Внеклеточная матрица модель трехмерных костей для остеосаркомы

Summary

Кость внеклеточного матрикса (BEM) модель для остеосаркомы (ОС) является хорошо установленным и показано здесь. Он может использоваться как подходит леска подражая первичной опухоли роста в пробирке и предоставления идеальная модель для изучения гистологическое и цитогенетических неоднородность OS.

Abstract

Остеосаркома (ОС) является наиболее распространенным и высоко агрессивной первичной костной опухоли. Она характеризуется с анатомическими и гистологические варианты диагностических и прогностических трудности. OS включает в себя genotypically и фенотипически гетерогенных раковых клеток. Кость микроокружения элементы обоснованы с учетом неоднородности и болезнь прогрессии опухоли. Кость внеклеточного матрикса (BEM) сохраняет микроструктурных матрицы и биохимических компонентов родной внеклеточного матрикса. Ткани специфические ниши обеспечивает благоприятные и долгосрочные леску для OS ячейки посева и распространения. Эта статья предоставляет протокол для подготовки БЭМ модели и ее дальнейшее экспериментальное приложение. OS клетки могут расти и дифференцироваться в несколько фенотипы с гистопатологические сложности OS клинических образцов. Модель также позволяет визуализировать различные морфологии и их ассоциации с генетическими аномалиями и основные механизмы регулирования. Как гомологичных человека ОС эта модель БЭМ-OS может разработана и применяется к патологии и клинических исследований ОС.

Introduction

Остеосаркома (OS) обычно происходит в активно растущих областей, метафизе длинных костей, в подростковом возрасте. Более 80% пострадавших от OS сайты имеют предпочтение метафиз проксимального отдела голени и проксимального отдела плечевой кости, а также проксимальных и дистальных бедра, соответствующее расположение роста пластина¹. OS включает в себя несколько подтипов клеток с мезенхимальных свойствами и значительное разнообразие в Гистологические особенности и класс. Свидетельства поддержки мезенхимальных стволовых клеток (МСК), остеобласты совершено прекурсоров и pericytes как клетки происхождения-^2,-^3,-^4,-⁵. Эти клетки могут накапливаться генетических или эпигеномные изменения и привести к OS под влиянием некоторых костей microenvironmental сигналов. Внутренние и внешние механизмы в результате геномная нестабильность и неоднородность ОС, с несколько морфологических и клинических фенотипов^6,7. Для индивидуальной терапии или скрининга новых лекарственных препаратов Роман модели должен быть сгенерирован для против неоднородность или других клинических расстройств.

OS-внутри костной злокачественная опухоль твердых. Сложность и активности окружающих микроокружения элементы предоставляют фенотипических и функциональные различия по OS клеток в разных местах опухоли. Кость внеклеточного матрикса (BEM) обеспечивает структурных и биохимические леску для осаждения минеральных и костного ремоделирования. Органической частью внеклеточного матрикса (ECM), главным образом состоит из типа я коллагена выделяется клетками osteoblastic линии, в то время как его минерализованных часть состоит из фосфата кальция в виде гидроксиапатита⁸. Динамическая роль ECM сетей заключается в регулировании клеточной адгезии, дифференциация, кросс talk и ткани функции обслуживания⁹.

Деминерализованная БЭМ и ECM гидрогели были успешно использованы в культуре клеток и может повысить клетки распространения^10,11. Синтезированные кости как ECM может регулировать размер пула, судьба решения и линии прогрессирование MSCs^12,,1314. Кроме того результаты свидетельствуют его клиническое значение для предоставления Остеогенные деятельности путем стимулирования клеточных процессов во время кости формирования и регенерации^15,16,17.

В этой статье наша группа устанавливает модифицированная модель и благоприятной альтернативой для трехмерных долгосрочные культуры. OS клетки вводят в ткани производные БЭМ представляют гетерогенно мезенхимальных фенотип легко по сравнению с пластиковой двумерных культур. BEM производным от участкам гомологичной ткани показать его драматические преимущество как родной ниши для OS клетки в пробирке и имеет большой потенциал в OS теоретических и клинических исследованиях. Эта платформа характеризуется BEM является простой, но эффективный в vitro исследования и может быть продлен в моделировании нескольких видов рака.

Protocol

Уход за животными и использования проводятся согласно национальных институтов здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных (публикация NO.80-23, пересмотренной в 1996 году низ) после утверждения от животных этики Комитета Sun Yat-sen University.

