Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Рассечение дрозофилы куколки сетчатки для иммуногистохимии, Западный анализ и РНК изоляции

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59299

⸱

15 марта 2019 г.

 , 
1Department of Biology, Wesleyan University

В этой статье

Краткое содержание

Этот документ представляет хирургический метод для рассечения дрозофилы куколки сетчатки наряду с протоколами для обработки ткани для иммуногистохимии, Западный анализ и извлечение RNA.

Аннотация

Куколки сетчатки дрозофилы обеспечивает отличную модель системы для изучения морфогенетических процессов во время разработки. В этой статье мы представляем надежный протокол для диссекции деликатный дрозофилы куколки сетчатки. Хирургический подход использует инструменты легко доступные microdissection для открытия куколок и точно извлекать глаз мозг комплексов. Эти можно фиксированной, подвергается иммуногистохимии и сетчатки затем монтируется на скольжениях микроскопа и образы, если цель заключается в том, чтобы обнаружить сотовой или внутриклеточных структур. В качестве альтернативы нефиксированных сетчатки может изолированы от мозговой ткани, лизированы в соответствующие буферы и используются для извлечения электрофореза или мРНК белка гель (оценить выражение протеина или гена, соответственно). Значительные практика и терпение может потребоваться освоить microdissection протокол описал, но как только освоил, протокол позволяет относительно быстро изоляции главным образом неповрежденных сетчатки.

Введение

Дрозофилы Сетчатка состоит из примерно 750 фасеточном окружении пигментных клеток, расположенных в3,2,1,решетка соты4. Каждый Омматидий содержит восемь фоторецепторных нейронов, четыре линзы секретирующих колбочек и два первичных клеток пигмента. Каждый Омматидий окружают пигментных клеток решетки и сенсорные щетиной групп. Благодаря своей пост митотическая природы и стереотипных гексагональной куколки сетчатки дрозофилы обеспечивает отличную модель системы для изучения морфогенетических процессов, включая клетки адгезии5,6, 7,8,9,10 апоптоз11,12,13,,14и15.

Несколько опубликованных протоколов используют давление воздуха для извлечения глаз мозг комплексы из дрозофилы куколок16,17,18. Протокол, в описанный здесь вместо этого использует инструменты microdissection для тщательно и точно изолировать глаз мозг комплексы с целью получения неповрежденной ткани сетчатки. Это важно, если сетчатки должны быть использованы для морфологических, белка или экспрессии генов анализирует, так как повреждение сетчатки может привести к клеточного стресса или смерть, которые могут изменить клеточных фенотип или ген выражение. Кроме того после практики, 6-10 глаз мозг комплексы могут быть изолированы в 10-15 мин, содействие цели минимизации изменчивости в возраста и стадии развития расчлененных глаз ткани.

Фиксации, иммуноокрашивания и целом гора протокол описанные ниже подходит для подготовки дрозофилы глаза для флуоресцентной микроскопии. Сетчатки могут быть инкубирован с антителами против протеинов интереса. Например антитела к adherens соединения компонентов могут быть использованы для визуализации апикальной окружностей клеток, так что характеристики, включая тип клеток, форму и расположение может быть начисленных19. До фиксации глаза можно вместо расщепляется от головного мозга с целью извлечения белков для западного анализа, или РНК для использования в qRT ПЦР или РНК последовательности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка тканей

