Анализ митохондриальной дыхательной цепи комплексов в культивируемых клеток человека, используя синий родной электрофореза геля полиакриламида и Immunoblotting

Митохондрии являются многофункциональными органеллы, играет важную роль в производстве энергии, регуляции клеточного метаболизма, сигнализаторы, апоптоз, старение,^2,1,и т.д.³. Производство энергии в митохондриях полагается на функции окислительного фосфорилирования, пары дыхания с синтез АТФ. В клетках человека митохондриальных Оксидативное фосфорилирование системы (OXPHOS) состоит из пяти комплексов. Комплексы-IV создание электрохимических протонного градиента в пространстве митохондриальных межмембранное, который используется для производства АТФ, комплекс V. Каждый комплекс OXPHOS-multimeric и, за исключением комплекс II, состоящий из субъединиц, кодируется как ядерных, так и митохондриальных генов. Любые дефекты в основные компоненты OXPHOS комплексов, вызванные мутации или экологический стресс может повлиять Ассамблеи и функциональность системы окислительного фосфорилирования. Кроме того надлежащее Ассамблея функциональных комплексов OXPHOS требуется большое количество Ассамблеи факторы^4,5,6.

Синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-PAGE) является включение анализа нетронутыми белковых комплексов фундаментальных техника и могут быть использованы для изучения Ассамблея OXPHOS комплексов. Во-первых митохондрии изолированы от клеток, digitonin, который является мягким моющим средством, которое permeabilizes плазматической мембраны клеток. Затем используя maltoside лаурилсульфат, OXPHOS комплексы освобождаются от митохондриальной мембраны. С помощью градиента электрофорез, OXPHOS комплексы разделены согласно их массы. Кумасси синий G-250 (не R-250) добавлены в буфер образца и синий катод буфера разъединяет моющее средство лабильного ассоциаций, но сохраняет отдельные дыхательной цепи комплексы нетронутыми⁸. Во время электрофорез синий катод буфер, содержащий краситель заменяется на катод буфера без красителя, который обеспечивает эффективную передачу OXPHOS комплексов PVDF мембрану⁸. Чтобы визуализировать OXPHOS комплексов, PVDF мембрану последовательно инкубировали с антителами, соответствующие выбранной подразделений пяти OXPHOS комплексов.

Метод, описанный здесь, с некоторыми изменениями может применяться к любой культивируемых клеток. Кроме того этот метод может использоваться для анализа OXPHOS комплексов в митохондриях, изолированных от образцов ткани⁹. BN-страница требует по крайней мере 5-10 мкг митохондрий для каждого образца, в перспективе. Используя метод, описанный здесь, 500000 культивируемых клеток, таких как HEK293, SH-SY5Y или 143B клетки могут принести около 10 мкг митохондрий. Однако достаточное количество клеток для анализа млрд зависит от типа конкретные ячейки.

Наиболее распространенным способом для изучения белков митохондриальных OXPHOS, SDS-PAGE и Западный blotting. Однако SDS-PAGE позволяет изучать только отдельные подразделения OXPHOS и, в отличие от БН-страницы, не может использоваться для оценки Ассамблея весь OXPHOS комплексов. Ясно, родной страница отделяет белковых комплексов в родной условий отрицательно заряженных красителя без присутствия и имеет значительно более низкое разрешение по сравнению с БН-страницы. Однако ясно родной страница мягче, чем BN-страницы так, что он может сохранить лабильной супрамолекулярные сборки белковых комплексов, таких как OXPHOS supercomplexes, которые отделены под условия BN-страница¹⁰. В этом протоколе градиент гель используется для разделения комплексов; Однако в качестве альтернативы,-градиент разделения может использоваться если относительно дорогих градиента maker является не наличие¹¹.

Важно, в описанный здесь метод позволяет анализировать Ассамблея OXPHOS комплексов, в то время как функциональность комплексов не оценивается. Высоким разрешением BN-страница следуют в гель деятельности пробирного¹¹ , а также пробирного спектрофотометрические ферментативной активности митохондриальных комплексов¹² являются эффективные методы для функционального анализа OXPHOS комплексов. Однако оба этих методов не пробирного Ассамблея OXPHOS комплексов.

Таким образом BN-страница является оптимальный метод расследовать Ассамблея отдельных OXPHOS комплексов. Например некоторые митохондриальных расстройств, таких как Лебер наследственной оптической невропатии (LHON), митохондриальных энцефалопатия с молочно-кислый ацидоз и инсульта подобных эпизодов (MELAS), связаны с изменены Ассамблеей одного или более компонентов OXPHOS система⁵. С помощью BN-страницы метод, описанный здесь, могут быть изучены молекулярных механизмов митохондриальных болезней.

spaNOTE: этот протокол основан на связанной публикации Hilander et al.¹³ .

