Методическая статья

Протокол изоляции капелька быстрого липидов используя налаженные органеллы изоляции комплект

DOI:

10.3791/59290

⸱

19 апреля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот Протокол устанавливает новый метод изоляции капелька липидов и очистки от мыши печень, используя набор для изоляции устоявшихся эндоплазматического ретикулума.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липидного капель (LDs) являются биологически органеллы в цитозоле наиболее эукариот и некоторые прокариотических клеток. LDs состоят из нейтральных липиды, заключенная в монослое белков и фосфолипидов. Печеночная LD липиды, церамиды, и белки причастны несколько заболеваний, которые вызывают печеночная стеатоз. Хотя предыдущие методы были созданы для изоляции LD, они требуют длительной подготовки реагентов и не предназначены для изоляции несколько субцеллюлярные отсеков. Мы стремились создать новый протокол для включения изоляции LDs, эндоплазматический ретикулум (ER) и лизосом из одной мыши печени.

Кроме того, все реактивы, используемые в протоколе, представленные здесь являются коммерчески доступными и требуют минимальной реагент подготовки без ущерба для LD чистоты. Здесь мы представляем данные сравнения этот новый протокол к стандартным сахарозы градиента протокол, демонстрируя сопоставимых чистоты, морфология и урожайность. Кроме того мы может изолировать ER и лизосомы, с использованием того же образца, обеспечивая подробное понимание формирования и внутриклеточных потока липидов и их связанные белков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LDs являются биологически органеллы в цитозоле наиболее эукариотических клеток и2,некоторые прокариотических клеток в1,3. LD ядро состоит из нейтральные липиды как эфиры холестерина и триглицеридов (ТГ). Они также содержат Церамиды, биоактивных липиды, участвующих в клеточном сигнальных путей4,5. LDs окружены фосфолипидного монослоя и покрытием с белками, включая perilipin белки perilipin 2 (PLIN2) и 3 (PLIN3)1,5,6. Также присутствуют lipogenic ферменты, липазы и мембранных белков людьми, которые были связаны с несколькими steatotic заболеваниях печени, включая безалкогольного наварного заболевания печени, алкогольная болезнь печени и гепатит C3,5 ,6,,78,9,10.

Подуманы, что LDs от внешней мембраны ER и содержат заново синтезированные TG, получены из11ER-производные свободных жирных кислот. Однако, остается неизвестным, ли Объединенные липиды бутон, остаются подключенными, или вырезана из ER6,11, делает изоляцию LDs от технически сложных ER. Свободные жирные кислоты могут быть освобождены от LDs действием поверхности липазы для производства энергии или синтеза мембранных. Кроме того может снизиться LDs через lipophagy механизм регулирования, а также производить свободные жирные кислоты12.

Помимо ER и лизосомы, есть другие органеллы — например, митохондрии, endosomes, пероксисомы и плазматической мембраны — которые находятся в тесной взаимосвязи LDs11. Этот плотный полигамии делает его трудным для выполнения чисто LD добычи. Тем не менее нейтральные липиды врожденной низкой плотности могут быть приняты преимущество через центрифугирования5.

Традиционно LDs были изолированы с помощью сахарозы плотность градиента1,5,13. Однако эти методы не предназначены для изоляции другие органеллы. Кроме того они требуют длительной подготовки реагентов. Этот протокол адаптируется коммерчески доступных ER изоляции комплект (см. Таблицу материалов) для изоляции LD. Мы используем извлечения буфер, предоставленный набор, добавив LD изоляции шаг. Кроме того протокол может также использоваться для ER и лизосомальных изоляции с помощью же образцы, позволяющие более подробное изображение жизненного цикла LDs. Чтобы проверить этот новый метод, мы пробирного выход LD, морфология, размер и чистоты. Мы сравниваем результаты, представленные здесь для тех, кто получил с широко используемый протокол, используя градиент сахарозы для изоляции LD.