  1. Настройка дрозофилы кресты (как описано ранее20) или культуры конкретных штаммов дрозофилы для получения куколок желаемого генотипа. Для обеспечения что большое количество куколок возникают совпадению, установить эти летать культур в двух экземплярах на средства массовой информации богатых питательными веществами продуктов питания или стандартное питание СМИ, щедро дополнена дрожжей пасты.
  2. Поддерживать дрозофилы культур при 25 ° C. Для использования системы UAS-GAL4 кресты GMR-GAL4 является идеальным драйвер, выраженная в личиночной глаз диск клетки задней морфогенетических борозды и на протяжении развития куколки21,,2223, 24. Крест UAS-lacZ X GMR-GAL4 служит идеальной управления крест, как он управляет экспрессии белка не эндогенного и инертных β-галактозидазы.
  3. Используйте кончик 6" бамбуковых шина, которая была мокрой с дистиллированной водой, аккуратно поднять белый предварительно куколки (рис. 1B) со стороны здоровой культуры флаконов (рис. 1A) и поместить в 1,5 мл microcentrifuge трубку (рис. 1 c).
  4. Место труб в поле Подсказка пластиковая Пипетка наряду с небольшой кусок ткани, смоченный в дистиллированной воде для поддержания палата при достаточной влажности для защиты куколки от сушки (рис. 1 d). Инкубируйте куколок при 25 ° C до вскрытия.
  5. Используйте сухой 6" бамбуковых шина для осторожно выдвиньте куколок из пробки microcentrifuge и на черный рассекает блюдо. Класть свежий кусок двухсторонний скотч на рассечения блюдо от куколок.
  6. Используя пару щипцов, тщательно место куколок спинной стороне вверх (то есть, оболочек вверх, рис. 1B) на ленту (рис. 2A). Убедитесь, что куколки хорошо придерживаться ленты.
    Примечание: Влаги на корпусе куколки препятствуют безопасной адгезии на ленту, в этом случае, позволяют куколок высохнуть перед размещением на двухсторонний скотч.

2. рассечение глаз мозг комплексов

  1. Используйте щипцы для удаления крышечки каждой куколки (рис. 2 c).
  2. Используйте ножницы microdissection ломтик или разрезать куколки случай каждой куколки. Лоскут открыть куколки случай раскрыть головы, грудной клетки и передней брюшной сегмент, обеспечение края куколки дело двухсторонний скотч (рис. 2 c).
    Примечание: Нет необходимости полностью раскрыть куколок.
  3. Проколоть брюшке каждой куколки с острыми пинцет, чтобы понять животного и удалите его из чехла куколки (рис. 2 c).
  4. Поместите куколок на черный рассечение блюдо, от ленты и покрывают около 400 мкл раствора ледяной фосфат буфер-(PBS, рН 7,4).
  5. Возьмите каждой куколки живота с щипцами и microdissection ножницы, сделать чистой поперечного разруба через всей грудной клетки, резка куколки в два раза (Рисунок 2D).
  6. Удаление задней остаток каждой туши от PBS и надел рассечения блюдо в одну сторону (не отменить, смотрите шаг 3.2.1).
  7. Откройте с помощью двух пар тонкой щипцов, грудной клетки и головы каждой куколки раскрыть глаз мозг комплекс (рисунок 2E). Чтобы сделать это, возьмите края разреза грудной клетки эпителия и постепенно слезоточивый открыть грудной клетки и затем голову капсула, подвергая глаз мозг сложными и окружающие жировой ткани.
  8. Без цепляния ткани, используйте щипцы для руководства комплекс глаз мозг от пережитков головной капсулы или совок комплекс глаз мозг от войной открытый головной капсулы.
    Примечание: Глаз мозг комплекс гантели образный, беловатого и более прозрачной, чем окружающие кремового цвета жира (рис. 2B, E).
  9. Пинцетом тщательно удалите большинство жиров, связанные с глаз мозг комплексы без касатьться тканей глаза.

