Постдифференцирование Replating человека Плюрипотентные стволовые клетки полученных нейронов для высокого содержания скрининга неуритогенеза и синапсового созревания

Summary

Этот протокол описывает детальную процедуру для resuspending и culturing людские нейроны stem клетки выведенные которые ранее были продифференцированы от нервных прародителей in vitro на множественные недели. Процедура облегчает анализы нейритов, синапсов и поздневых нейронных маркеров на основе изображений в формате, совместимом со световой микроскопией и скринингом с высоким содержанием.

Abstract

Нейроны, отличаемые в двухмерной культуре от человеческих плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронными клетками-прародителями (NPC), представляют собой мощную модельную систему для изучения механизмов заболевания и проведения скрининга высокого содержания (HCS) для допроса соединения библиотек или определить фенотипы генных мутаций. Однако, с человеческими клетками переход от NPC к функциональному, возмужалым нейрону требует нескольких неделей. Синапсы обычно начинают формироваться после 3 недель дифференциации в монослойной культуре, и несколько нейронных белков, например, более поздний экспресс-нейрональный маркер NeuN, или слой 5/6 церереального коркового нейронного маркера CTIP2, начинают выражать около 4-5 недель после дифференциации. Это длительное время дифференциации может быть несовместимо с оптимальными условиями культуры, используемыми для небольших, многофункциональных платформ HCS. К числу многих проблем относятся потребность в хорошо совмещенной, равномерно распределенной ячейке с минимальной кластеризацией клеток и культурных процедурах, способствующих долгосрочной жизнеспособности и функциональному созреванию синапсов. Один из подходов заключается в дифференцировании нейронов в формате большого объема, а затем перенабчить их на более позднем этапе в HCS-совместимых мультискважин. Некоторые основные проблемы при использовании этого реплатингового подхода касаются воспроизводимости и жизнеспособности клеток из-за стрессовых нарушений дендритной и аксональной сети. Здесь мы демонстрируем детальную и надежную процедуру ферментативной перезагрузки антропогенных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) полученных нейронов после их дифференциации в течение 4-8 недель в крупнообъемном формате, передавая их 384-колодствующим микротитеру пластины, и культивирование их в течение еще 1-3 недель с отличным выживанием клеток. Это replating человеческих нейронов не только позволяет изучение синапса сборки и созревания в течение двух недель с момента повторного, но и позволяет исследования регенерации нейрита и роста конуса характеристики. Мы приведомляем примеры масштабируемых анализов на неуритогенез и синаптогенез с помощью платформы 384 колодца.

Introduction

Нейроны, полученные из стволовых клеток человека (hiPSC), становятся все более актуальными в области фундаментальных исследований, разработки лекарственных средств и регенеративной медицины. Рабочие процессы и процедуры для оптимизации их культуры и обслуживания, а также повышения эффективности дифференциации в конкретные нейрональные подтипы, быстро развиваются^1,2. Для повышения полезности и рентабельности нейронов, полученных из стволовых клеток человека, в качестве модельных систем, поддающихся анализу высокого содержания при обнаружении лекарственных средств и проверке целей, полезно уменьшить время культивирования, необходимое для создания зрелых, функциональных нейронов, сохраняя при этом максимальную прочность, воспроизводимость и релевантность фенотипа. Хотя трехмерные органоидные культуры являются движущей прорывв в исследовании нейроразвития³, 2-мерные монослойные культуры особенно совместимы с автоматизированными приложениями на основе изображений из-за их минимальной толщины тканей.

Однако адаптация методов скрининга на основе изображений к моделям неврологических и нейроразвития человека сталкивается с серьезной проблемой. Затяжные временные рамки, в течение которых нервная система человека созревает in vivo, требуют длительного времени в культуре для размещения естественных программ экспрессии генов и достижения нейронального созревания.

Одним из практических последствий длительной программы дифференциации нейронов является то, что поддержание hiPSC полученных монослойных культур должны быть устойчивыми в течение многих недель для достижения адекватной зрелости синапса. В течение этого времени, нейронные прародители, которые остаются недифференцированными продолжают делиться. Они могут быстро перерасти культуры и узурпировать содержание питательных веществ, необходимых для поддержания жизнеспособных постмитотических нейронов. Активно едить нервные клетки-прародители (NPC) также могут конкурировать с нейронами для роста субстрата. Это может сделать такие культуры подвержены проблемам плохой адгезии, состояние, неподходящее для анализов на основе изображений. Кроме того, многие исследователи считают, что чем меньше объем культуры, тем больше трудностей в поддержании здоровой популяции дифференцированных нейронов достаточно долго, чтобы наблюдать поздние стадии дифференциации нейронов. Другими словами, анализы созревания синапса с использованием подходов скрининга высокого содержания (HCS) могут быть очень сложными для нейронов, полученных человеком.

