Method Article

Изучение нормальных эффектов радиации тканей с помощью внеклеточных гидрогелей матрицы

DOI:

10.3791/59304

⸱

July 24th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Radiation Oncology, Stanford University, 3Depattment of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 4Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет метод для децеллюляризации и последующего гидрогеля формирования murine молочных жировых прокладок после облучения ex vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Радиация – это терапия для пациентов с тройным отрицательным раком молочной железы. Влияние излучения на внеклеточную матрицу (ЭКМ) здоровой ткани молочной железы и ее роль в локальном рецидиве на первичном участке опухоли неизвестны. Здесь мы представляем метод децеллюляризации, лиофилизации и изготовления гидрогелей ECM, полученных из murine mammary жировых прокладок. Представлены результаты по эффективности процесса децеллюляризации, оценены реологические параметры. GFP- и люциферазы помечены раковых клеток молочной железы инкапсулированных в гидрогелях продемонстрировали увеличение пролиферации в облученных гидрогелей. Наконец, фаллоидный конъюгированный окрашивание было использовано для визуализации цитоскелетной организации инкапсулированных опухолевых клеток. Наша цель состоит в том, чтобы представить метод для изготовления гидрогелей для исследования in vitro, которые имитируют среду ткани молочной железы in vivo и ее реакцию на радиацию для изучения поведения опухолевых клеток.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рак характеризуется избыточным пролиферацией клеток, которые могут избежать апоптоза, а также метастазировать в отдаленные места1. Рак молочной железы является одной из наиболее распространенных форм среди женщин в США, по оценкам, 266000 новых случаев и 40000 смертей в 2018году 2. Особенно агрессивным и трудным для лечения подтипа является тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC), который не хватает рецепторов эстрогена (ER), рецептор прогестерона (PR), и человека эпидермального фактора роста (HER2). Лучевая терапия обычно используется при раке молочной железы для устранения остаточных опухолевых клеток после lumpectomy, но более 13% пациентов TNBC по-прежнему испытывают рецидив на первичном сайте опухоли3.

Известно, что лучевая терапия эффективна в смягчении метастазирования и рецидивов, поскольку сочетание лампэктомии и радиации приводит к такому же долгосрочному выживанию, как мастэктомия4. Тем не менее, недавно было показано, что лучевая терапия связана с местным рецидивом первичного участка опухоли в условиях иммунокомпромисса5,6. Также хорошо известно, что излучение изменяет внеклеточную матрицу (ЭКМ) нормальной ткани, вызывая фиброз7. Поэтому важно понимать роль вызванных радиацией изменений ЭКМ в диктовке поведения опухолевых клеток.

Децеллюляризованные ткани были использованы вкачестве моделей in vitro для изучения болезни 8,9. Эти децеллюлярные ткани сохраняют состав ECM и резюмируют комплекс in vivo ECM. Эта децеллюляризованная ткань ECM может быть дополнительно обработана и переварена, чтобы сформировать восстановленные гидрогели ECM, которые могут быть использованы для изучения роста клеток и функции10,11. Например, инъекционные гидрогели, полученные из децеллюлярного липоаспиратии человека и из ткани миокарда, служили неинвазивными методами тканевой инженерии, а гидрогель, полученный из ткани свиного легкого, использовался в качестве метода тестирования in vitro мезенхимальных стволовых клеток вложения и жизнеспособности12,13,14. Влияние нормального повреждения тканей радиации на свойства ECM, однако, не было исследовано.

Гидрогели, полученные из ECM, обладают наибольшим потенциалом для изучения in vitro явлений in vivo. Было изучено несколько других материалов, в том числе коллаген, фибрин и матригель, но трудно синтетически резюмировать состав ECM13. Преимущество использования Гидрогелей, полученных из ECM, заключается в том, что ECM содержит необходимые белки и факторы роста для конкретной ткани14,15. Облучение нормальной ткани во время lumpectomy вызывает значительные изменения в ECM, и ECM полученных гидрогелей могут быть использованы для изучения этого эффекта в пробирке. Этот метод может привести к более сложным и более точным в пробирке модели болезни.