Мы использовали 10 к 12-week-old, 20 g, женский C57BL/6 мышь постился 16 h (удаление продовольствия в 5:00 вечера время изоляции LD 9.00) с свободный доступ к воде. Типичный выход для TG 0.6 мг/г печени, и LD белка, это 0,25 мг/г печени. Это обеспечивает достаточно материала для ~ 10 иммуноблотов, SDS-страницы. Протокол ниже подробности реагентов, используемых и протокол для одного 1 g печени. Протокол градиента изоляции сахарозы заимствован из Сато14 и15Ву.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты проводились на лабораторном столе с личного защитного оборудования для биобезопасности уровня 1, включая лаборатории пальто, перчатки и защитные очки. Эксперименты были проведены согласно протоколов, одобренных институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Пенсильвания. Все усилия были сделаны для сведения к минимуму дискомфорт животных, а Животные лечились с гуманной помощи.

1. LD изоляции с помощью набора для изоляции ER

  1. Подготовка
    Примечание: Перечисленные суммы подходят для одного 1 g мыши печени.
    1. Подготовка 10 мл 1 x изотонический экстракция буферу (IE, из комплекта изоляции ER) путем разбавления 2 мл 5 x IE буфера с 8 мл ультрачистая вода. Прохладный буфера, поместив его на льду.
    2. Подготовка путем разбавления 10 мл 10 x PBS в 90 мл ультрачистая вода 100 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Охладить его, поместив его на льду.
    3. Подготовка 10 мл 5% полиэтиленгликоль p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-фенил эфира (PGPE) путем разбавления 500 мкл PGPE в 9,5 мл ультрачистая вода. Используйте 1 мл шприц для измерения из PGPE как это вязка. Охладить его, поместив его на льду.
    4. Прохладный все трубы, поместив их на льду: трубы microcentrifuge 1,7 мл, 15 мл пробирок, 50 мл высокоскоростной пробирок и 13 мл ультрацентрифуга трубы.
    5. Прохладный все необходимые центрифуги до 4 ° C: microcentrifuge, высокопроизводительные центрифуги для 15 мл пробирок, Высокоскоростные центрифуги для 50 мл трубки и ультрацентрифугирования.
    6. Стерилизация автоклавированием щипцы и Рассечение ножницами.
  2. Подготовка тканей
    1. Усыпить мыши, поместив его в камере заполнены с 100% CO2 на 10 мин подтверждение эвтаназии, выполняя шейки матки дислокации.
    2. Использование стерильный пинцет и Рассечение ножницами, вырезать слои кожи и мышц живота на задней/передней оси подвергать печени.
    3. Вырежьте связки подключения печени диафрагмой и кишечника. Используйте пинцет, чтобы вытащить кишечника от печени, направлении кзади, подвергать связок.
    4. Режут между печени и спинной грудную клетку, переходя от впереди кзади до печени высвобождается.
    5. Передать печени холодной 5 см Петри с 10 мл холодного ПБС.
    6. Вымойте печени 2 x на качающейся платформе в 10 мл холодного ПБС 5 минут при температуре 4 ° C в 5 см Петри. Слить ПБС после окончательной стирки.
    7. Используйте стерильные хирургические лезвия размер-10 (см. Таблицу материалы) нарезать печень на куски 3 – 5 мм в 5 см Петри (рис. 1A).
    8. Мыть кубиками печени 2 x 10 мл холодного ПБС 5 минут при температуре 4 ° C в 5 см Петри.
      Примечание: Для изоляции Лизосома, передать гомогенизатор чистой 45 мл 0,5 г печени и следуйте инструкциям, поставляемых лизосома добыча комплект (см. Таблицу материалов).
    9. Декант ПБС и передать холодных 45 мл Dounce гомогенизатор нарезанные кусочки печени. Убедитесь, что все кусочки перейдите к нижней части гомогенизатора.
    10. Добавление 7 мл холодного 1 x IE буфера (из комплекта изоляции ER) и гомогенизации на льду, перемещая пестик вверх и вниз 20 x. Убедитесь, что толкателем идет к нижней части гомогенизатор во время каждого штриха.
