BE 31/17 и быть 77/18).

1. корпус мышей C57BL/6 в конкретных патогеном бесплатно (SPF) условиях

  1. Дом мышей в отдельных клетках вентилируемые с 12/12 h свето тени цикла. Предоставления продовольствия и воды libidum объявление. Контролировать микробиологического качества мышей, экспериментальный когорты претерпел ежеквартально работоспособностью, Грязные постельные принадлежности часовые после FELASA рекомендации13.
  2. Использование штампов уха отдельно отметить 8-12 неделя старый самок мышей C57BL/6.

2. Иммунизация мышей C57BL/6

  1. Подготовка решения14:
    1. Для полного Фройнд адъювантной (CFA), смесь 30 мл с 120 мг свеже pestled тепла Фройнд неполной адъювантной инактивированная микобактерии туберкулеза (H37RA) под вытяжного шкафа. Стоковый раствор хранить при 4 ° C.
    2. Стоковый раствор MOGaa35-55-пептид растворяют MOGaa35-55-пептида в стерильных PBS (4 мг/мл) и хранить при температуре-80 ° C.
    3. Подготовьте MOG-эмульсии:
      1. Разбавьте CFA 1:2 с MOG-пептид Стоковый раствор в 2 мл микропробирок.
      2. Уплотнение Микропробирка с пленки для запайки и исправить на вихревой смеситель, полностью покрывая трубку с клейкой лентой. Вихревой эмульсия для 4 ч при 4 ° C.
    4. Подготовьте шприцы с стабильной эмульсии:
      1. Возьмите Микропробирка и быстро уменьшается эмульсии, с использованием центрифуг небольшой стол. Сбор эмульсии в шприц с помощью инъекций иглой 18G x 1½'' (1,2 мм x 40 мм).
      2. По словам количество мышей громкость эмульсии в шприц (100 мкл/мышь) и заменить 18 G игла Инъекционная игла 27 g x ¾'' (0.4 мм x 19 мм). Уплотнение иглу, вложенное в шприц с пленки для запайки.
    5. Для коклюша токсин (PTx) раствор, растворяют 50 мкг лиофилизированные PTx в 500 мкл стерильных PBS (100 нг/мкл). Стоковый раствор хранить при 4 ° C.
    6. Для PTx рабочий раствор смесь 97 мкл стерильных PBS с 3 мкл раствора PTx штока (300 нг/100 мкл) на мышь (для использования внутрибрюшинной инъекции иглой 30G x ½'' (0,3 мм х 13 мм)).
  2. ЕАЕ индукции
    1. Анестезировать мышей C57BL/6 с isofluorane с помощью системы испарителем. Чтобы побудить анестезии в мышей, разоблачить мыши isofluorane 4,5% кислорода в камере небольшой инкубационный перед передачей мыши маску с 2,1% isofluorane. Используйте блок анестезии, оснащены грелку для предотвращения переохлаждения мыши.
    2. Исправить наркотизированных мышь в одной руке и впервые вставляют 30 мкл MOG35-55/CFA-эмульсии подкожно задняя нога бочки (рис. 1:1 + 2; в общей сложности 60 мкл; левый фланг 30 мкл и правый фланг 30 мкл) в непосредственной близости от паховые лимфатические узлы.
    3. Поместите курсор мыши на ее живот и залить 20 мкл MOGaa35-55/CFA-эмульсии в левую и правую жировой ткани в корне хвост (рис. 1:3 + 4; в общей сложности 40 мкл; левой стороне хвоста корень 20 мкл и правой стороне хвоста корень 20 мкл) и маленькая капелька int MOGaa35-55/CFA-эмульсии o шеи мыши (рис. 1: 5).
    4. Inject внутрибрюшинно 100 мкл раствора PTx в мышь. Держите голову мыши ниже центра тела, избегая инъекции в кишечнике.
    5. Заменить содержание диеты (extrudate основных питательных веществ: 18,5% сырого протеина; неочищенный жир 4.5%, сырая зола 6,5%; 35% крахмала; клетчатка 4,5%; метаболической энергии: 13.1 МДж/кг) для разведения диета (extrudate основных питательных веществ: неочищенный белок 23,5%, неочищенный жир 5,5%; непереработанные волокна 3%; сырая зола 5,7%; 36% крахмала; метаболической энергии: 14.3 МДж/кг) для того, чтобы предоставить мышей с пищей выше содержание энергии до и во время ожидаемого клинического заболевания.
    6. Удалите маску и передать его домой клетку с потепление площадку мыши. Убедитесь, что мышь полностью проснуться и подвижные после 10 минут.
    7. Повторите PTx инъекции (2.2.4) 48 ч после первого лечения.