В этом исследовании, мы подвергли murine молочных жировых прокладок (MFPs) радиации ex vivo. MFPs были decellularized и сделаны в раствор pre-геля. Гидрогели были сформированы со встроенными 4T1 клетки, линии murine TNBC ячейки. Были изучены реологические свойства гидрогеля, а также оценена динамика опухолевых клеток в гидрогелях. Гидрогели, изготовленные из облученных MFPs, усиливали пролиферацию опухолевых клеток. Будущие исследования будут включать другие типы клеток для изучения клеточных взаимодействий в контексте рецидива рака после терапии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования на животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и протоколами, утвержденными Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Вандербильта.

1. Подготовка и ex vivo облучение MFPs

  1. Пожертвование агимических ну/ну мышей (8-10 недель) с использованием CO2 удушья с последующим вывихом шейки матки.
  2. Очистите кожу с помощью 70% этанола.
  3. Сбор молочных жировых прокладок (MFPs) из жертвенных мышей с помощью предварительно стерилизованных ножниц и щипцы в 15 мл конической трубки, содержащей полный RPMI сми (RPMI дополнен 1% пенициллин-стрептомицин и 10% плода крупного рогатого скота сыворотки) (см. таблицу материалов ).
  4. Облучать образцы до 20 Ги с помощью источника цезия.
  5. Принесите облученных MFPs и полный RPMI средств массовой информации в кабинет ею биобезопасности. Средства массовой информации будут зависеть от клеточной линии, которая будет выращена в конечном гидрогеле. Заполните 6 см или 10 см блюд с достаточным количеством носителей для погружения MFPs. Для 6 см блюдите 8 мл медийных средств, а для 10 см блюдите 20 мл носителей.
  6. Инкубировать в инкубаторе CO2 в течение двух дней. Продолжительность пребывания в инкубаторе может быть скорректирована.
  7. Промыть ткани в фосфат-буферизированных солей (PBS), пятно избыток влаги, и место MFPs в 15 мл конических труб для хранения при -80 градусов по Цельсию до децеллюляризации. Этот шаг замораживания помогает этапу децеллюляризации, и образец должен быть заморожен, даже если следующие шаги в противном случае готовы.

2. Децеллюляризация (адаптирована из ссылок12,16,17)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была адаптирована из ранее опубликованных методов, ориентированных на жировой децеллюляризации, которая включала натрия дезоксихолат ионного моющего средства, а не сульфат натрия додецикл для удаления ДНК эффективно12,16 , 17.