    11. Передать холодной 15 мл пластиковых пробирок огневки (рис. 1B).
    12. Промойте гомогенизатор с 1 мл холодного 1 x IE буфера (из комплекта изоляции ER) и добавить в остальной части огневки.
  3. LD изоляции
    1. Удалите ядер центрифугированием огневки в высокопроизводительные центрифуги на 1000 x g 10 мин при температуре 4 ° C (рис. 1 c).
    2. Передать новый, холодная 50 мл пластиковых пробирок шпагу супернатант (ПНС). Чтобы предотвратить потерю LD, убедитесь, что любой липидов, собрались в верхней части трубки 15 мл высокомобильна перед передачей векселей.
    3. Взять 100 мкл аликвота векселей для чистоты анализа и поместите его в холодной 1,7 мл microcentrifuge. Отложите на льду.
    4. Чтобы удалить митохондрий, центрифуга ПНС образца, не Алиготе, в охлажденных высокоскоростной центрифуги на 12000 x g 15 мин при 4 ° C.
      1. Необязательный: для сырой LD (ХЗЛ) изолятов (загрязненные цитозоле и клеточной мембраны), собирать лучшие липидного слоя с помощью пипетки стеклянные и перенести его на пробки microcentrifuge 1,7 мл. Далее в разделе 1.4.
    5. Передачи postmitochondrial супернатант (PMS) ультрацентрифуга трубки. Чтобы предотвратить потерю LD, убедитесь, что любой липидов, собрались в верхней высокомобильна перед передачей PMS.
    6. Взять 100 мкл аликвота ПМС для чистоты анализа и поместите его в холодной 1,7 мл microcentrifuge. Отложите на льду.
    7. Заполните ультрацентрифуга трубки к brim с холодной 1 x IE буфер для предотвращения трубки, рушится во время ultracentrifugation.
    8. Баланс образцы и центрифуги их в ультрацентрифуга на 100,000 x g 60 мин при температуре 4 ° C (рис. 1 d).
    9. Чтобы удалить слой LD, наклона трубы под углом 45° и использовать Пипетки стеклянные для аспирационная. Передать пробки microcentrifuge холодной 1,7 мл гранул.
      Примечание: Гранулы содержит изолированные ER. Используйте эту часть по течению для ER изоляции.
    10. Сбор 100 мкл супернатант пост ER (PER) под липидного слоя для чистоты анализа.
  4. LD Стиральная
    1. Добавьте ПБС LD дроби, собранных в 1.7 microcentrifuge трубку, чтобы суммарный объем 1,3 мл.
    2. Вихрь образца.
    3. Центрифуга в microcentrifuge за 5 мин при 4 ° C для любой ячейки мусор на гранулах с максимальной скоростью. Теплый трубку осторожно с руки, чтобы помочь Ресуспензируйте LD слой. Передача супернатанта, включая липидного слоя, чтобы новые пробки microcentrifuge 1,7 мл.
    4. Повторите шаги 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, до тех пор, пока гранулы больше не видна.
    5. Добавьте ПБС в Пелле бесплатно LD супернатанта окончательный объемом 1,5 мл. Вымойте липидная фракция центрифугированием в microcentrifuge на максимальной скорости в течение 5 мин при 4 ° C.
    6. Удаление 1 мл ПБС (под липидного слоя) с стеклянной пипетки не нарушая липидного слоя.
    7. Повторите шаги 1.4.5 и 1.4.6 4 x x-5, до тех пор, пока ПБС визуально прозрачный с не мутность.
    8. Удалить все ПБС ниже липидного слоя, с помощью стеклянной пипетки (Рисунок 1E).
    9. Используйте результат, чистого долю LD, ниже по течению анализа.
  5. LD белка количественный, bicinchoninic кислоты пробирного
    Примечание: Не используйте Пробирная bicinchoninic кислоты (BCA) Если LD морфология должна оцениваться.
    1. Ресуспензируйте LD в 500 мкл PGPE 5%.
    2. Сварить образцы для 5 мин при 95 ° C, вихрь и Проинкубируйте образцы при комнатной температуре на 5 минут для охлаждения.
    3. Повторите шаг 1.5.2 дополнительные 2 x.
    4. Sonicate образцы для 5 мин с 30 s/выключения цикла, на средней интенсивности.
    5. Нормализовать образцов путем измерения концентрации белка во всех пробах анализ чистоты и в LD фракции пробирного BCA.