1. кость подготовки

1. Получите 4-6 week-old мышей BALB/c (без конкретного пола требование). Усыпить мыши асептически, вывих шейного и отрезать свежие малоберцовой кости, голени и бедра от задних конечностей с стерильные хирургические ножницы. Отделите эпителиальной ткани и затем удалить как можно больше мягких тканей, как можно, используя ножницы и щипчики.
2. Промывайте кости ноги с стерильные 10 мм-фосфатный буфер (PBS) дважды, чтобы удалить крови в 6 см блюдо. Погружать костей в 75% этанола на 3 мин, затем ополосните с PBS дважды. Чистой кости могут храниться в стерильных 50 мл пластиковых пробирок с стерильных PBS-80 ° c для месяцев, до тех пор, пока требуется.
   Примечание: PBS, используются в следующих шагах имеет 10 мм PO₄³⁻.

2. кости деминерализации и decellularization

1. Оттепель замороженных костей при комнатной температуре, а затем заморозить снова в-80 ° C, за 1 ч., подлежащих костей более чем 2-3 циклов замораживания оттаивания для клеток тканей и лизис пробоя.
2. Инкубировать костей в стерильных 50 мл пластиковых пробирок с 0,5 N HCl на ночь при комнатной температуре на качания платформы или орбитальный шейкер с нежным качания/пожимая для обеспечения полной и даже костей.
   Примечание: Убедитесь, что кости полностью погружен во время движения в кислоты и не соглашайтесь во время процесса. Объем раствора HCl должен быть более чем в десять раз, что из костей.
3. После декальцинации декантируют раствор HCl полностью и промойте под струей воды 1 ч. Затем вымойте кости дважды за 15 мин за промыть дистиллированной воды на качалки платформы или орбитальный шейкер.
   Примечание: Убедитесь, чтобы полностью удалить раствора или воды между моет и после окончательной стирки с дистиллированной водой.
4. Извлечение липидов в деминерализованной кости с 1:1 смесь метанола и хлороформ в 50 мл пластиковых пробирок завернутый с фольгой олова для 1 ч при комнатной температуре¹⁰.
5. Затем передачи костей в другую трубу метанола, завернутый с фольгой олова 30 мин полностью удалить метанола и смойте дистиллированной воды дважды за 15 мин с нежно тряска. Сцеживаться окончательный мыть водой и выполните следующие шаги в стерильных условиях.
   Примечание: Во время извлечения шага, свет необходимо избегать предотвратить разложение хлороформ. Смесь может храниться в светостойкими контейнере или пластиковых пробирок завернутый с фольгой олова. Выполнить все обращения и мыть шаги под скромным вращение или качалки движения.
6. Промыть кости в 6 см блюдо с стерильных PBS на 3 мин, а затем передать кости в новых центрифуг Тюбик 50 мл. Добавьте 40 мл стерильного 0,05% трипсина ЭДТА (TE) в трубку и инкубировать кости для 23 h в инкубатор CO₂ при 37 ° C¹⁸.
7. Отменить решение TE и дважды промыть стерильной PBS, дополненная 90 мкг/мл Ампициллин и канамицин 90 мкг/мл. После декантирующие финал Вымойте PBS полностью, пополнить с 40 мл стерильного PBS. Вымойте тщательно за 24 ч при комнатной температуре с нежным тряся или тряска для антибиотиков замочить.
   Примечание: Все стерильные PBS, используемый в этом и следующих шагов содержит 90 мкг/мл Ампициллин и канамицин 90 мкг/мл. Ночь мыть под вращение или качалки движения выполняются для длительных периодов тщательного погружения с помощью антибиотиков для достижения эффективной стерилизации поры.
8. Удаление PBS и передачи кости в свежий 50 мл пластиковых пробирок наполнены стерильный PBS. Приготовленные деминерализованной и decellularized костей, называются кости внеклеточного матрикса (BEM) и может храниться при температуре 4 ° C на 2 месяца, до тех пор, пока требуется.