  1. На 1день, удалить замороженные MFPs от -80 градусов по Цельсию и оттепели при комнатной температуре.
  2. После того, как оттаяли, сухие MFPs кратко на деликатной задачей протрите. Взвешивание MFPs с использованием аналитической шкалы.
  3. Используя пару щипцы с ножницами или скальпелем, разделите ткань на 3 мм х 3 мм х 3 мм образцы для изучения нетронутых ECM и оставшейся ткани для производства гидрогеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество образцов зависит от количества методов тестирования, например, приведена ниже коллекция двух образцов: один для встраивания парафина (шаг 2.5) и один для замораживания криостатной встраивающей среды, при желании (см. таблицу материалов и шаг 2.6).
  4. Взвесьте ткани. При встраивании в парафин для секции, продолжайте шаг 2.5. При замораживании криостата встраивания среды для секции, продолжайте шаг 2.6.
  5. В химическом капюшоне, погрузить ткани в 10% нейтральный буферный формалин (NBF) (см. Таблица материалов) для 24 ч при 4 C. Вымойте 3 раза в PBS в течение 5 минут каждый. Погрузите ткань в 30% сахарозу в 48 ч при 4 градусах Цельсия.
    1. Взвесьте ткани теперь, когда этот кусок был удален. Продолжайте шаг 2.6.
  6. В химическом капюшоне поместите кусочки MFP в маркированную кассету, приготовленную криостатом встраивающей среду. Добавить больше криостата встраивания среды для покрытия ткани.
    1. Поместите кассету в стакан с 2-метилбутаном (см. таблицуматериалов), который предварительно охлаждается жидким азотом. Стакан должен иметь достаточно 2-метилбутан, чтобы покрыть дно, но не достаточно, чтобы погрузить кассету, потому что криостат встраивая среду не должны касаться 2-метилбутан. Пусть кассета сидеть в 2-метилбутана до криостата встраивания среды замерзает и становится непрозрачным.
    2. Оберните кассету (ы) в фольгу, этикетку, и оставить на -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока используется для секции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани, помещенные сразу в криостат встраивающую среду, были разделены на 5 мкм, в то время как ткани, инкубированные в сахарозе, были разделены на 30 мкм, чтобы сохранить морфологию адипоцитов.
  7. Используйте щипки для ручного массажа оставшейся ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань штук также могут быть помещены в 10% NBF для 24-48 ч, промыть в PBS, и оставили в 70% этанола до встраивания в парафин. После встраивания, 5 мкм разделы могут быть использованы для гематоксилина и эозина (H и E) окрашивания (см. раздел 7 ниже).
  8. Поместите MFPs в 6 см блюд с 5 мл 0,02% трипсин / 0,05% EDTA раствор. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 1 ч. Спрей и протрите посуду 70% этанола перед помещением в инкубатор.
  9. Используйте 0,7 мм ситечки для мытья MFPs с деионированной (DI) воды, обливая водой ткани в три раза. Используйте щипцы для ручного массажа ткани между смыками.
  10. Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить. Поместите ткани в предварительно автоклавированный стакан, содержащий соответствующий размер перемешать бар. Обложка тканей с 60 мл 3% т-octylphenoxypolyethoxyethanol (см. Таблица материалов) на 1 г ткани и перемешать в течение 1 ч при комнатной температуре. Используйте минимум 20 мл.
  11. Сбросьте ткани и содержимое в ситечко. Промыть стакан с помощью воды DI и налить на ткани. Повторите еще два раза. Используйте щипцы для ручного массажа ткани между полосками.
  12. Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить. Поместите ткани и перемешать баров обратно в те же клюв, и накрыть 60 мл 4% дезоксихолевой кислоты на 1 г ткани. Перемешать в течение 1 ч при комнатной температуре. Используйте минимум 20 мл.
  13. Сбросьте ткани и содержимое в сетч-ситечко. Промыть стакан с помощью воды DI и налить на ткани. Повторите еще два раза. Используйте щипцы для ручного массажа ткани между полосками.
  14. Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить.
  15. Поместите ткани в тот же стакан со свежей водой DI, дополненной 1% пенициллина-стрептомицина. Обложка плотно с парафина пленки. Оставьте на ночь при 4 градусах Цельсия.
  16. Вымойте ситечко и клюв для использования на следующий день.
  17. На 2-й деньслейте содержимое стакана в ситечко. Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить.
  18. Поместите MFPs в том же стакане с соответствующим размером перемешать бар. Накрыть 60 мл 4% этанола/0,1% раствора перацетической кислоты на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 2 ч при комнатной температуре.
  19. Сбросьте ткань и содержимое в 0,7 мм ситечко. Используйте щипки для ручного массажа ткани. Поместите содержимое обратно в стакан. Вымойте ткань, покрыв ее 60 мл 1x PBS на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 15 минут при комнатной температуре. Повторите один раз.
  20. Сбросьте ткань и содержимое в 0,7 мм ситечко. Используйте щипки для ручного массажа ткани. Поместите содержимое обратно в стакан. Вымойте ткань, покрыв ее 60 мл DI воды на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 15 минут при комнатной температуре. Повторите один раз.
  21. Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить. Сбросьте ткани и содержимое в ситечко. Используйте щипки для ручного массажа ткани.
  22. Поместите содержимое обратно в стакан. Закройте ткани 60 мл 100% n-пропанола на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 1 ч при комнатной температуре.
  23. Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить. Сбросьте ткань и содержимое в 0,7 мм ситечко. Используйте щипки для ручного массажа ткани.
  24. Поместите содержимое обратно в стакан. Вымойте ткань, покрыв ее 60 мл воды DI на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 15 минут при комнатной температуре. Повторите три раза.
  25. Сбросьте ткани и содержимое в ситечко. Повторите шаги 2.3-2.6 для сбора кусочков ткани для инкубации сахарозы и замораживания в криостатвной среде встраивания.
  26. Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить. Поместите в прописную трубку 15 мл. Заморозить при -80 градусов на ночь.

