Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ Трисахариды молока Fucosylated человека в биотехнологических контексте с использованием генетически закодированный биосенсоров

5.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59253

⸱

13 апреля 2019 г.

 , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

В этой статье

Краткое содержание

Мы опишем здесь высок объём обнаружения и количественного определения fucosylated олигосахаридов грудного молока (ОУМ) с помощью биосенсора поклеточного. Мы также демонстрируют здесь, адаптация этой платформы к анализу HMO производства штаммов, уделяя особое внимание улучшению соотношение сигнал-шум.

Аннотация

Олигосахаридов грудного молока (ОУМ) являются компонентами сложный углевод человеческого грудного молока, которые демонстрируют обильные преимущества детского здоровья. Однако оптимизации их биотехнологического синтеза ограничивается относительно низкую пропускную способность обнаружения и количественного определения моносахаридов и связей. Обычные методы анализа glycan включают хроматографии/масс спектрометрического методов с пропускной способностью порядка сотни образцов в день без автоматизации. Мы показываем здесь, генетически закодированный бактериальных биосенсора для высокой пропускной способности, связь конкретных обнаружения и количественного определения структур fucosylated HMO, 2'-fucosyllactose и 3-fucosyllactose, которого мы достигли через гетерологичных выражение fucosidases. Как присутствие лактозы в молоке или в биотехнологических процессов может привести к ложным положительным результатам, мы также демонстрируют сокращение сигнала от лактозы, используя различные стратегии. Благодаря высокой пропускной способности этой техники много условий реакции или биореактор параметров может assayed параллельно в течение нескольких часов, что обеспечивает возможность оптимизации производства HMO.

Введение

Олигосахаридов грудного молока (ОУМ) являются лактоза производные олигосахариды, обычно состоит из трех до восьми сахара мономеров. Они имеют лактозы (Гал β1, 4-Glc) уменьшение конец и далее вытянутые гликозидные связи (β-1,3 - или β-1,6-) глюкозы (КЗС), галактозу (Gal) или N-acetylglucosamine (GlcNAc). Кроме того Фукоза (ОФП, α-1,2 - или α-1,3-) или сиаловая кислота (Sia или NeuAc, α-2,3 - или α-2,6-) остатки часто добавляется1.

Текущий анализ олигосахаридов и других углеводов в пропускную способность и объем ограничен потребность хроматографии/масс-спектрометрии (МС) технология2,3,4,5, 6 , 7, который может занять примерно час образец, не говоря уже о необходимости дорогостоящего оборудования, специализированных столбцов и derivatizing агентов и специалистов по эксплуатации этого оборудования8. Олигосахариды связей особенно трудно определить, требующих передовых MS9,10 или методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР)11. Быстрая оптимизация синтеза этих олигосахариды ограничивается таким образом пропускная способность этой медленной аналитической шаг.

В этом исследовании, мы продемонстрировать связь конкретного выявления fucosylated Трисахариды лактозы основе поликлиниками, сосредоточив внимание на 2'-fucosyllactose (2'-FL), является наиболее распространенным HMO в человеческом молоке, с использованием генетически закодированный Escherichia coli клеточных Биосенсор с пределом обнаружения на 4 мг/л. Важной особенностью этой биодатчик является его способность различать изомерных Трисахариды. Принцип конструкции на основе выражения конкретных fucosidases в E. coli , освободить лактозы с поликлиниками, присутствие которых обнаруживается lac -оперона, который в свою очередь генерирует сигнал флуоресцентные. Мы добиться этого путем создания системы двух плазмиды, один укрывательство связь конкретных fucosidase и другой белок флуоресцентные репортер. Этот биодатчик платформа подходит для высокопроизводительного скрининга проточной цитометрии или микро плита читателя. Мы также демонстрируют использование биосенсор в количественном определении 2'-FL, производимые инженерии штамм12. В рамках этого исследования мы также представляем три стратегии на селективного удаления лактозы, что может привести к ложным положительный сигнал от биосенсор, учитывая, что штамм инженерии продюсер выращивается на лактозу.