Чтобы обойти некоторые из этих проблем, была использована процедура повторного приостановки и повторного использования ранее дифференцированных нейронов, полученных от hiPSC. Во-первых, это позволяет изучать невритный рост (или, точнее, регенерацию неврита) в популяции полностью приверженных нейронов. Во-вторых, повторное переделывание ранее дифференцированных нейронов из большого формата громкости (например, 10 см пластин или больше), вплоть до небольших форматов громкости (например, HCS-совместимых 96- или 384-пузырчатого микротитерных пластин) позволяет значительно сократить общее время культивирования в небольшое состояние объема. Это облегчает изучение синапса сборки и созревания в течение последующих недель в пробирке.

Тем не менее, повторное переплетение зрелых нейронов, которые уже создали длинные невриты и сложную сеть подключения представляет собой несколько проблем, одна из которых иногда высокая и переменная скорость клеточной смерти. Здесь мы описываем процедуру повторного отреплирования, которая приводит к отличной выживаемости клеток и воспроизводимости. Как правило, нейроны подвергаются воздействию протеолитических ферментов в течение коротких инкубационных периодов (обычно 3-10 мин) для того, чтобы отделить клетки от субстрата до тритурации. Это краткое время протеолиза обычно используется для повторного приостановки и прохождения многих типов деления клеток, в том числе ненейрональных клеток и недифференцированных прародителей^4,5,6. Однако для дифференцированных нейронов, несущих длинные, взаимосвязанные невриты, важно не только отделить клетки от субстрата, но и нарушить дендритную и аксональную сеть, чтобы изолировать отдельные клетки при минимизации повреждений. Действительно, толстая сетка нейронов обычно имеет тенденцию отделяться от субстрата как единый лист, а не как отдельные клетки. Если не принимать меры по ослаблению толстой сети нейритов, нейроны не только становятся необратимо поврежденными во время тритурации, но многие из них не проходят через фильтр, используемый для удаления комков, что приводит к плохой урожайности клеток. Ниже мы описываем простую модификацию широко используемой процедуры инкубации протеазы для борьбы с этими трудностями.

В описанном ниже протоколе нейроны инкубируются в течение 40-45 мин с легкой протеазой, например, протеолитическим ферментом (например, Accutase). В течение первых 5-10 минут после добавления фермента, нейронная сеть взлетает из субстрата в виде листа. Инкубация с протеаза продолжается еще 30-40 минут, прежде чем приступить к мягкой трикуляции и фильтрации. Это дополнительное время инкубации помогает гарантировать, что переваривание материала расслабляет межклеточной сети, тем самым гарантируя, что последующее тритурирование производит приостановление отдельных клеток. Эта процедура максимизирует единообразие распределения клеток при повторном окупаемости при минимизации клеточной смерти. Мы успешно применили этот метод повторного отправления к hiPSC полученных нейронных культур, порожденных различными протоколами дифференциации^7,8 и из различных линий hiPSCs. Процедура номинально подходит для использования с большинством или всеми линиями стволовых клеток, полученных нейронов. Мы заметили, что продолжительное время инкубации протеазы не является абсолютно необходимым для перекалибровки культур из плит малого формата (например, диаметр 35 мм); однако, как мы показываем здесь, оно обеспечивает значительно преимущество от replating от плит большого диаметра (например, диаметр 10 сантиметров или большле), вероятно потому что neurites в таких плитах могут удлинить очень длинние процессы и сформировать плотно взаимосвязанный блок.