3. Озвучивание ЕАЕ мышей

  1. Проверьте состояние здоровья ЕАЕ мышей каждое утро, принимая взглянуть внутрь клетки.
  2. Оценка ЕАЕ мышей каждый день.
  3. Возьмите каждый индивидуальный мыши, включены в эксперимент ЕАЕ из клетки и проверить имеет ли хвост тонус, перемещая его вверх с пальцем. Здоровой мыши будет держать его хвост (хвост имеет тонуса). Если клинические ЕАЕ началась, хвост тонус будет ниже, видимый постепенное падение хвоста. В конечном итоге мыши не сможет поднять свой хвост на всех.
  4. Поместите каждый индивидуальный мыши, включены в эксперимент ЕАЕ на чистой скамейке и наблюдать и документ пешеходных поведение. См таблицу 115 для озвучивания критерии для оценки тяжести заболевания (EAE балл).
  5. Оценивать и документировать вес каждой мыши, включены в эксперимент.
  6. Обеспечить достаточное питание и поглощение воды мышами, отображение клинических ЕАЕ Оценка 1 поставку смоченной пищи в пластиковых блюдо в нижней части клетки и обновления ежедневно.

4. In vivo проницаемости пробы

  1. Подготовка решений:
    1. Для фондовых растворов декстрана растворяют 10 мг 10 кДа 488 Fluor Alexa декстрана, а также 3 кДа красный Техас декстрана в 500 мкл раствора натрия хлорида 0,9% (20 мг/мл).
    2. Для рабочего раствора декстрана просто до инъекции накапайте 55 мкл 10 кДа декстрана Alexa Fluor 488 складе раствора (20 мг/мл) на кусок пленки для запайки и 55 мкл 3 кДа декстрана Техас красный Стоковый раствор (20 мг/мл). Смешать и собирать 100 мкл в одноразовый штраф шприц (конечная концентрация 2 мг/100 мкл).
    3. Стоковый раствор 10% формальдегида (PFA) объединить 10 g PFA дополнительный чистый порошок, 100 мл PBS и 200 мкл 1Н NaOH в стакан чистой стекла и тепла до точно 56 ° C при перемешивании с помощью магнитной мешалкой; Держите на 56 ° C за 30 мин до тех пор, пока полностью не растворится ППД; охладить до комнатной температуры; Отрегулируйте пэ-аш до 7,4; и процеживают через бумажный фильтр. Хранить при - 20 ° C. Стоковый раствор может быть разбавлен дальнейшее использование PBS.
  2. Вскоре анестезировать здоровых мышей C57BL/6 или мышей C57BL/6, страдает от ЕАЕ с изофлюрановая (мышь будет отключке примерно 1 мин). Использование автоматизированной системы как шаг 2.2.1 (мышей будут подвержены изофлюрановая 4,5% кислорода в камеру всасывание и затем переданы маску с 2,1% изофлюрановая).
  3. Место наркотизированных мышь в боковой позиции на стол, затем внутривенно (например ретро орбитально) придать мыши 100 мкл люминесцентные Индикаторы, прежде чем мыши просыпается.
  4. Немедленно удалите маску и убедитесь, что мышь полностью проснуться и подвижные после короткого анестезии. Пусть трассировщик распространить на 15 мин.
  5. Перейдите к шагу 5.1.

5. перфузии мышей

  1. Для оценки в естественных условиях проницаемость:
    1. Начала процедуры 15 мин после инъекции флуоресцентные трассирующими, вызывая глубокие изофлюрановая анестезии. Чтобы побудить глубокой анестезии у мышей использовать 2,3% изофлюрановая кислорода. Использовать рефлекс вывод лапы для оценки глубины анестезии (ущипнуть кожу между пальцами; отсутствие сгибания указывает достаточной глубины) и зонд рефлексы передних конечностей и задних конечностей у мышей подвергали ЕАЕ.
    2. Исправьте мышь на его спине и спрей живот с этанолом. Открыть с помощью ножниц грудной клетки и удалить диафрагмы. Откройте правое предсердие биение сердца с помощью ножниц и perfuse мыши через левого желудочка сердца с PBS, следуют 10 мл 4% 10 мл ПФА в PBS.
      Предупреждение: Чтобы избежать вдыхания PFA, perfuse мыши в зонта.
    3. Перейдите к разделу 6.
  2. Для в situ Зимография:
    1. Вызывают глубокую изофлюрановая анестезия с помощью изофлюрановая 2,3% кислорода в страдающих от ЕАЕ мыши и проверьте глубину анестезии как шаг 5.1.1.
    2. Далее исправить мышь на его спине и спрей живот с этанолом. Открыть с помощью ножниц грудной клетки и удалить диафрагмы. Откройте правое предсердие биение сердца с помощью ножниц и perfuse мыши через левого желудочка сердца с 20 мл ФСБ.
    3. Перейдите к разделу 6.