Вместе взятые, генетически закодированный биодатчики позволяют нам выявлять и количественно HMOs связь конкретным образом, что трудно даже с хроматографического, MS, или ЯМР методами. Благодаря своей высокой пропускной способности и простоты использования этот метод должен иметь широкое применение в метаболический инжиниринг и синтез HMOs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. клетки культуры и индукции условия

Примечание: В следующих экспериментах, используются три штамма: E. coli BL21 (DE3) с пустой вектор, E. coli BL21 (DE3) с плазмид pAfcA14 и pET28:green флуоресцентный белок (КГВ) и E. coli BL21 (DE3) с плазмиды pAfcB14 и pET28:GFP. Все штаммы выращиваются в бульоне Лурия Бертани (LB) или минимальной СМИ с соответствующие антибиотики. Подготовка запасов решения 1000 x канамицин (50 мг/мл) и carbenicillin (100 мг/мл) в дейонизированной (DI) воды.

  1. Подготовка средств массовой информации
    1. Подготовьте LB СМИ, добавив 25 g акций LB порошка на 1 Л воды ди. Автоклав раствор при температуре 121 ° C за 20 мин до стерилизации. Подождите, пока стерилизованные LB СМИ Температура не ниже 60 ° C до сложения 1 мкл антибиотик запасов для каждого 1 мл LB СМИ.
    2. Подготовить LB тарелки, добавьте 15 g агар LB СМИ до стерилизации. Подождите, пока стерилизованные LB агар Температура не ниже 60 ° C до введения антибиотика.
    3. 1.1.3 для biosensing клеток Подготовьте СМИ или тарелки с двойной антибиотики, канамицин и carbenicillin.
  2. Углеводный индукторов
    1. Подготовка запасов растворы углеводов индукторов в молярной эквиваленты до 20 г/Л лактозы: 29 г/Л 2'-FL и 3-эт.
      Примечание: Каждый 200 мкл клеток потребует 20 мкл 2'-FL или 3-эт.
    2. Побудить 200 мкл клеток с 2,0 г/Л конечная концентрация лактозы или 2,9 г/Л конечная концентрация 2'-FL/3-эт инкубировать при 37 ° C с непрерывной тряски и пусть культуры растут на ночь.
  3. Культура клеток
    1. За день до эксперимента семян 5 мл среды LB, дополненная канамицин и carbenicillin из свежего бактериальные колонии, используя стерильную методику.
    2. Инкубировать всех культур при 37 ° C с перемешиванием и расти культур на ночь.
    3. Передача 50 мкл ночь культуры в 5 мл свежего LB/M9 СМИ с канамицин и carbenicillin. Инкубировать при 37 ° C с непрерывной тряски и расти до тех пор, пока культура достигла оптическая плотность 600 Нм (600OD) 0,5 – 0,7. На этом этапе середины журнала может быть наведено клетки.

2. Измерение флуоресценции и пределы обнаружения

  1. Подготовка клетки для проточной цитометрии
    1. Передачи на ночь культур для 1.5 мл пробирок и центрифуги на 12 500 x g за 1 мин.
    2. Отменить супернатант и вновь приостановить гранулы в 500 мкл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS; 6 мм Na2HPO4, 1.8 мм NaH2PO4, 145 мм NaCl в DI воды, рН 7,2) подготовить одну ячейку подвеска и передавать одну ячейку подвеска в 5 мл цитометрии расходомерных трубок.
    3. Держите клетки в темноте при температуре 4 ° C до запуска примеров на проточный цитометр. Для достижения наилучших результатов анализ клетки как можно скорее.
    4. Выберите 488 нм лазер для возбуждения GFP. Соберите флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) флуоресценции уровней (20 000 – 40 000 мероприятий, закрытом для передней и боковых разброс во избежание агрегированных клеток и мусора) с 525/50 Нм полосовой фильтр.
  2. Калибровка биосенсор
    1. Чтобы сделать калибровочной кривой, сделать 8 – 10 разведений Стандартный 2'-FL в диапазоне 0 – 2500 мг/л
    2. Культура клетки biosensing 2'-FL (содержащий pAfcA и pET28:GFP) и побудить их с стандартных растворов, как описано ранее в разделе 1.3. Проводят три биологических репликация для каждого разведения.