3. обработка ткани для иммунофлуоресценции

  1. Рассекать по крайней мере 6-10 куколки как описано (шаги 2.1-2.9).
    Примечание: Три-четыре независимых реплицирует каждого рассечение, как правило, дают достаточно данных для проверки гипотезы.
  2. Мытье и фиксация
    1. Отрежьте кончик P20 или наконечник пипетки P100 с чистым лезвием увеличить наконечник открытие ~ 1 мм в радиусе и смазывать, дозирование смеси PBS и жира вверх и вниз. Этот жир можно получить остатки туши, снятыми в пункте 2.6.
    2. Перенесите глаз мозг комплексов в ~ 400 мкл PBS в 9-Ну стекла блюдо, на льду. Используйте кончик смазкой и P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха для передачи.
      Примечание: Глаз мозг комплексов будет придерживаться несмазанной советы во время закупорить и повреждены или потеряны.
    3. Удалите оставшиеся жира, связанные с тканей глаза, закупорить PBS вверх и вниз, чтобы слегка взболтать комплексов глаз мозг. В этом и все последующие стирки шаги, не Пипетка непосредственно комплексы глаз мозг вверх и вниз как это может повредить хрупкий глаз ткани.
    4. Передача глаз мозг комплексов в минимальном объеме (< 20 мкл) от PBS в по крайней мере 250 мкл фиксатором. Смешайте закупорить решение вверх и вниз. Инкубируйте 35 мин., на льду.
      Примечание: Кончик же смазкой, подготовленную на этапе 3.1.1 может использоваться для этой передачи.
    5. С же кончиком пипетки передача глаз мозг комплексов в хорошо содержащие ~ 400 мкл PBS. Смешать, закупорить решение вверх и вниз и инкубировать на 5-10 минут на льду, мыть. Повторите шаг стирки по крайней мере дважды.
      Примечание: Глаз мозг комплексов может поддерживаться на несколько часов во время окончательной стирки PBS, на льду, или на 4 ° C, прежде чем перейти к шагу 3.3.1.
  3. Пятнать антитела
    1. Чтобы заблокировать ткани до воздействия решений антитела, передать ~ 400 мкл PBT комплексы глаз мозг. Используйте кончик смазкой и P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха для передачи. Инкубируйте 10-60 мин, на льду.
    2. Приготовляют раствор основного антитела путем разбавления соответствующие антитела в PBT. Так как глаз мозг комплексы инкубируют в 10 мкл аликвоты раствор антител, объем подготовленных будет реплицировать из 10.
    3. Аликвота 10 мкл раствор антител в Чистый колодец 72-ну микрорезервуар лотка (см. обсуждение).
    4. Отрежьте кончик кончика пипетки P10 с чистым лезвием увеличить наконечник открытие ~0.5 мм в радиусе и смазывать, дозирования PBT вверх и вниз.
    5. Передачи в объеме не более 5 глаз мозг комплексов, < 3 мкл PBS, в каждый 10 мкл хорошо раствор антител с использованием микропипеткой перемещения воздуха P10 и кончик смазкой.
    6. Однородный раствор антител, закупорить решение вверх и вниз. Не Пипетка комплексы глаз мозг вверх и вниз, как это может повредить ткани.
    7. Чтобы свести к минимуму испарения раствор антител, место небольшой кусок ткани, смоченный в дистиллированной воде в микрорезервуар лоток и уплотнение лоток (например, с крышкой предусмотрено). Инкубируйте на ночь при 4 ° C.
    8. Перевод глаз мозг комплексы из лотка микрорезервуар на ~ 400 мкл ПБТ в 9-навернулись стеклянную посуду мыть. Используйте микропипеткой перемещения воздуха P10 и ПБТ смазать наконечник (готовить, как описано в шаге 3.3.4). Смешайте закупорить решение вверх и вниз. Инкубируйте 5-10 мин на льду.
    9. Повторите шаг стирки по крайней мере дважды. Используйте P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха и ПБТ смазать наконечник для передачи глаз мозг комплексы между Вымойте решения.