6. Вскрытие и замораживания мозга

  1. Подготовка охлаждающей ванны:
    1. Заполните контейнер плоского Дьюара с измельченного сухого льда и добавить 2-methylbutane (изопентан) до тех пор, пока жидкость достигает примерно на 1 см выше сухой лед. Закрыть крышкой свободные – например, обложку ведро льда.
  2. Клип от головы перфузии мыши с острыми ножницами и удалить кожу и уши, используя меньший набор ножницы.
  3. Тщательно анализировать тюбетейка, отрезав от затылочного к передней левой и с правой стороны, позволяя upfold тюбетейка над мозг. Затем осторожно поднимите нетронутыми мозга от основания черепа при разрыве оптических нервов, с помощью плоской металлической лопаткой.
  4. Место мозга на алюминиевой фольги и вырезать мозг в трех штук (фронтальный мозга, среднего мозга и мозжечке + ствола мозга), поставив два корональных сокращений.
  5. Заполнить cryomold (25 мм x 20 мм x 5 мм) в первом квартале с оптимальной температурой резания (O.C.T.) матрица, места срезов мозга с передней стороной каждой части мозга, вниз в cryomold и охватывают ткани полностью с O.C.T. матрицей.
  6. Место cryomold с ткани в горизонтальной ориентации в 2-Methylbutane ванну и убедитесь, что ткани замерзает от дна к верхней в течение 1 минуты, избегая погружения блока всей ткани в ванну.
  7. Передать-80 ° C для хранения замороженных ткани и перейдите к разделу 7.

7. Подготовка секций замороженные ткани

  1. Сбалансировать температуры от замороженных ткани от-80 ° C до-20 ° C в криостат для 30 мин.
  2. Удалить блок ткани из cryomold и горе на держатель ткани криостата (регулировка-15 ° C) с помощью матрицы O.C.T..
  3. Обрезать края ткани блока на держателе криостат с острый скальпель и начать сокращать в блок ткань, удаляя 20 мкм секции с криостата нож до тех пор, пока ткань является видимым.
  4. Для анализа в естественных условиях BBB проницаемость:
    1. Вырезать разделов ткани 6-10 мкм, собрать их на адгезии стеклянных скольжениях и сразу же изображения секций, покрыта крышка выскальзования с помощью микроскопа флуоресценции.
    2. Оцените внешний вид кровеносных сосудов в мозге (Обратите внимание на резкие границы не вытекающей кровеносных сосудов, по сравнению с диффузный характер флуоресценции для вытекающей кровеносных сосудов). Как положительный контроль Проверьте утечки tracer в строме circumventricular органов или сосудистое сплетение, которой не хватает BBB.
  5. Для в situ Зимография:
    1. Вырезать 6 мкм разделов ткани с помощью криостат, собирать их на адгезии стеклянных вставках и заморозить разделов ткани при-20 ° C в коробке замораживания, содержащий силикагель в крышке.