3. выявление и количественная оценка 2'-ФЛ в продюсер штамм

  1. Выращивание штамма продюсер
    1. Для изготовления минимальные средства массовой информации, подготовить отдельные решения 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, натрия цитрата и тиамин 1 M-HCl. стерилизовать решения, с помощью фильтра 0.22 мкм. Смешайте бульон порошок M9 СМИ с 1 Л воды ди. Автоклав M9 раствор при температуре 121 ° C на 15 мин охлаждения решение до 50 ° C. Добавьте в MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, цитрат натрия и тиамина окончательного концентрации 2 мм, 0,1 мм, 12 г/Л, 11 мг/Л, 75 мг/Л и 7.5 мкг/Л, соответственно.
    2. Начало культуры 2'-FL производства штамм, например, JM109 gwBC-F2, 5 мл LB СМИ и пусть растут на ночь при 37 ° C, как описано в Баумгартнер et al.12.
    3. Субкультура в 1%, как описано выше в шаге 1.3.3 в 250 мл минимальной СМИ, подготовленную на этапе 3.1.1. Добавить глицерин в конечной концентрации 10 г/Л и инкубировать культуры при 37 ° C.
    4. Когда культура достигает ОД600 0,5 – 0,7, добавьте изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0,5 мм и лактозы до конечной концентрации 2 г/л
    5. Инкубировать при 37 ° C с непрерывной тряски и пусть культуры растут на 24 часа.
  2. Экстракция 2'-FL
    1. Передать ночи культур стерильные 50 мл трубки и центрифуги на 900 x g за 15 мин.
    2. 3.2.2 удалить супернатант и вновь приостановить Пелле в воде ди. Повторите шаг мыть три раза для удаления остатков лактозы и наконец вновь приостановить в 5 мл воды ди.
    3. Чтобы лизировать клетки подвеска, используйте sonicator на 30% мощности, в 30 s импульсов. Держите клетки на льду во все времена.
    4. Центрифуга лизированных клетках для 25 мин на 2000 x g. Удалить супернатант, передать его через стерильную (например, 0,22 мкм) фильтра и хранить его на 4 ° C до анализа.
  3. Количественная оценка с биосенсор
    1. Прививать культуру 2'-FL biosensing клеток, а также на этапе среднего журнала, побудить с lysate клетки эквивалент к оценкам концентрации 2'-FL, используемый для сделать градуировочного графика, как описано в разделе 2.2. Калибровки в том же обстановке как образец для анализа (например, ячейка lysate) путем добавления разведений 2'-FL управления (т.е.-продюсер) отфильтрованные клеток lysate до вызывая биосенсор клетки.
    2. Выполнение примеров на проточный цитометр. Создание кривой доза реакция путем построения выход флуоресценции против концентрации олигосахариды. Сравните ответ стандартов lysate клетки.

4. селективное удаление лактозы

Примечание: Biosensing клетки чувствительны к лактозы и желательно для биосенсора избирательно обнаруживать HMOs над лактозы. Одна из стратегий будет включать Стиральная клеток, как описано в разделе 3.2. Ниже описаны три другие стратегии.