1. Подготовка буферов и решения

Примечание: Все буферы и решения, используемые в протоколе кратко излагаются в таблице 1. Данного тома буферов достаточно для подготовки и запуска 10 образцов. Все буферы могут храниться при температуре + 4 ° C на срок до одного года.

1. Подготовка 20 мл 3 x гель буфер, содержащий 1,5 М Аминокапроновая кислота, 150 мм бис трис в дистиллированной воде (dH₂O). Отрегулируйте пэ-аш до 7.0.
2. Подготовка 10 мл 2 М Аминокапроновая кислота в dH₂O.
3. Подготовка 1 мл митохондриальной буфера, объединяя следующие: 0,5 мл 3 x гель буфера, 0,5 мл 2 М Аминокапроновая кислота и 4 мкл 500 мм ЭДТА.
4. Подготовка 1000 мл катод буфер, содержащий 15 мм бис-трис и 50 мм Трицин dH₂O. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0.
   1. Подготовка 200 мл синий катод буфера путем добавления 0,04 г G-250 Кумасси синий 200мл катод буфера.
5. Подготовка 1000 мл Анодный буфер, содержащий 50 мм бис трис dH₂O. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0.
6. Подготовить 2,5 мл буфера выборки, содержащий 750 мм Аминокапроновая кислота и 5% Кумасси синим G-250 в dH₂O.

2. Подготовка митохондриальной лизатов

1. Пластина клетки за день до коллекции. Для HEK293 или 143B клеток использование Дульбекко изменение средних орла (DMEM) с плода бычьим сывороточным 10%, 1% L-глютамин, 100 мг/мл пенициллина и стрептомицина 100 мг/мл. Рост клеток в инкубатор культуры клеток при 37 ° C в 5% CO₂ увлажненные атмосфере. Убедитесь, что есть по крайней мере 500 000 клетки для каждого образца в день сбора.
2. Осторожно промойте клетки один раз с ледяной PBS. Избегайте отключения клетки от плиты. Скрип клетки и Пелле их на 800 x g 10 мин при температуре + 4 ° C.
3. Помыть лепешка клетки дважды с ледяной PBS и центрифуги как в шаге 2.2. Измерьте концентрацию белка с методом Брэдфорд, с использованием коммерческих комплект. Пелле клетки на 800 x g 10 мин при температуре + 4 ° C.
   Примечание: После сбора клеток, выполните все шаги при + 4 ° C и делать не вихря.
4. Подготовка 20 мл PBS с ингибитором протеазы, добавив 200 мкл ингибитора протеазы 100 x 20 мл ФСБ. Держите на льду. Ресуспензируйте клетки в PBS с ингибитором протеазы окончательный белка концентрацию 5 мг/мл.
   1. Чтобы вычислить объем PBS с ингибитором протеазы, необходимых для Ресуспензируйте клетки на 5 мг/мл, Рассчитайте количество белка в каждом образце. Для этого расчета используйте концентрацию протеина измеряется в шаге 2.3 и объем PBS для Ресуспензируйте клетки после стирки на шаге 2.3.
5. Готовим 1 мл digitonin 3,3 мм в PBS с ингибитором протеазы. Добавьте digitonin 3,3 мм в конечной концентрации 1,65 мм. Хорошо перемешайте и инкубировать на льду на 5 мин.
   1. Подготовить 1 мл digitonin 3,3 мм в PBS с ингибитором протеазы, Растворите 4 мг, digitonin в 1 мл PBS на 100 ° C до тех пор, пока не осадок видимым и прохладный на льду немедленно. Добавьте 10 мкл ингибитора протеазы 100 x 1 мл digitonin раствора.
      Примечание: Используйте только свежий раствор digitonin.
      Предупреждение: Digitonin токсичных! Используйте маски, перчатки и халате.
6. Добавьте PBS с ингибитора протеиназы (подготовленных на шаге 2.4) окончательный объем 1,5 мл. Центрифуга на 10000 x g 10 мин на + 4 ° C. Удалите супернатант. В этом шаге гранулированных митохондрий.
7. Ресуспензируйте митохондриальной Пелле в митохондриальной буфера. Объем митохондриальной буфера составляет половину объема PBS на шаге 2.4.
8. Подготовьте свежие maltoside лаурил 10% в PBS, содержащий ингибитор протеазы (подготовленных на шаге 2.4). 1 мл достаточно для 10 образцов. Добавьте 10% лаурил maltoside в конечной концентрации 1%. Инкубируйте на льду 15 мин (этот шаг может быть дольше, вплоть до нескольких часов).
9. Центрифуга на 20000 x g 20 мин на + 4 ° C. Соберите супернатант в новую трубу. Измерьте концентрацию протеина Брадфорд методом с использованием комплекта. Добавьте буфер образца, половина объема лаурил maltoside, используемые на шаге 2.8 тома. Образцы можно хранить при температуре-80 ° C на срок до 6 месяцев.