8. в situ Зимография в сочетании с Ламинин/CD45 иммунофлюоресценции пятнать

  1. Подготовка решения:
    1. Подготовка внедрения решения:
      1. Смешать 6 g глицерина (чда), 2.4 g поли (виниловый спирт), 6 мл ddH2O и 12 мл 0,2 М трис буфера, рН 8 и перемешать (Магнитная мешалка) раствор для 4 h на RT.
      2. Передача решения в 50 мл пластиковых пробирок и дайте ему отдохнуть в течение 2 ч в рт. Впоследствии Инкубируйте решение для 10 мин при температуре 50 ° C (водяная баня) и центрифуги для 20 минут, 2700 x g при комнатной температуре.
      3. Возьмите супернатант и заморозить в аликвоты при-20 ° C.
    2. Готовят раствор желатина холодной:
      1. Растворите 0,1 г холодного желатина из кожи крупного рогатого скота в 10 мл ddH2O.
      2. Дайте ему впитаться в течение по крайней мере 1 день и хранить аликвоты при 4 ° C.
    3. Подготовьте ледяной метанола (-20 ° C):
      1. 100% метанола в опарник coplin и охлаждения до-20 ° C.
    4. Подготовьте раствор азид натрия 10%:
      1. Добавьте 1 g азид натрия в 10 мл ddH2O и хранить при комнатной температуре.
    5. Подготовьте раствор рабочих азид натрия 0,1%:
      1. Mix 99 µL из ddH2O с 1 мкл 10% азид натрия раствор.
    6. Растворить 1 мг флуоресцеин конъюгированных закаленном краситель (DQ) желатина из кожи свиньи в 1 мл азид натрия работает решения и хранить 100 мкл аликвоты, защищенном от света при 4 ° C.
    7. Растворяют 30 мг моногидрата 1,10-фенантролиновый в 76 мкл этанола и хранить при-20 ° C.
    8. Подготовка 25 x решение ингибитор протеазы:
      1. Добавьте 1 таблетка ингибитора протеазы бесплатно ЭДТА в 2 мл ddH2O. Хранить при температуре от-20 ° C.
    9. Непосредственно перед использованием приготовляют раствор реакции (150 мкл/раздел):
      1. Центрифуга 1 мг/мл DQ желатин решение для 5 мин при 13,300 x g.
      2. Mix 127.2 мкл ddH2O, 15 мкл 10 x буфер реакции (Gelatinase/коллагеназы Assay Kit; см. Таблицу материалы), 0,3 мкл 20 мг/мл холодной желатина, 1.5 мкл 1 мг/мл DQ желатина и 6 мкл 25 x решения ингибитор протеазы.
    10. Непосредственно перед использованием Подготовьте фенантролина отрицательный контроль реакции раствора (150 мкл/раздел):
      1. Mix 125.2 мкл ddH2O, 15 мкл 10 x буфер реакции, 0,3 мкл 20 мг/мл холодной желатина, 1.5 мкл DQ желатина 1 мг/мл, 6 мкл 25 x ингибитор протеазы ЭДТА бесплатно и 2 мкл 2м 1,10-фенантролина (MMP ингибитора).
    11. Непосредственно перед использованием готовят холодные желатин (не люминесцентные) отрицательный контроль реакции раствор (150 мкл/секция):
      1. Mix 128.7 мкл ddH2O, 15 мкл 10 x буфер реакции, 0,3 мкл 20 мг/мл холодной желатина и 6 мкл ЭДТА бесплатно ингибитор протеазы 25 x.
    12. Подготовка основного антитела коктейль для counterstaining, например, 0,95 мкг/мл кролика polyclonal антитела анти Ламинин и антитела анти CD45 поликлональных крыса 10 мкг/мл в 1% BSA в PBS и подготовить соответствующие изотипа управления основное антитело коктейли.
    13. Подготовить раствор вторичных антител, например, 7.5 мкг/мл Cy3 коза анти крыса + 15 мкг/мл AMCA анти кролик в 1% BSA в PBS (защищает от света).
  2. Разморозить 6 мкм-Исправлена мозга разделов ткани от мышей ЕАЕ внутри окна пластиковые замораживания, содержащий силикагель в крышке в Зонта, чтобы избежать удержания воды в ткани и отделить 2 разделах ткани на одном слайде, Рисование линий с водой отталкивая перо
  3. Подготовка решения реакции (8.1.9-8.1.11 меры), центрифуги для 5 мин в 13400 x g при комнатной температуре и предварительно теплой до 37 ° C, с помощью водяной бане.
  4. Увлажняет разделов ткани на 5 минут при 37 ° C, с помощью 1 x буфер реакции. Затем слить 1 x буфер реакции, добавить решение реакции на разделах ткани и инкубировать в течение 4 ч при 37 ° C. Вымойте слайды 5 раз в ddH2O.
  5. Исправить разделы для 5 мин с ледяной метанола при-20 ° C и потом мыть разделы с PBS при комнатной температуре.
  6. Добавить 1% BSA в PBS на разделы и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре (защищает от света). Затем, отменить 1% BSA в PBS из разделов, щелкая слайды на ткани, добавить основное антитело коктейлем и инкубировать 1 час при комнатной температуре (защищает от света).
  7. Вымойте секции дважды с PBS, добавить вторичные антитела коктейль и инкубировать 1 час при комнатной температуре (защищает от света).