2. LD изоляции, используя градиент плотности сахарозы

  1. Подготовка
    1. Сделайте 200 мл TE буфера (10 мм трис-HCl [рН 7,4], 1 мм ЭДТА [рН 8,0]). Охладить его, поместив его на льду.
    2. Сделать 100 мл раствора сахарозы 60% (w/v) в буфере TE, растворяя 60 г сахарозы в TE буфера, в результате чего окончательный объем 100 мл. Охладить его, поместив его на льду.
    3. Сделайте 6 мл раствора сахарозы 40% (w/v) путем добавления 4 мл 60% сахарозы в 2 мл TE буфера. Охладить его, поместив его на льду.
    4. Сделайте 6 мл раствора сахарозы 25% (w/v) путем добавления 2,5 мл 60% сахарозы в 3,5 мл TE буфера. Охладить его, поместив его на льду.
    5. Сделайте 4 мл раствора сахарозы 10% (w/v) путем добавления 0,7 мл 60% сахарозы в 3,3 мл TE буфера. Охладить его, поместив его на льду.
    6. Сделайте 10 мл раствора ингибитор протеазы и фосфатазы, добавив одну таблетку ингибиторов протеаз и фосфатазы 10 мл TE буфера.
    7. Подготовка тканей огневки буфера путем добавления 4 мл раствора ингибитор протеазы и фосфатазы 50 мл 60% раствор сахарозы. Охладить его, поместив его на льду.
    8. Подготовьте оверлея буфера путем добавления 2 мл раствора ингибитор протеазы и фосфатазы 50 мл TE буфера. Охладить его, поместив его на льду.
    9. Подготовка 100 мл ПБС путем разбавления 10 мл 10 x PBS в 90 мл ультрачистая вода. Охладить его, поместив его на льду.
    10. Подготовка 10 мл 5% PGPE путем разбавления 500 мкл PGPE в 9,5 мл ультрачистая вода. Используйте 1 мл шприц для измерения из PGPE как это вязка. Охладить его, поместив его на льду.
    11. Прохладный следующие пробирок, поместив их на льду: трубы microcentrifuge 1,7 мл, 15 мл пробирок, 50 мл высокоскоростной пробирок и 13 мл ультрацентрифуга трубы.
    12. Прохладный необходимые центрифуги до 4 ° C: в microcentrifuge, высокопроизводительные центрифуги (для 15 мл пробирок), высокоскоростной центрифуги (для 50 мл трубки) и ультрацентрифугирования.
  2. Подготовка тканей
    1. Используйте 1.2.1–1.2.9 шаги для подготовки ткани для гомогенизации.
    2. Добавление 7 мл холодного ткани огневки буфера и гомогенизации на льду, перемещая пестик вверх и вниз 20 x. В течение первых пяти штрихов убедитесь, что толкателем идет к нижней части гомогенизатора.
    3. Гомогенат трутневых передать холодной 15 мл пластиковых пробирок.
    4. Промойте гомогенизатор с 1 мл холодного ткани огневки буфера и перенести его на ранее использовавшихся 15 мл пластиковых пробирок.
    5. Довести объем огневки до 10 мл с буфером огневки ткани.
    6. Центрифугуйте образцы в высокопроизводительные центрифуги на 1000 x g 10 мин при 4 ° C.
    7. Передача 8 мл супернатант 50 мл пластиковых пробирок.
    8. Передачи 100 мкл оставшиеся супернатанта как ПНС образца для чистоты анализа.
  3. Сахароза градиент
    1. Регулировка пластиковых пробирок 50 мл, содержащие 8 мл ПНС под углом 45°. Аккуратно добавьте 6 мл раствора 40%-ая сахароза, гарантируя два этапа оставаться отдельной.
    2. Аналогичным образом медленно добавьте 6 мл 25% раствора сахарозы; Затем добавьте 4 мл 10% раствора сахарозы; Наконец добавьте 8 мл буфера оверлея.
    3. Центрифугуйте образцы в высокоскоростной центрифуги на 30000 x g при 4 ° C за 30 мин.
    4. Перенести верхний слой, содержащий LDs до 1,7 мл microcentrifuge.
    5. Для мытья LD, выполните действия, описанные в разделе 1.4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы выступали LD изоляции с ER комплект на приблизительно 30 мышей и сравнили результаты с теми, кто после Протокол изоляции сахарозы на приблизительно 40 мышей. Сообщил результаты типичны для обоих протоколов. Мышей были постились ночь со свободным доступом к воде, чтобы увеличить выход LD. LD изоляции с помощью градиента сахароза была параллельно с ER комплект LD Протокол изоляции. Образцы ПНС, PMS, %, расширена и LDs были собраны на протяжении ER комплект LD Протокол изоляции. Из-за огр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Печеночная