3. сотовый посева и культура

1. Возьмите БЭМ из 4 ° C холодильник и погрузите его в этанол 75% для 30 s, а затем промыть PBS дважды. Передача БЭМ на тарелку чистой 6-ну клетки культуры. Добавьте 2 мл полной питательной среды (Дульбекко изменение орла среднего/F12 (DF12) содержащий плода бычьим сывороточным 5%, 90 мкг/мл Ампициллин и канамицин 90 мкг/мл). Инкубировать БЭМ на ночь в инкубатор CO₂ при 37 ° C.
2. Получите людей OS клеточных линий (МННГ/HOS и мг-63). Приостановить приблизительно 1.0 x 10⁵ OS клетки с PBS 100 мкл, содержащих фенол красный индикатор.
   Примечание: Чтобы лучше отслеживать и наблюдать многослойных клетки внутри трехмерной модели BEM, МННГ/HOS и мг-63 заражены лентивирусные вектора выражения флуоресцентный mCherry и Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП).
3. После БЭМ полностью замачивают в среде, придать OS клетки БЭМ от проксимальный и дистальный эпифиз когда игла достигнет полости мозгового БЭМ. Инкубировать OS-BEM модель для минимум 2 ч в увлажненные 5% CO₂ атмосфера при 37 ° C для обеспечения вводили клетки твердо придерживаться БЭМ.
   Примечание: Предварительно теплой все средства массовой информации, используемые для клеточной культуры. Инкубатор для культуры клеток имеет увлажненные 5% CO₂ атмосфера при 37 ° C.
4. Добавить 1 мл полной питательной среды в пластину, чтобы полностью покрыть поверхность БЭМ культуры на ночь в инкубатор CO₂ при 37 ° C.
5. Аккуратно перенесите ОС-BEM модель в новой скважины 6-ну пластины с стерильный пинцет и refeed 1 мл свежей питательной среды. Культура модели на 14 дней в инкубатор CO₂ при 37 ° C и обновите питательной среды согласно ситуации распространения ОС клеток.
6. Держите состоянием средний цвет и клеток под микроскопом Перевернутый флуоресценции во время процесса культуры. Когда OS клетки расширяться к пластине, аккуратно перенести ОС-BEM модель в другую новых хорошо с стерильный пинцет.
   Примечание: Питательной среды является ярко-красный в рН 7,4, оптимальный рН для наиболее млекопитающих клеточной культуры. Если носитель превращается в желтый, оранжевый или даже, немедленно обновите средство для поддержания здоровой окружающей среды для OS клеток.
7. Передача ОС-BEM модель в новой скважины с помощью пинцета и осторожно промойте PBS для удаления питательной среды. Затем перевести в 15 мл пластиковых пробирок и исправить с формалина 10% буферизации для гистологической идентификации.

Results

После установки деминерализации и decellularization BEM, по-видимому, полупрозрачные, с сильной стойкость и упорство, по сравнению с родной мыши кости. Немного мышцы остатков и пространство медуллярного полости можно ясно наблюдать (рис. 1A, B). Чтобы определить эффективный decellularization BEM, Бэм заливали в парафин после фиксации и затем нарезанный в разделы 3-5 мкм для гематоксилином эозином (H & E) окрашивания. Тщательного удаления клеточных ядер показано светлые о...

Discussion

Как правило ОС могут быть классифицированы как osteoblastic, chondroblastic и fibroblastic подтипов в зависимости от ее доминирующей гистологических компонента. Его прогноз зависит не только от гистологических параметров, но и на своем сайте анатомические. Это может произойти внутри костей (в Интрамедуллярные или intracortical отсека), на поверхности костей и в extraosseous сайты¹⁹. Появление и неоднородность ОС можно освещены как спряжение онкогенных событий и адекватной microenvironmental импульс...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 мл центрифужная пробирка	Greiner	188271
50 мл центрифужная пробирка	Greiner	227270
6 см чашка для клеточных культур	Greiner	628160
6-луночная пластина	Greiner	657160
ампициллин	Sigma-Aldrich	A9393
C57-BL/6J мышь	Сунь Ятсен Университетская лаборатория Animal Center
CO2	SHEL LAB	SCO5A
Двухосновной фосфат натрия	Гуанчжоу Завод химических реактивов	BE14-GR-500G
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Фетальная бычья сыворотка	Гиклон	SH30084.03
Гемоцитометр	BLAU	717805
Канамицин	Сигма-Олдрич	PHR1487
MG-63	Китайская академия наук, Шанхайский банк		Клеточная линия остеосаркомы человека
MNNG/HOS	Китайская академия наук, Шанхайский банк		Клеточная линия остеосаркомы человека
Фенол красный	Sigma-Aldrich	P4633	В качестве индикатора pH используется раствор фенольного красного: его цвет демонстрирует постепенный переход от желтого к красному в диапазоне pH от 6,6 до 8,0.
Хлорид калия	Sangon Biotech	A100395
фосфат калия одноосновные	Sangon Biotech	A501211
хлорид натрия	Sangon Biotech	A501218