  8. Вымойте секции дважды с PBS, смонтировать слайды с внедрения решения, пусть навесные секции сухие за ночь при комнатной температуре (защищает от света). Наконец анализ разделов окрашенных тканей, с использованием флуоресцентный Микроскоп.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка клинического течения ЕАЕ мышей C57BL/6 должно привести к болезни кривой, как показано на рисунке 2А и изменения веса тела мыши, представленные на рисунке 2B. Мышей C57Bl/6, иммунизированных с MOGaa35-55 обычно начинают развиваться симптомы болезни около 10-12 день после активной иммунизации (рис. 1A). Как правило иммунизированная мышь показывают переходных падение веса тела на следующий день после инъекции эмульсии и первая д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол стимулировать и контролировать ЕАЕ в самок мышей C57BL/6. Женщины преференциально выбраны, и число случаев заболевания женщин: мужчины 3:1 в мс. Для оценки тяжести ЕАЕ, мы сделали использовать 3-точка забил листа. ЕАЕ тяжести обычно забил в отношении серьезности моторных дисфункций. Мышей с передовых стадиях ЕАЕ, т.е. экспонируется оценка выше 2 должны быть принесены в жертву избежать ненужных страданий животных. Таким образом, рекомендуется набрать мышей закрыть интервалы, например два раз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отсутствие конфликта интересов объявил.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы с благодарностью признаем Лидия Сорокин, который разделил ее оригинал в situ Зимография протокол10 с нами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антитела к кроликам AMCAJackson ImmunoResearch111-156-045Хранить при 4 ° C; защита от света
Anti-CD45 антитела (30F11)Pharmingen07-1401Хранить при 4 ° C
Антитела к ламининуDAKOZ0097Хранить при 4 ° C
Корм для племенного разведениянапример, PROVIMI KLIBA SA3336
Индивидуально вентилируемые клетки, Синяя линия Тип II или III,например, Tecniplast 1145T, 1285L
BSA фракция VApplichemA1391Хранить при 4 ° C
Холодный желатинSigma-AldrichG 9391
Coplin jar + штативнапример, Carl Roth GmbH + Co. KGH554.1; H552.1
Cy3 антитела к крысамJackson ImmunoResearch111-156-144Хранить при 4 ° C; защита от света
Защитные стекла 24 x 40 мм # 1например, Thermo Scientific85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10 000 МВт),например, молекулярные зондыD22910хранить при -20 °°; C; защитить от света
Dextran Texas Red (3000 МВт)InvitrogenD3328хранить при -20 °°С; C; защитить от света
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit Thermo Fisher Scientific; EnzCheckE12055Магазин при -20 °° C; защитить от легких
самок мышей C57BL/6J (8-12 недель),например, Janvier LabsFemales, 8-12 недель
Морозильная коробка для гистологических стекол,например, Carl Roth GmbH + Co. KG2285.1
18G x 1½ ’ ’ игла для инъекций (1,2 мм x 40 мм),например, BD, BD Microlance 3304622
27G x ¾ ’ ’ – No 20 (0,4 мм x 19 мм) игла для инъекций, например, BD, BD Microlance 3302200
30G x ½ ’ ’ (0,3 мм x 13 мм) игла для инъекций, например, BD, BD Microlance 3304000
Incomplete Freund' s адъювант (IFA),например, Santa Cruz Biotechnologysc-24648Store at 4° C
Поддерживающее питаниенапример, пептид PROVIMI KLIBASA 3436
MOGaa35-55-55,например, GenScriptStore при -80 °°; Предметные
стекла для микроскопа C (Superfrost Plus )Thermo ScientificJ1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA,например, BD231141Хранить при 4 ° С 
NaCl 0,9 %B. Braun3535789
O.C.T. соединение (Tissue-TekSakura4583
Omnican 50 30G x ½ ’ «B. Braun9151125S
ПараформальдегидMerck30525-89-4
Коклюшный токсиннапример, List biological laboratories, Inc.180Магазин в 4 ° C
поли(виниловый спирт) (Mowiol 4-88)Sigma-Aldrich81381
Ингибитор протеазы ЭДТА свободный (Roche)Sigma-Aldrich4693132001хранить при 4 ° C
отталкивающая ручка, например, DAKO Pen, например, DAKOS2002
герметизирующая пленка, например, Parafilm M, например, Sigma-AldrichP7793
Silicagel, например, Carl Roth GmbH + Co. KG9351.1
Ножницы для стежковF.S.T15012-12
шприц 1 мл, например, PRIMO62.1002
шприц 10 мл, например, CODAN Medical Система2022-05
Univentor 400UNO. БВ
, , , ), испарителя ApS

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363(2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

zymography in situC57BL 6

Похожие статьи