LD биологии все чаще признается как критический регулятор гепатоцеллюлярной физиологии в здоровье и болезни. Как bona fide органеллы LDs являются динамическими, взаимодействуют с другими клеточных структур и содержат в них биологически активных компонентов, вовлеченных в гомеостаз глюкозы и липидов. Градиент сахарозы обычно используется для изоляции LD и позволяет следователей для изучения структуры LD, но он требует, чтобы сделать многочисленные буферов. Мы показали, что использование коммерчески доступных ко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Д-р Карр получает поддержку исследований от перехвата Фармацевтика.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Абрамсон семьи рака научно-исследовательский институт. Эта работа поддерживается следующие гранты: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Роберта Вуда Джонсона Фонда, Гарольд Амос медицинский факультет премии в области развития, 7158, IDOM ДРК пилот премии Р30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Эта работа была поддержана в части NIH P30-DK050306 и его основной зал (молекулярной патологии и изображений ядра, молекулярной биологии/ген выражение ядра и ядро культуры клеток) и его пилот грантовой программы. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Вихревой смеситель BioExpressGeneMateS-3200-1Вихревой смеситель
Центрифуга 54242 REppendorf54242 RОхлаждаемая контрмикроцентрифуга
Ротор: FA-45-24-11
Центрифуга Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6+Охлаждаемая высокоскоростная центрифуга
Ротор: F21S-8x50Y
Центрифуга Sorvall Legend RT+Thermo ScientificУсловные обозначения RT +Охлаждаемая высокопроизводительная центрифуга
Ротор: 75006445 Ведро: 75006441
cOmplete Коктейль ингибиторов протеазыSigma Aldrich04 693 116 001Таблетки ингибитора протеазы
Diagenode Bioruptur UCD-200DiagenodeUCD-200Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 мл)Wheaton357546Use Loose Pestle
Фосфатно-солевой буферный раствор Dulbecco (1x)Corning21-031-CM
Набор для изоляции эндоплазматического ретикулумаSigma AldrichER0100Для ER набор для экстракции:
Содержит:
Изотонический буфер для экстракции 5X 100 мл
Гипотонический буфер для экстракции 10 мл
Хлорид кальция, 2,5 М раствор 5 мл
OptiPrep Density Gradient Medium 100 мл
Игла с тупым носом 1 шт.
Внешний источник света для флуоресцентного возбужденияLeicaLeica EL6000
Соляная кислотаSigma AldrichH1758Соляная кислота
ImageJПрограммное обеспечение для анализа изображений
Инвертированный модулирующий контрастный микроскопLeicaLeica DM IRB
Набор для обогащения лизосом тканей и культивируемых клетокThermo Fisher Scientific89839Для микроскопа с изоляцией лизосом
КамераQimagingQICAM fast 1394
Optima XL-100K УльтрацентрифугаBeckman-CoulterXL-100KУльтрацентрифуга
ротор: SW41Ti
Пастеровские пипеткиFisher Scientific22-042817
Чашка Петри 5 смFisher ScientificFB0875713A
Набор для анализа белка Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225
PhosSTOPSigma Aldrich04 906 845 001Таблетки ингибитора фосфатазы
Стерильное хирургическое лезвие #10PioneerS2646
СахарозаFisher ScientificS5-500Кристаллический/сертифицированный ACS
триглицерид Liquicolor KitStanbio 2200-225Набор колориметрических триглицеридов
Tris BaseFisher ScientificBP152-1Для TE буфера
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151-1005%, Полиэтиленгликоль p-(1,1,3,3-тетраметилбутил)-фениловый эфир, Реагент для лизиса белка
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)Thermo Fisher Scientific15575-038Для TE буфера

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923(2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118(2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814(2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Endoplasmic Reticulum IsolationLysosome IsolationLiver Tissue PreparationDifferential CentrifugationUltracentrifugation ProtocolLipid Droplet Purity AnalysisPLIN2 Marker DetectionSEC61A Protein Assay

Похожие статьи