3. Лиофилизация

  1. Снимите трубки 15 мл с -80 градусов по Цельсию и поместите на сухой лед. Держите образцы замороженными на сухом льду до тех пор, пока на лиофилизатор.
  2. Снимите колпачки. Используйте резинку, чтобы прикрепить деликатную задачу протрите к верхней части, чтобы покрыть отверстие. Положите образцы на лиофилизатор, по крайней мере 2 дней.
  3. Удалите образцы из лиофилизатора и поместите трубки на сухой лед. Удалите деликатные салфетки задачи весят каждый образец на аналитической шкале. Прикрепите колпачки и поместите на -80 градусов на ночь.

4. Мельница

  1. Заполните неглубокий контейнер жидким азотом. Удалите образцы из морозильной камеры -80 градусов. Взвесьте каждый лиофилизированный MFP.
  2. Поместите один образец в ступку. Используйте криогенную перчатку, чтобы держать раствор в жидком азоте.
  3. Используйте пестик, прикрепленный к ручной дрели, чтобы сделать образец. Мельница в 1 мин интервалы, чтобы проверить прогресс и удалить перчатку руку из жидкого азота. Мельница не менее 5 мин.
  4. Повторите для всех образцов. Спрей и протрите раствор и пестик с этанолом между каждым образцом.
  5. Храните порошкообразные образцы в 15 мл труб октядрий при -80 градусах Цельсия до готовности к использованию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть использованы немедленно или храниться на ночь.

5. Формирование гидрогеля

  1. При хранении при температуре -80 градусов на ночь, снимите и оттаивните при комнатной температуре. При оттаивании, рассчитать необходимый вес пепсина (см. Таблица материалов) и объем соляной кислоты (HCl), необходимых для каждого образца, что приводит к решению с 1% w/v образец порошка и 0,1% w/v пепсина в 0.01 M HCl. Добавить пепсин в HCl форме пепсин-HCl раствор.
  2. Добавьте образец порошка и пепсина-HCl раствора в трубку 15 мл. Добавить небольшой бар перемешать, и перемешать в течение 48 ч.
  3. Поместите трубки на лед в течение 5 мин. Рассчитайте необходимый объем 10x PBS, необходимый для каждого образца, что приводит к раствору с концентрацией 1x PBS. Добавьте соответствующий объем 10x PBS к каждой трубке.
  4. Добавьте 10% v/v 0.1 M NaOH к каждому решению для достижения pH 7.4. Используйте бумагу pH для проверки индивидуально.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гель раствор может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение одной недели.

6. Инкапсуляция клеток в гидрогелях

  1. Использование gFP- и люциферазы помечены клетки
    1. Используя раствор геля pH 7.4, resuspend pelleted GFP- и luciferase-маркированные 4T1 клетки к концентрации 500,000 или 1,000,000 клеток/мл раствора геля. Добавьте 16 зл гель-клеточного раствора к каждому колодцу 16-колодца камерного слайда. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.
    2. Добавьте 100 зл и полного носителя RPMI к каждому колодцу. Продолжить инкубацию в течение 48 ч при 37 градусах Цельсия. Клетки с маркировкой GFP и люциферазы могут быть визуализированы с помощью флуоресценции в 0 часов, 24 часа и 48 часов после гелирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пролиферация клеток может быть измерена для GFP- и luciferase-маркированных 4T1 клеток, используемых здесь путем добавления (S)-4,5-Dihydro-2-(6-гидрокси-2-бензотиазолил)-4-thiazolecarboxylic кислоты калийной соли (см. Таблица материалов) в колодцы в течение 10 мин и выполнение биолюминесценционной визуализации с использованием биолюминесценционной системы визуализации (см. Таблицаматериалов). После биолюминесценции цитоскелет может быть визуализирован (см. раздел 10).
  2. Использование немаркированных ячеек
    1. Используя раствор геля pH 7.4, resuspend pelleted немаркированные 4T1 клетки к концентрации 500,000 или 1,000,000 клеток/мл раствора геля. Добавьте 16 зл гель-клеточного раствора к каждому колодцу 16-колодца камерной горки и 96-колодской пластине. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.
    2. Добавьте 100 л носителей к каждому колодцу. Продолжить инкубацию в течение 48 ч при 37 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: жизнеспособность клеток может быть измерена (см. раздел 11). 16-колодец камеры слайд может быть использован для визуализации, и 96-коловидной пластины могут быть использованы для количественной оценки.