Здесь мы демонстрируем этот метод и кратко иллюстрируем его применение в анализах для раннего неуритогенеза и для созревания синапсов, который включает в себя кластеризацию до- и постсинаптических белков вдоль дендритов и аксонов, а затем их более поздние колокализация на синаптических сайтах. Примеры подчеркивают преимущества, которые дает этот протокол в сохранении жизнеспособности и воспроизводимости клеток. Во-первых, это позволяет следователям изучить ранние шаги в неуритогенез человека. Экспериментальная обстановка похожа на широко используемые первичные культуры корковых или гиппокампальных нейронов, где клетки извлекаются из позднего плода или раннего послеродового мозга, разобщены тритурой после мягкого лечения протеазы, и разрешено инициировать невриты или регенерировать невриты, которые были разорваны в процедуре^9,10. Подобно таким первичным нейронам грызунов, нейроны, полученные из hiPSC, начинают формировать или регенерировать свои невриты в течение нескольких часов после повторного тестирования, что позволяет создавать конусы роста и морфологию нейритов в среде, оптимальной для высокой пространствентемпоральной визуализации с меньшим количеством окружающих недифференцированных клеток. Мы заметили, что неврит ный рост более синхронизирован по сравнению с переменной задержки и различные темпы роста видели, когда нейроны впервые начинают дифференцировать сяочку от популяции прародителей. Кроме того, переплатывание позволяет анализы нейронов, выражающих нейронные маркеры подтипа, которые обычно появляются позже в нервном развитии, такие как корковый слой 5/6 транскрипционный фактор CTIP2 (Куриный овальбумин вверх по течению промотор транскрипции взаимодействующий с фактором белок 2), или паннейрональный маркер NeuN¹¹. Особенно полезной особенностью подхода replating является то, что синаптогенез протекает в сроки, совместимые с HCS.

Protocol

1. Период дифференциации до переплатывания

1. Дифференцируйте нейроны на 10 см блюд, используя протокол выбора^7,8, пока нейроны сформировали толстую сеть с их процессами и выразить не только ранние нейронные маркеры, такие как MAP2 или TuJ1, но и поздние маркеры, такие как NeuN.
2. Изменение половины среды выбора каждые 4 дня в процессе дифференциации нейронов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более обширные или частые средние изменения разбавляют существенные трофические факторы, и могут не благоволить к созреванию.
   1. Для нейронов WT126, полученных iPSC, использовать следующие пост-дифференциации культивирования средств массовой информации: 5 мл 100x N2 дополнения, 10 нг/мЛ BDNF, 10 нг/мл GDNF, 1 мкг /мл ламин, 200 мкм аскорбиновой кислоты, 1 мкм дибутирил-CAMP и 10 мл SM1 для 500 мл Dulbeco питательная смесь F-12 (DMEM/F12). Постепенно, используя полумедийные изменения, заменяйте нейронную базальную среду(Таблицаматериалов) и те же добавки.
   2. Для iPSC полученных CVB WT нейронов, используйте следующие пост-дифференциации культивирования среды: 500 мл нервного базального A medium(Таблица материалов) и 500 мл DMEM/F12 среды с 2 мкг /мл ламинина, 10 мл глутамина добавок (Таблица материалов, 0,75 мг/мл бикарбоната натрия, 5 мл минимальной незаменимой среды (МЭМ) несущественные аминокислоты, 0,2 мм аскорбиновой кислоты, 10 нг/мл BDNF, 20 мл 50x B27 и 10 мл 100x N2 добавка.

2. Покрытие Multiwells

1. За день до переплатывания, пальто с поли-L-орнитином (PLO). Растворите ООП в стерильной воде, чтобы сделать бульонный раствор (10 мг/мл). Храните этот запас при -20 градусах по Цельсию. Разбавить ООП 1:100 в воде, чтобы дать концентрацию 50 мкг/мл при покрытии стекла и 1:1,000 соотношение (10 мкг/мл) при покрытии пластика.
2. Нанесите покрытие непосредственно на целевые пластины. Используйте объем покрытия, соответствующий размеру пластины (т.е. для 24-хорошо пластины, нанесите 500 л раствора ООП на скважину).
3. Разрешить пластины сидеть в темноте на ночь при комнатной температуре.
4. Извлеките пластины с покрытием в день повторного покрытия и перенесите в стерильный шкаф для биобезопасности.
5. Придумать раствор ООП и дважды промыть стерильной водой.
6. Разбавить ламинин (1,15 мг/мл) в фосфатно-буферном сольном (PBS) в 1:400 разбавления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оттойте ламинин при 4 градусах Цельсия и быстро добавьте в PBS, чтобы избежать агрегации ламинина и неравномерного покрытия.
7. Аспирируйте стерильную воду и наносите 500 л ламинина на скважины, ранее покрытые ООП.
8. Поместите пластины в инкубатор 37 градусов по Цельсию минимум на 4-6 ч. Используйте более длинные инкубации, до 16 ч, для стеклянных поверхностей. Используйте последовательное время инкубации.