  1. Лечение с коммерческой очищенный β-галактозидазы
    1. Распустить лиофилизированные β-галактозидазы в 1000 единиц (FCC лактаза) / мл, 1 мм MgCl2 или использовать коммерческие β-галактозидазы в растворе.
    2. Для определения оптимальной концентрации фермента необходимо, растут посевным материалом 2'-FL biosensing клеток и побудить с 2 г/Л лактозы и 2,9 г / Л 2'-FL в середине фазы журнала.
    3. 100 мкл культур добавьте переменную количества β-галактозидазы, до 12 единиц и пусть растут на ночь при 37 ° C с непрерывной тряски культур.
    4. Измерения флуоресценции, как описано в разделе 2.1 и рассчитать оптимальное единиц фермент необходимые определения концентрации минимальный фермента для достижения желаемого затухания сигнала.
    5. 2'-FL производства клетки выросли за 24 ч добавить оптимального единиц β-галактозидазы и Инкубируйте на ночь на 37 ° C. Продолжите с протоколом для определения титра 2'-FL, как описано в разделе 3.3.
  2. Предварительная обработка с LacZ + штамм
    1. Начало 25 мл культуры штамма 2'-FL производства и после индуцированного на этапе среднего журнала, инкубировать культуры при 37 ° C в течение 24 ч.
    2. Прививать E. coli BL21 (DE3) культура в LB, растут в середине журнала фазы при 37 ° C и добавить 50 мл (2:1) культуры к культуре 24 h.
    3. Инкубируйте при 37 ° C для 3 h. продолжить с протоколом для определения титра 2'-FL, как описано в разделе 3.3.
  3. Лактоза осадков с этанолом
    Примечание: Этот раздел заимствован из Мацуки et al.12.
    1. Начало 25 мл культуры штамма 2'-FL производства и после индуцированного на этапе среднего журнала, инкубации при 37 ° C в течение 24 ч.
    2. Добавьте два тома 100% этанола к культуре, встряхнуть и инкубировать при 37 ° C в течение 4 ч.
    3. Центрифуга подвеска на 900 x g для 15 минут собрать супернатант и инкубировать на ночь при 4 ° C, который осаждает лактозы.
    4. Удаления осажденного лактозы, передав решение через фильтровальную бумагу (11 мкм). Сбор фильтрата, что ячейка lysate, содержащий 2'-FL, которые могут быть количественно следующим раздел 3.3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы разработали клеточных биосенсора для 2' FL, который может использоваться в сочетании с биотехнологического производства олигосахариды. Это зависит от конкретных ферментативного расщепления изменения терминалов сахара генерации лактозы и тем самым активации lac -оперона, ведущих к выражению репортер флуоресцентный белок под индуцибельной промоутер лактозы, пропорционально Количество 2'-ФЗ. Чтобы продемонстрировать свою специфику связь, 3-fucosyllactose (3-FL), изомер, также был...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представляем высок объём стратегию для выявления конкретных связей fucosylated олигосахаридов грудного молока. Это было достигнуто путем построения клеточных биодатчики, генетически инженерных E. coli , который после индукции с конкретными гликанов реагировать с флуоресцентного сигнала. Протокол также подробную информацию о как биосенсор может использоваться для выявления и количественной оценки поликлиниками в метаболически инженерии бактериальный штамм.

Наш протокол предлагает пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана средств запуска Айова государственного университета. Отвязка частично финансировалась NSF Trinect стипендий и Мэнли Hoppe профессора. T.J.M. был частично поддерживается Карен и Денни вон факультета стипендий. Авторы благодарят Айова государственного университета потока цитометрии фонда и W.M. Keck метаболомики научно-исследовательская лаборатория для помощи с флуоресценции и LC-MS исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2'-фукозиллактоза Карбосинт 41263-94-9
3-фукозиллактоза Карбосинт 41312-47-4
АгарFisher ScientificBP9744500
хлорид кальция, дигидратFisher ScientificC79-500
Карбенициллин Fisher ScientificBP26481
декстроза (D-глюкоза), безводныйFisher ScientificD16-1
BDFACSCanto Plus RUO
ВЭЖХAgilent Technologies1100 серия ВЭЖХ система ВЭЖХ
LunaC18 колонка с обратной фазой
KanamycinFisher Scientific
LB Бульон, Miller Fisher Scientific12-795-027
ЛактозаFisher Scientific64044-51-5
M9, минимальные соли, 5xSigma-AldrichM6030
сульфат магния, безводныйFisher ScientificM65-500
MSAgilent Technologiesмассовая селективная ловушка SL детектор
хлорида натрияSigma-Aldrich7647-14-5
Натрия фосфат двухосновнойSigma-Aldrich7558-79-4
Натрия фосфат одноосновнойSigma-Aldrich13472-35-0
проточный цитометр колонка 11815024

Ссылки

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562(2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939(2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Фукозилированные ОМНбиосенсорное детектированиепроточная цитометриявысокопроизводительный скринингинтерференция лактозыбета-галактозидазагенетическая инженерияэкспрессия в E. coliколичественное определение олигосахаридовспецифичность связей
Анализ Трисахариды молока Fucosylated человека в биотехнологических контексте с использованием генетически закодированный биосенсоров
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.