    10. Приготовляют раствор вторичного антитела путем разбавления соответствующие Флюорофор тегами вторичные антитела в PBT при необходимости. 100 мкл раствора вторичного антитела является достаточным в пакете куколок 6-10. Алиготе вторичное антитело решения в блюдо рассечение 9-навернулись стекла.
    11. Перенесите глаз мозг комплексов в раствор вторичных антител. Используйте P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха и ПБТ смазать наконечник для передачи.
    12. Инкубировать глаз мозг комплексов в растворе вторичное антитело для 1-2 ч при комнатной температуре, или 3-5 ч при 4 ° C. Чтобы предотвратить обесцвечивание флуорофоров светом, охватывают подготовку с фольгой.
      Примечание: Оптимальная продолжительность инкубации в растворе вторичные антитела могут отличаться в зависимости первичного и вторичного антитела, которые используются.
    13. Перенесите глаз мозг комплексов в ~ 400 мкл PBT в стекло 9-Ну блюдо, чтобы мыть. Смешайте закупорить решение вверх и вниз. Инкубируйте 5-10 мин на льду. Этот шаг Стиральная должен повторяться по крайней мере дважды.
  4. Вторичные фиксации
    1. Для вторичного фиксации передать по крайней мере 200 мкл фиксатором глаз мозг комплексов и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре или 35 мин при 4 ° C.
      Примечание: Среднее фиксации застывает тканей глаза, которая помогает монтажа (шаг 3.5).
    2. Используйте P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха и ПБТ смазать наконечник для передачи глаз мозг комплексов в ~ 400 мкл PBT в стекло 9-Ну блюдо, на льду, чтобы помыть 5 мин.
    3. Повторите шаг стирки по крайней мере один раз.
    4. Использование P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха и ПБТ смазкой подсказка для передачи глаз мозг комплексов в ~ 400 мкл PBS в 9-Ну стекла блюдо, на льду, для полоскания для 1-2 мин держать ткани в движение дозирования PBS, но не ткани , вверх и вниз, чтобы предотвратить глаз мозг комплексы от урегулирования и придерживаясь стеклянную посуду во время PBS-промыть.
  5. Монтаж
    1. Перенесите глаз мозг комплексов в ~ 200 мкл монтажа СМИ. Используйте P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха и ПБТ смазать наконечник для передачи комплексов глаз мозг. Разрешить ткани, чтобы сбалансировать в монтаж СМИ для 1-2 ч.
    2. Место 5-8 мкл капли свежего монтажа СМИ на чистой микроскопа.
    3. Отрежьте кончик P10 с чистым лезвием увеличить наконечник открытие ~0.5 мм в радиусе и использовать это и микропипеткой перемещения воздуха P10 для передачи глаз мозг комплексов в 5-8 мкл монтажа СМИ в падение монтажа СМИ на слайде.
    4. Используйте две иглы вольфрама для разделения глаз от зрительного лопастями. Контакт глаз мозг комплекс на слайд с прочная вольфрамовой иглой и нарежьте каждый глаз от его связанного доли оптика с тонкой вольфрамовой иглой (Рисунок 2F).
    5. Используйте тонкой вольфрамовой иглой для маневра каждого глаза на поверхности микроскопа с базальной поверхности каждого глаза, прилегающих к слайду. Слегка ниже чистой крышкой скольжения над ткани и закрепите с лак.
      Примечание: Организация глаза на слайде, так что они находятся рядом друг с другом или в строке облегчит последующее микроскопии.
    6. Изображение с помощью флуоресцентных или конфокальной микроскопии сетчатки.
      Примечание: Слайды следует хранить при 4 ° C, если не немедленно отражаться.