7. H и E окрашивания

  1. Для формилина фиксированной, парафина встроенных тканей, погружения слайды, содержащие 5 мкм разделов дважды в 100% ксилена (5-10 мин) для де-парафинизации. Регидратировать путем погружения в 100%, 95%, 85%, и 70% этанола в течение 5 мин каждый следуют DI воды в течение 5 мин. Продолжайте шаг 7,6.
  2. Для замороженных секций ткани, возьмите разделы сразу из морозильной камеры и погрузите их в 10% NBF в течение 10 мин. Вымойте в 1x PBS три раза в течение 5 мин каждый. Промыть в воде в течение 5 мин.
  3. Пятно ядер с гематаклином в течение 3 мин. Промыть в проточной водопроводной воде.
  4. Дифференцировать путем погружения 1-2 раза в 0,3% кислотного алкоголя (0,3% HCl в 70% этанола). Промыть в проточной водопроводной воде в течение 5 мин.
  5. Добавить bluing агент для 30 s. Промыть в проточной водопроводной воды в течение 5 мин. Погрузить в 95% этанола в течение 30 с.
  6. Инкубировать эозином на 90 с при комнатной температуре. Обезвоживание в 3 изменениях 100% этанола по 5 мин каждый.
  7. Погрузите дважды в 100% ксилена в течение 5 мин каждый. Добавьте дистирол-пластик-ксилен (DPX0 монтажа носителя на слайд и добавить coverslip. Пусть это вылечить на ночь до изображения.

8. 1-(4-(Xylylazo)xylyl-azo)-2-нафтальное окрашивание

  1. Приготовьте раствор 1-(4-(Xylylazo)xylyl-azo-2-нафталь.
    1. Добавьте в стакан с 100 мл пропилена гликоля 0,5 г 1-(4-(Xylylazo)xylyl-azo-2-нафтальпол порошок. Нагрейте до 95-100 градусов по Цельсию, помешивая не менее 30 мин. Предотвратить температуру от превышения 100 градусов по Цельсию.
    2. Снимите стакан с огня и дайте немного остыть. Налейте раствор через качественную фильтровальную бумагу 4-го класса, чтобы удалить все остаточные частицы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может храниться при комнатной температуре и должен быть отфильтрован через фильтр шприца 0,45 мкм непосредственно перед окрашиванием.
  2. Пятно замороженных тканей разделов.
    1. Удалите слайды из морозильной камеры -80 градусов и высушите воздух в течение 30 мин. Предварительно охладить 10% NBF при -20 градусов по Цельсию в течение 30 минут в банке Коплина. Исправьте горки при комнатной температуре в течение 10 мин. Вымойте в воде DI 3 раза в течение 5 минут каждый.
    2. Удалите избыток воды, используя деликатную задачу протрите перед погружением в пропиленгликоль 2 раза в течение 5 минут каждый. Удалите слайды из пропилена гликоль. Не смягчить.
    3. Поместите слайды в шприц фильтрованного масла Red O окрашивающий раствор для 3 ч при комнатной температуре.
    4. Дифференцируйте, размещая слайды в 85% пропилена гликоль в течение 5 мин. Промыть образцы в PBS дважды в течение 5 минут каждый.
    5. Образцы пятен с гематоксилин на 30 с. Вымойте в проточной водопроводной воде в течение 5 мин, а затем поместите горки в воду DI.
    6. Маунт образцы с использованием водного на основе монтажа среды и позволяют средствам массовой информации высохнуть на ночь перед изображением.

