Пошаговая процедура описывается для безэтикетки иммобилизации экзосом и внеклеточных пузырьков из жидких образцов и их визуализации с помощью атомной силовой микроскопии (AFM). Изображения AFM используются для оценки размера пузырьков в растворе и характеризуют другие биофизические свойства.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изображение внеклеточных пузырьков с помощью атомной микроскопии силы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Экзосомы и другие внеклеточные пузырьки (EVs) представляют собой молекулярные комплексы, состоящие из липидной мембраны везикулы, ее поверхностного украшения мембранными белками и другими молекулами, а также разнообразное содержание светила, унаследованного от родительской клетки, которая включает РНК, белков и ДНЯ. Характеристика гидродинамических размеров ЭВ, которая зависит от размера везикулы и его коронарного слоя, образованного поверхностными украшениями, стала рутинной. Для экзосомы, самой маленькой из ЭВ, относительная разница между размерами гидродинамических и пузырьков значительна. Характеристика размеров пузырьков криогенной передачей электронной микроскопии (крио-TEM) изображения, золотой стандарт техники, остается проблемой из-за стоимости инструмента, опыт, необходимый для выполнения подготовки образца, изображений и анализа данных, и небольшое количество частиц часто наблюдается в изображениях. Широко доступной и доступной альтернативой является атомная микроскопия силы (AFM), которая может производить универсальные данные о трехмерной геометрии, размерах и других биофизических свойствах внеклеточных пузырьков. Разработанный протокол направляет пользователей в использовании этого аналитического инструмента и излагает рабочий процесс для анализа EVs AFM, который включает в себя подготовку образца для визуализации EVs в гидратированной или высохлой форме, электростатическая иммобилизация пузырьки на субстрате, сбор данных, его анализ и интерпретация. Репрезентативные результаты показывают, что фиксация ЭВ на модифицированной поверхности слюды предсказуема, настраивается и позволяет пользователю получить результаты размеров для большого количества пузырьков. Было установлено, что размер везикула, основанный на данных AFM, согласуется с крио-TEM-изображением.
Введение
Внеклеточные пузырьки (Эпикулы) присутствуют во всех жидкостях организма, включая кровь, мочу, слюну, молоко и амниотическую жидкость. Экзосомы образуют районный класс EVs, отличаемый от других ЭВ эндосомальным биогенезом, маркерами эндосомного пути и наименьшим размером среди всех ЭВ. Размер экзосом часто сообщается с существенной изменчивостью между исследованиями. Результаты размеров были признаны зависимыми от метода, что отражает разницу в физических принципах, используемых различными аналитическими методами для оценки размеров EV1,2. Например, анализ отслеживания наночастиц (NTA) - наиболее широко исполь....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Изоляция ЭВ от биожидкости
- Изолировать EVs одним из установленных методов, таких как дифференциальная ультрацентрифугация8, осадки, или размер исключения хроматографии9.
- Подтвердите наличие ожидаемых поверхностных и светящихся биомаркеров и отсутствие биомаркеров, указывающих на перекрестное загрязнение препарата. Подтвердите морфологию липидного двухслойного морфологии изолированных частиц с помощью электронной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: При изоляции экзосом, распределение гидродинамических размеров измеряется анализом отслеживания наночастиц (NTA) или динамическим рассеянием све....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Поверхностная фиксация ЭВ является критическим шагом в последовательности изображений. Электростатическая иммобилизация экзосом, которые, как известно, обладают отрицательным потенциалом зеты, будет надежно происходить после того, как субстрат слюды будет модифицирован, чтобы иметь положительный поверхностный заряд. Без лечения с NiCl2, чтобы придать положительные изменения поверхности, иммобилизация EVs на субстрате было признано неэффективным. Высота изображения на рисунке 10A, .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Иммобилизация ЭВ из биологической жидкости, сканирование поверхности и анализ изображений являются основными шагами разработанного протокола для характеристики AFM ВВ в жидкости. Количество пузырьков поддается весы изображения AFM с изображением области поверхности и концентрации поверхности пузырьков обездвижены на субстрате. Учитывая отрицательный потенциал zeta EVs и экзосомы18, мы выступаем за электростатическую фиксацию EVs из жидких образцов к субстрату AFM. Иммобилизация эффективна, когда п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы признают финансовую поддержку со стороны Национального научного фонда (номер премии IGERT-0903715), Университета штата и технологии (стипендий Сколтеха).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Контроллер AFM/STM | Многорежимный наноскоп Bruker V | Этот контроллер АСМ поддерживает визуализацию биологических образцов в жидкости и воздухе. | |
| Металлические диски для образцов AFM/STM (10 мм) | TedPella | 16207 | Металлический диск для образцов, на который слюдяной диск крепится двусторонним скотчем или другим способом. |
| Диски из слюды AFM/STM (10 мм) | TedPella | 50 | Слюда высшего качества V1, толщина 0,21 мм (0,0085 дюйма). Прослоенные, в упаковках по 10 штук. Может быть установлен на диски AFM/STM. Выпускаются в четырех диаметрах |
| АСМ зонд для визуализации в воздухе | Bruker | TESP-V2 | Высококачественные прдожды из травленого кремния для режима нарезания резьбы и бесконтактного режима для сканирования в воздухе. |
| AFM зонд для визуализации мягких образцов в жидкости | Bruker | MLCT | Мягкие консоли из нитрида кремния с наконечниками из нитрида кремния, которые хорошо подходят для работы с жидкостями. Диапазон силовых констант позволяет пользователям получать изображения чрезвычайно мягких образцов в контактном режиме, а также в спектроскопии с высокой нагрузкой и расстоянием. |
| Двухсторонний скотч | Spectrum | 360-77705 | Используется для фиксации слюдяного диска на металлическом диске образца. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC – это запатентованный набор на основе полимеров, предназначенный для выделения экзосом из питательных сред тканей. |
| Держатель АСМ стеклянного зонда для визуализации в жидкости | Bruker | MTFML-V2 | Этот держатель стеклянного зонда предназначен для сканирования в жидкости с помощью многорежимной АСМ. Держатель можно использовать в режиме нарезания резьбы по пиковой силе, контактном режиме, режиме нарезания резьбы и модуляции усилия. Пробник акустически приводится в действие отдельным пьезогенератором для модуляции большей амплитуды. Держатель поставляется с двумя портами, необходимыми фитингами и комплектом аксессуаров для добавления и удаления жидкостей. |
| Чешский метрологический институт | в Гвиддионе | Версия 2.52 | Программное обеспечение с открытым исходным кодом для визуализации и анализа полей данных, полученных методами сканирующей зондовой микроскопии. |
| Безворсовая промокательная бумага | GE Healthcare Whatman | Марка GB003 Промокательная бумага | Используйте эту промокательную бумагу для удаления NiCl2 после модификации подложки слюды. |
| Безворсовые салфетки для чистых помещений | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Используйте эти салфетки из полиэстера для очистки поверхностей. |
| Хлорид никеля(II) (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Порошок, используемый для производства 10 мМ NiCl2 в воде DI |
| Фосфатный буферный физиологический раствор (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7,4 |
Ссылки
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