4. подготовка ткани глаза для западный Blotting:

  1. Вскрыть 10-16 куколки (шаги 2.1-2.9) со следующими изменениями:) собирать и анализировать куколки в двух пакетах, 10-15 мин врозь и b) вскрыть в PBS, дополняют ингибиторы протеазы и фосфатазы (PBS + pi).
  2. Передача с помощью P20 комплексы глаз мозг или P100 воздуха микропипеткой перемещения и смазать наконечник (подготовлен как шаг 3.2.1) в ~ 400 мкл PBS + pi в 9-Ну стекла блюдо, на льду, чтобы ополоснуть кратко.
    Примечание: Этот смазать наконечник может использоваться для последующих шагов, 4.3 и 4.4.
  3. Повторите шаг полоскать дважды.
  4. Перенесите все комплексы глаз мозг в ~ 400 мкл лед холодной PBS + pi, сливают на чистый черный рассечения блюдо.
  5. Удаление каждый глаз из зрительного лопастями, с помощью иглы прочная вольфрама (устойчивый комплекс глаз мозг) и тонкой лезвие бритвы или microdissection ножницы для аккуратно вырезать каждый глаз от лоб зрительный.
    Примечание: Глаза «липкий» на этой стадии и могут легко придерживаться рассечения блюдо. Это выгодно, как она может помочь облегчить удаление глаз от зрительного лопастями (см. обсуждение).
  6. «Sweep» все глаза в кучу» в PBS + pi на рассечения блюдо, используя один blade прекрасные пары щипцов.
  7. Отрежьте кончик P10 с чистым лезвием расширить Совет открытие ~0.5 мм в радиусе и Смажьте наконечник интерьер буфера Lysis (WTLB ткани дозирования Западной) вверх и вниз.
  8. Передача в 5 мкл PBS + pi глаз мозг комплексов в 500 мкл microcentrifuge трубку. Используйте этот смазать наконечник и микропипеткой перемещения воздуха P10 для завершения передачи.
  9. Место пробки microcentrifuge на льду. Добавьте 1 тома (5 мкл) WTLB в образец и 10 мкл буфера выборки концентрированных белков 2 x (или 2,5 мкл буфера выборки концентрированных белков 5 x). Перемешать путем выстукивать.
  10. Вихревой microcentrifuge трубки кратко и спин вниз образца с помощью рабочего стола Мини центрифуга.
  11. Магазин образец при-20 ° C до анализа. Анализ с помощью стандартных протоколов.

5. подготовка ткани глаза РНК добыча:

  1. Носить перчатки, чистый benchtop, Микроскоп, рассечение инструменты и черный рассекает блюдо впервые с 70% этанола, а затем РНКазы обеззараживания реагента. Дайте высохнуть.
  2. Вскрыть 30-40 куколки как описано (шаги 2.1-2.9), со следующими изменениями:) собираются и вскрыть 6-8 куколки в пакетах, 15-20 минут друг от друга; b) вскрыть в свободной от нуклеиназы PBS и c) изолировать каждый пакет глаза отдельно, но накапливать все ткани сетчатки в же пробки microcentrifuge (шаг 5.5).
    Примечание: Два люди препарировать параллельно ускорит эффективной изоляции хороший глаз ткани.
  3. Для каждого пакета изолируйте глаз мозг комплексы (шаги 2.1-2.9) и передачи в ~ 400 мкл свободной от нуклеиназы PBS в 9-Ну стеклянную посуду для полоскания кратко, на льду, с использованием P20 или P100 микропипеткой перемещения воздуха и смазать наконечник (готовится, как описано в шаге 3.1.2).
    Примечание: Этот смазать наконечник может использоваться для последующих шагов, 5.4, 5.5 и 5,8.
  4. Повторите шаг полоскать дважды.
  5. Перевод глаз мозг комплексов на свежие 400 мкл капля ледяной свободной от нуклеиназы PBS на чистый черный рассекает блюдо.
  6. Удаление каждый глаз из зрительного лопастями, с помощью иглы прочная вольфрама (устойчивый комплекс глаз-мозг) и тонкой лезвие бритвы или microdissection ножницы для аккуратно вырезать каждый глаз от лоб зрительный.
    Примечание: Глаза «липкий» на этой стадии и могут легко придерживаться рассечения блюдо. Это выгодно, как она может помочь облегчить удаление глаз от зрительного лопастями (см. обсуждение).
  7. «Sweep» все глаза в кучу» в свободной от нуклеиназы PBS на рассечения блюдо, используя один blade прекрасные пары щипцов.
  8. Перевести глаза в стерильную пробирку microcentrifuge РНКазы бесплатно и флэш замораживание в жидком азоте.
  9. Повторите диссекции (шаги 5.3-5.8) каждой партии куколок. Передачи каждого пакета глаз в же microcentrifuge трубку, которая была сохранена в жидком азоте (шаг 5.5) накапливать все глаза в одной из труб.
  10. Хранение образцов-80 ° C до извлечение RNA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Куколки глаз является легко доступной ткани, которая служит прекрасной моделью для изучения процессов развития, диск морфогенеза. Здесь, мы расчленены сетчатки и используются иммунофлюоресценции для обнаружения апикальной adherens соединения (рис. 3A, C) или caspase Dcp-1 (рис. 3D), который активируется во время апоптоз (рис. 3)25. Эти подходы позволяют четко соблюдать клетки во время ключевы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод дрозофилы куколки глаз рассечение описанных здесь позволяет для изоляции 6-10 глаз мозг комплексов в течение 10-15 мин. Однако терпение и практика имеют важное значение для того, чтобы освоить технику рассечения и улучшить качество и скорость вскрытия. Этот короткий рассечение время гарантирует, что каждый глаз примерно же стадии развития, снижение изменчивости в выражении фенотип или гена сетчатки в наборе данных. Хотя альтернативные протоколы могут требовать менее практике освоить, наш протокол предназна...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Zack барабан и наши рецензенты за полезные замечания по рукописи. Эта работа была поддержана R15GM114729.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Adobe PhotoshopПрограммное обеспечение для обработки изображенийAdobe
Бамбуковые шины, 6" Ted Pella Inc116
Бета меркаптоэтанолSigma-AldrichM3148
Бета-глицеринфосфатSigma-Aldrich50020
Черная препарирующая тарелкаСтеклянная чашка Петри, наполненная до краев SYLG170 или SYLG184 (окрашена в черный цвет с мелко измельченным порошком древесного угля). Оставьте при комнатной температуре на 24-48 ч для полимеризации.
Держатель лезвияFine Science Tools10053
Бычий сывороточный альбуминSigma-AldrichA7906
cOmplete, коктейльные таблетки ингибитора протеазы без ЭДТАRoche4693132001
Конфокальный микроскоп (Zeiss LSM 501)Carl Zeissили аналогичный микроскоп
Диэтилпирокарбонат (DEPC)Sigma-Aldrich40718
Двухсторонний скотч3M665
Drosophila пищевые среды, богатые питательными веществами 7,5% сахароза, 15% глюкоза, 2,5% агар, 20% пивные дрожжи, 5% пептон, 0,125% MgSO4.7H2O, 0,125% CaCl2.2H20
Drosophila пищевые среды, стандартныйрецепт кукурузной муки Bloomington Drosophila Stock center.  (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Этилендиаминтетрауксусная кислотаSigma-AldrichE6758
Фиксирующий раствор4% формадихида в PBS, pH 7,4.
Флуоресцентный микроскоп (микроскоп TCS SP5 DM)Leica Microsystemsили аналогичный микроскоп
Щипцы Щипцы Fine Science Tools91150-20следует часто затачивать.
ФормальдегидThermo Scientific28908
Стеклянная 9-луночная посуда Corning7220-85Также известен как 9-луночные посуды 
Стеклянные покровные стекла (22 x 22 мм)Fisher Scientific12-542-B
Стеклянные предметные стекла для микроскопа (25 x 75 x 1 мм)Fisher Scientific12-550-413
Стеклянная чашка ПетриCorning3160-100BO
ГлицеринSigma-AldrichG5516
Версия программного обеспечения Image Studio 5.2.5LI-COR BiosciencesПрограммное обеспечение для обработки изображений для количественного определения вестерн-блотов.
Образец буфера LaemmliBio-Rad161-07372X концентрированный белковый буфер для образцов, добавка с бета-меркаптоэтанолом в соответствии с инструкциями производителя.