3. Подготовка градиентного гель BN-страницы

1. Залейте градиент гель для БН-страница при комнатной температуре. Место градиента чайник на плите перемешать и подключить его с гибкие шланги перистальтического насоса. Прикрепите инфузионный набор с иглой для труб. Место магнитной мешалкой в проксимальном палаты создатель градиента. Вымойте трубки с dH₂O на скорость максимальная насоса за 10 мин.
2. Очистите трубку и создатель градиента. Использование пипетки для удаления любых оставшихся dH₂O в канале между палатами создатель градиента. Закройте канал и труб с клапаном.
3. С помощью литья кадра и зажимы собрать две стеклянные пластины в держатель, который имеет отверстие на дне, и поместите его на стенде. Убедитесь, что это более или менее на прямой поверхности с водного баланса. Место иглы подключен к трубе между пластинами стекла.
4. Подготовка решения гелем 6% и 15% (Таблица 2). Держите на льду. Добавить Аммония персульфат (APS) и tetramethylenediamine (TEMED) (они начинают полимеризации) последний. Смесь осторожно, чтобы избежать воздушных пузырей.
5. Загрузите проксимальный конец градиента гель смеситель трубки камеры с 6% гель и дистального конца 15% гелем. Общий объем геля должен быть равен объем отделяя гель между пластинами стекла. Таким образом используйте 2,6 мл 6% геля и 2.1 мл 15% гель для градиента гель смеситель для одной 8.3 x 7,3 см размеру геля.
6. Перейдите на магнитную мешалку и откройте труб и каналов между палатами создатель градиента. Сразу же включите насос перистальтический до 5 мл/мин заполнить стеклянные пластины и не позволяют пузыри, чтобы ввести гель. Удалите иглу, когда есть не гель в трубке.
7. Аккуратно наложение гель с dH₂O. держать при комнатной температуре по крайней мере 1 час для полимеризации геля.
8. Сразу же после заливки геля, промойте трубы, заполнив градиента камер с dH₂O и с использованием перистальтического насоса на максимальной скорости. При подготовке двух и более гели, всегда чистые системы между ними.
9. Подготовка 1 x гель буфера путем смешивания 3 мл 3 x гель буфера и добавить 6 мл dH₂O. Remove dH₂O от поверхности геля с фильтровальную бумагу осторожно. Промойте поверхность геля с 1 x гель буфера. Осторожно извлеките 1 x гель буфер с фильтровальной бумаги.
   1. Избегайте волокон из фильтровальной бумаги на геле. Для обеспечения этого, разрежьте бумагу на мелкие кусочки с ножницами, но не Оторвите бумагу.
10. Поместите гребенку между пластинами стекла, но не погружайте его полностью, чтобы иметь возможность залить штабелируя гель под гребенку. Подготовка 4%, укладка гель (Таблица 2). Добавить APS и TEMED последний как они начинают полимеризации легко. Смесь осторожно избегая пузырьков воздуха.
11. Наложение штабелируя гель, избегая пузыри под расческу и полностью погрузите насадку. Пусть штабелируя гель полимеризоваться, по крайней мере 30 минут снимите гребень и Промыть лунки с 1 x гель буфер с помощью пипетки.
    1. После полимеризации гель может храниться при температуре + 4 ° C на пару дней. Чтобы хранить гель, оберните геля в бумаги, пропитанной с dH₂O и пластиковые пленки для предотвращения высыхания геля.

4. синий родной гель-электрофорез

Примечание: Для предотвращения деградации OXPHOS комплексов запустить электрофореза при + 4 ° C. Используйте предварительно охлажденные буферов.