9. Реология

  1. Принесите предгелевые растворы от шага 5.4 до реометра на льду.
  2. Прикрепите 25-мм руку и пластину к реометру. Откройте программное обеспечение для реологии на компьютере, подключенном к реометру.
  3. Выполните вращательное отображение и определите нулевой разрыв. Поднимите руку, когда полный.
  4. Пипетка 500 л предварительного геля на тарелке. Опустите руку до тех пор, пока раствор предварительного геля полностью не занимает зазор между пластиной и рукой. Будьте консервативны, потому что опуская руку мимо этой точки приведет к предварительного гель решение разлива из стороны.
  5. Выполните частотный развертки на предварительно гель раствор от 0,1 до 100 Гц после того, как он остался на 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
  6. Поднимите руку реометра, когда это будет завершено. Протрите жидкость с деликатной задачей протрите. Промыть с DI воды и протрите с деликатной задачей протрите. Повторите шаги 9.4-9.6 с дополнительными образцами.

10. Фаллоидин конъюгированное окрашивание F-актина

  1. Принесите фаллоидный конъюгировать раствор до комнатной температуры. Кратко центрифуги на низкой скорости до открытия. Aliquot достаточное решение для ассоциации, а остальное хранить при -20 градусах Цельсия.
  2. Разбавить 1000x фаллоидин конъюгированного стокового раствора к 1x рабочему раствору, добавив 1 раствор запаса qL до 1 мл 1x PBS и 1% бычьего сывороточных альбумина (BSA). Это делает достаточно для 10 скважин (100 л/колой).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать простой 1x PBS, но 1x PBS и BSA предпочтительнее, чтобы предотвратить фаллоидный конъюгировать от прилипания к трубе. Не храните это решение после ассоциат. 1 к Л синего флуоресцентного красителя (см. таблицуматериалов) рабочий раствор может быть добавлен к пятнам для ядер. Рабочий раствор можно сделать путем смешивания 1 л из 20 мм синего флуоресцентного красителя с 11,3 л 1х1x PBS.
  3. Аспирные носители из скважин (шаг 6.1). Промыть скважины с 1x PBS.
  4. Добавить 10% NBF. Инкубировать скважины с 10% NBF в течение 20 минут при комнатной температуре. Удалить супернатант. Вымойте 3 раза с PBS в течение 5 минут каждый раз.
  5. Добавить 0,1% т- Octylphenoxypolyethoxyethanol в PBS в течение 5 мин. Аспир и промыть 3 раза с PBS в течение 5 минут каждый раз.
  6. Добавьте 100 л рабочего раствора от шага 10.2 к каждому колодцу. Инкубировать 1 ч при комнатной температуре. Аспир и мыть 3 раза с PBS в течение 5 минут каждый раз. Оставьте в PBS при 4 градусах По Цельсия.
  7. Аспирируйте и убирайте колодцы из прокладки на камерной горке. Используйте игольчатый нос пинцет, чтобы удалить прокладку со слайда. Маунт и coverslip образцы с использованием aqueous основе монтажа среды. Разрешить вылечить (5 мин).
  8. Наблюдайте клетки под флуоресцентным микроскопом при возбуждении/выбросе 590/618 нм.