Уменьшение буфера для выборки маркера полосы ThermoFisher Scientific390005X буфер для образцов концентрированного белка.
Микроцентрирные трубки AxygenMCT-175-C
Ножницы для микродиссекции Fine Science Tools15000-03
Лотки для микролунок (72 x 10 &; L лунок)Nunc438733
Монтажная среда0,5% N-пропилгаллата и 80% глицерина в PBS
N-пропилгаллатSigma-AldrichP3130
Нуклеаза PBS (PBS в 0,1% DEPC, pH 7,4)Добавьте соответствующий объем DEPC в PBS, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Автоклав не менее 20 минут. Хранить по адресу 4° C
PBS (фосфатно-солевой буфер pH 7,4)Sigma-AldrichP5368Приготовьте в соответствии с инструкциями производителя
PBS+pi (PBS плюс ингибиторы протеазы и фошатазы)10mM NaF, 1mM бета-глицеринфосфат и 1mM Na<суб>3VO<суб>4 в PBS, pH 7,4.   
PBT0,15% TritonX и 0,5% бычьего сывороточного альбумина в PBS, pH 7,4
Держатель булавокFine Science Tools26016-12
Первичное антитело: козий анти-GAPDHImgenexIMG-3073Для вестерн-блоттинга. Используется в 1:3000
Первичное антитело: кролик против расщепления Dcp-1Клеточная сигнализация9578SДля иммунофлуоресценции. Используется в 1:100
Первичное антитело: крысы анти-DEcadDevelopmental Studies Hybridoma BankDCAD2Для иммунофлюоресценции. Использовано в 1:20
Первичное антитело: крыса анти-DEcadDOI: 10.1006/dbio.1994.1287DCAD1  Подарок от Тадаси Уэмуры. Использовано в масштабе 1:100.
Набор для экстракции РНК: Набор для экстракции РНК Relia Prep Miniprep kit PromegaZ6110
Реагент для обеззараживания рназы (РНКаза Away)Molecular BioProducts7002
Лезвия скальпеляFine Science Tools10050Отломите небольшой кусочек лезвия и закрепите в держателе лезвия.
Вторичное антитело: 488-конъюгированный   ослиный антикрысиный IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-545-153Для иммунофлуоресценции. Использовано в 1:200
Вторичное антитело: cy3-конъюгированный козий анти-кроличий IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-165-144Для иммунофлуоресценции. Используется в соотношении 1:100
Вторичное антитело: HRP-конъюгированная козья антикрысиная IgG (H+L)Технология передачи сигналов7077Для вестерн-блоттинга. Используется в 1:3000
Вторичное антитело: HRP-конъюгированный кролик против козьего IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch305-035-003Для вестерн-блоттинга. Используется в 1:3000
Хлорид натрияSigma-AldrichS3014
Фторид натрияSigma-Aldrich215309
ванадат натрияСпектрофотометр Sigma-Aldrich50860
(NanoDrop)ThermoFisher Scientific2000c 
Стерео препарирующий микроскоп (M60 или M80)Leica Microsystemsили аналогичный микроскоп
Sylgard (черный)Dow CorningSYLG170
Sylgard (прозрачный)Dow CorningSYLG184Цвет черный с мелко измельченным порошком шарколя
Ткань: KimwipesKIMTECH34120
TritonXSigma-AldrichT8787
Trizma hydrochloride pH7.5Sigma-AldrichT5941
Вольфрамовая игла, тонкаяFine Science Tools10130-10Вставка в держатель штифта
Вольфрамовая игла, прочнаяFine Science Tools10130-20Вставка в держатель штифтов
WTLB (буфер для лизиса западных тканей)150 мМ NaCl, 1,5% Triton X-100, 1 мМ ЭДТА, 20% глицерин, 10 мМ NaF, 1 мМ бета-глицеринфосфата и 1 мМ Na<суб>3VO<суб>4 в 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5). Дополните одним коктейльным столиком cOmplete protease на 10 мл раствора.
Дрожжеваяпаста (местный супермаркет)Примерно 2 столовые ложки дрожжей Fleischmann's ActiveDry (или аналогичные), растворенные в ~20 мл дистиллированной H2O

Ссылки

  1. Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
  2. Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
  3. Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
  4. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
  5. Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647(2004).
  6. Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
  7. Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
  8. Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
  9. Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
  10. Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796(2017).
  11. Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
  12. Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
  13. Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
  14. Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
  15. Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
  16. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
  17. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347(2012).
  18. Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315(2014).
  19. Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008(2009).
  20. Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  22. Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
  23. Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  24. Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
  25. Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
  26. Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Комплекс «глаз-мозг»протокол микродиссекциииммуногистохимический анализвестерн-блот-анализметод изоляции РНКдиссекция глаза куколкипротокол фиксации тканейинкубация с антителамимонтирование микропрепаратов на стекло
Рассечение дрозофилы куколки сетчатки для иммуногистохимии, Западный анализ и РНК изоляции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.