1. Загрузите гель кассету с буфером синий катода до нижней части скважины. Загрузка образцов легче, когда кассета заполнена не в верхней. Промыть скважин с голубой катод буфера, а затем заполнить скважин с голубой катод буфер с помощью пипетки.
2. Загрузите образцы (5-30 мкг белка) в скважинах. Аккуратно заполните гель кассету в верхней голубой катод буфер и бак с анодном буфере.
3. Побегите гель 15 мин при постоянном напряжении 40 V. Затем увеличить напряжение до 80 V (или использовать постоянный ток 6 мА), не превышает 10 мА. Побегите гель до тех пор, пока краска достигает 2/3 длины геля.
4. Замените синий катод буфер буфера катода и продолжить электрофореза, до тех пор, пока краска фронт истекло. В общей сложности электрофорез занимает около 3 часов.
5. Извлечение стеклянные пластины и передать белки винилидена фторида (PVDF) мембраны полусухим промокательной. Используйте постоянное напряжение 25 вольт и ток ограничивается 1,0 A за 30 мин.
   1. Кроме того используйте мокрый промокательной передать PVDF мембрану OXPHOS комплексов.
6. Продолжите блокирование мембраны и Антитело инкубации согласно стандартным immunoblotting протокол. Использование основного антитела против подразделений OXPHOS комплексов последовательно.
   Примечание: К примеру, используйте антитела анти NDUFA9 (1: 2000) для комплекса I, антитела анти SDHA (1: 2000) для сложных II, антитела анти UQCRC2 (1: 1000) для сложных III, антитела (1: 2000) анти-COX1, так для сложных IV и анти ATP5A антитела (1: 2000) для комплекса V. Список антител представлена в Таблице материалов.

BN-странице, могут быть исследованы дефекты в Ассамблее митохондриальной OXPHOS комплексов. Рисунок 1A показывает Ассамблея дыхательной цепи комплексов в человеческой нейробластомы клеток (SH-SY5Y) относились с хлорамфениколом, который конкретно запрещает преобразование митохондриальной ДНК кодировке OXPHOS подразделений. Хлорамфеникол обедненного OXPHOS комплексов, которые содержали mitochondrially кодировке субблоков (комплекс I, III, IV; Рисунок 1A), в то время как комплекс II, который кодируется исключительно ядерных генов, беспрепятственно был upregulated. Комплекс V был не immunoblotted здесь.

Несколько циклов замораживания оттаивания уничтожить OXPHOS комплексов. Рисунок 1B демонстрирует деградации OXPHOS комплексов циклов замораживания оттаивания. Митохондриальной дыхательных комплексов в примере 3, которые подверглись несколько циклов замораживания оттаивания имеют снижение интенсивности группы и сдвинуты по сравнению с же образцы, которые были заморожены только один раз. Невозделываемых иммуноблоттинга изображение Рисунок 1B приводится в дополнительных Рисунок 1.

Качество гель имеет важное значение для четкого и полос. Рисунок 1 C показывает immunoblot от гель, который не сделал хорошо полимеризоваться. Также зачистки мембраны может повлиять на определение OXPHOS комплексов. На рисунке 1 Dсложные я был обнаружен до или после зачистки. Соотношение сигнал-шум намного ниже после зачистки.

Рисунок 1. BN-страница иммуноблотов от успешных и субоптимальных экспериментов. (A) истощение OXPHOS комплексов ингибиторов митохондриальных перевода. Человеческой нейробластомы клетки (SH-SY5Y) относились с хлорамфениколом (CAP) на 48 часов. CTRL, клетки управления без лечения хлорамфеникола. Нижней панели показывает количественная оценка immunoblot. Значение элемента управления берется как 1 (отображается как пунктирная линия). Данные представлены как означает ± SD, n = 3, * P < 0,0001 по сравнению с использованием управления непарные студента t тесты. (B) нарушение OXPHOS комплексы на несколько циклов замораживания оттаивания. Образцы 1-3 были подготовлены от человека остеосаркома клеток (143B) в тех же условиях. Образцы номер 1 и 2 были заморожены и плавится только один раз, в то время как пример №3 прошли четыре циклов замораживания оттаивания. (C) BN-страница иммуноблотов OXPHOS комплексов, изолированный от HEK293 клеток. Смазывание полос обусловлено низкое качество геля. (D) эффект зачистки на обнаружении OXPHOS комплексов. Определение комплекса в человеческой нейробластомы клеток (SH-SY5Y) до и после зачистки же мембраны. OXPHOS комплексы были обнаружены с помощью антител анти NDUFA9 (комплекс я), антитела анти SDHA (комплекс II), антитела анти UQCRC2 (комплекс III) и антитела анти-COX1, так (комплекс IV). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1. Буферы и решения, используемые для БН-страницы.

Таблица 2. Рецепты гель для БН-страницы.

Дополнительные Рисунок 1. невозделываемых иммуноблоттинга образ Рисунок 1B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Отсутствие конфликта интересов объявил.