11. Перетаскание жизнеспособности

  1. Промыть клетки с PBS Dulbecco (DPBS). Добавьте 100 кЛ DPBS, содержащий 1 мкм кальций AM и 2 мкм этидия омидимера к каждой скважине. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
  2. Изображение 16-колодец камеры слайд флуоресценции микроскопии. Кальцин ацетоксиметил (calcein AM) можно наблюдать при возбуждении/выбросах 494/517 нм. Эхидий гомодимер можно наблюдать при возбуждении/выбросах 528/645 нм.
  3. Прочитайте 96-ну хорошую пластину на считывателе пластин, используя те же длины волн в шаге 11.2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MFPs были decellularized после облучения с помощью процедуры, показанной на рисунке 1A. MFPs pre-decellularization (Рисунок 1B) и post-decellularization (рисунок 1C) показаны. Децеллюляризация была подтверждена с использованием гематоксилина и эозина (H и E) окрашивания, и 1-(No 4-(Xylylazo)xylyl'azo)-2-нафтоль окрашивания был использован для оценки содержания липидов (Рисунок 2). Реологические свойства гидрогелей ECM так...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод гидрогеля во многом зависит от количества стартовой ткани. M'urine MFPs малы, и процесс децеллюляризации приводит к значительному сокращению материала(Таблица 1). Процесс может быть повторен с более MFPs увеличить конечную доходность. Мельница является еще одним важным шагом, который может привести к потере материала. Другие показали успех с криогенной мельницы, но этот протокол основан на фрезерования через портативный раствор и электрическую дрель с пестиком вложения8...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят д-р Лаура Л. Бронсарт для предоставления GFP- и luciferase-4T1 клетки, д-р Эдвард Л. Лагори за советом по 1 -(No 4-(Xylylazo)xylyl'azo)-2-нафталь окрашивания, д-р Крейг Л. Дюваль для IVIS и лиофилизатор использования, и д-р Скотт Гюль Использовать. Это исследование было финансово поддержано грантом NIH #R00CA201304.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% нейтральный буферизованный формалин, куб с краномVWR16004-128-2-метилбутан
Alfa Aesar19387-AR
2000ex РеометрTA Instruments10D4335реометр
Бычья сыворотка АльбуминSigma-AldrichA1933-25G-кальцеин
ацетоксиметил (кальцеин AM)Molecular Probes, Inc.C1430-D-Люциферин
Светлячок, соль калиябиосинт Химия и БиологияL-8820(S)-4,5-дигидро-2-(6-гидрокси-2-бензотиазолил)-4-тиазолкарбоновая кислота калийная соль
DPX Монтант для гистологииSigma-Aldrich06522-500ML-фосфатно-солевой
буферный раствор ДульбеккоGibco
14040133-Эозин-Y с флоксиномRichard-Allan Scientific71304гомодимер
эозина этидияМолекулярные зонды, Инк.E1169гомодимер этидия-1 (EthD-1)
Фетальная бычья сывороткаSigma-AldrichF0926-500ML-Fisher
Healthcare Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisher Scientific23-730-571криостатная среда для встраивания
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01монтажная среда на водной основе
FreeZone 4.5Labconco7751020лиофилизатор
Hoechst 33342 Раствор (20 мМ)Thermo Scientific62249синий флуоресцентный краситель
Соляная кислотаSigma-Aldrich258148-500ML-IVIS
Lumina IIIPerkinElmerCLS136334биолюминесцентная система визуализации
Kimtech Science KimwipesKimberly Clarkделикатные рабочие салфетки
n-пропанол (без перекиси/секвенирование), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1130-500-Oil
Red OSigma-AldrichO0625-25G1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-нафтол
OPS Diagnostics CryoGrinderOPS Diagnostics, LLCCG-08-02-PBS
(10X), pH 7.4Quality Biological, Inc.119-069-151Фосфатно-солевой буфер
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-122-Пепсин
из слизистой оболочки желудка свиньиSigma-AldrichP6887-5Gпепсин
Надуксусная кислотаSigma-Aldrich77240-100ML-Phalloidin-iFluor
594 Реагент (ab176757)abcamab176757конъюгат
фаллоидинаПропиленгликольSigma-AldrichW294004-1KG-K-Richard-Allan
Scientific Signature Series Bluing ReagentRichard-Allan Scientific7301LBluing
agent Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211Richard-Allan Scientific7211-RPMI
Medium 1640Gibco11875-093-Дезоксихолат
натрия, 98%Frontier ScientificJK559522дезоксихолевая кислота
сахарозаSigma-AldrichS5016-Triton
x-100Sigma-AldrichX100-100MLem>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0,25%), фенол красныйGibco25200-056-Ватман
качественная фильтровальная бумага, 4 классВатман1004-110качественная фильтровальная бумага 4 класса
Xylenes (Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificX5-4-
<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  3. Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
  4. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
  5. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  6. Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
  7. Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
  8. Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
  9. Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
  10. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  11. Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
  12. Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
  13. Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
  14. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
  15. Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
  16. Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
  17. Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
  18. Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
  19. Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
  20. Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Matrix HydrogelsRadiation EffectsDecellularization ProcessMurine Mammary Fat PadHydrogel FabricationRheological PropertiesCell Proliferation AssayPhalloidin Conjugate StainingFluorescence MicroscopyScanning Electron Microscopy

Related Articles