3. Переплата дифференцированных нейронов

1. Промыть пластину дифференцированных нейронов с PBS раз мягко. Разогнать PBS мягко вниз по стене пластины, а не непосредственно на клетки, чтобы избежать их нарушения.
2. Аккуратно аспирировать PBS, стараясь избежать прикосновения к клеткам непосредственно, но аспирировать от края блюда в то время как опрокидывания его к исследователю.
3. Нанесите при минимум 1 мл протеолитического фермента(таблицаматериалов) на тарелку 10 см и верните клетки в инкубатор. Добавьте немного большие объемы, если в комнате культуры тканей высокая скорость испарения из-за низкой влажности.
4. Инкубировать клетки протеолитическим ферментом в течение 40-45 мин, чтобы отделить их от пластины и отделить их от других нейронов в нейронной сети.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки на этом этапе имеет решающее значение. Утоления протеазы слишком рано может привести к увеличению смерти клеток после повторного. Производитель протеолитических ферментов рекомендует использовать температуры значительно ниже 37 градусов по Цельсию при более длительных инкубационных периодах для прохождения клеточных линий (например, на ночь при температуре 4 градусов По Цельсию). Тем не менее, обработки нейронов при 4 градусах Цельсия следует избегать, так как они часто показывают плохое выживание после холодного воздействия. Производитель также утверждает, что инкубация 60 мин с ферментом при 37 градусах Цельсия приводит к его ферментатической инактивации. Однако, по опыту авторов, 40-45 мин инкубации hiPSC полученных нейронных культур при 37 градусах Цельсия достаточно для эффективной диссоциации и отличного выживания нейронов при повторном оцепенении.
5. Проверьте нейроны на фазово-контрастном микроскопе во время инкубационного времени и позвольте лечению протеазы продолжаться до тех пор, пока нейронная сеть полностью не отсоединяется от пластины и не начнет распадаться на мелкие листы при кратком встряхивании пластины под Микроскоп.
6. Утолить протеазу с помощью 5 мл свежих DMEM-носителей на 1 мл протеазы в 10 см пластины, чтобы остановить пищеварение. Аккуратно тритурировать клетки против пластины 5-8 раз, чтобы нарушить сеть, используя серологические пипетки. Будьте осторожны, чтобы не применять слишком большое давление при тритурации, как дифференцированные нейроны являются хрупкими. Не используйте наконечник P1000, так как конец слишком острый и узкий, и, таким образом, может просто или повредить нейроны.
7. Применить раствор с клетками через клеточный ситечко с сеткой диаметром 100 мкм в свежем 50 мл конической трубки капля за каплей.
8. Промыть ситечко с дополнительным5 мл свежих средств DMEM, после того, как клетки фильтруются до конца.
9. Спиновые клетки в центрифуге скамейки при 1000 х г в течение 5 мин.
10. Вернуть коническую трубку в шкаф биобезопасности и аспирировать большинство носителей, оставляя около 250 л, чтобы обеспечить клетки удерживают влагу.
11. Аккуратно приостанавливайте клетки в 2 мл свежих dMEM-носителей. Не пипетка гранулы против стороны трубки. Вместо этого, аккуратно инвертировать конические 2-3 раза и пройти клетки через конец 5 мл серологического пайпе, чтобы выбить их.
12. Нанесите 10 л перепровиваемых нейронов на край гемоситометра.
13. Добавьте 8-10 л трипан-голубого в каплю клеток для оценки жизнеспособности клеток во время этого шага повторного действия. Нанесите 10 кЛ этой смеси на гемоситометр или другие автоматические счетчики клеток. Оцените как жизнеспособные те клетки, которые являются фазой яркие и исключить трипан синий краситель.
14. Определить количество жизнеспособных клеток / мл, и подготовить, чтобы разбавить содержимое конической трубки в соответствии с желаемой плотностью клеток.
15. Плита 10 000 клеток на скважину для 384-хорошо йлевой пластины; пластина 150 000-200 000 клеток на скважину для 24-хорошей пластины.
16. Добавьте свежий DMEM в коническую трубку перепровилотых клеток для достижения соответствующего разбавления и добавьте дополнительные соответствующие добавки, такие как B27 и/или BDNF, в зависимости от требований конкретной клеточной линии.
17. Аккуратно наклоните коническую трубку, чтобы перемешать 2-3 раза.
18. Аспирла ламинина покрытие из 24-хорошо пластины, или из 384-хорошо многовелл пластины с помощью 16-канальный пипетка и промыть один раз с PBS.
19. Аспир PBS с помощью P1000 для 24-колодец пластины, или 16-канальный пипетка для 384-колодец пластин.
20. Применить клеточное решение для каждого хорошо в цифре восемь движения, чтобы избежать слипания. Равномерность покрытия также может быть оптимизирована с помощью автоматизированных устройств обработки жидкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление ламинина в средствах массовой информации, начиная 2-4 дней после повторного повторного также помогает поддерживать однородное распределение клеток.
21. Повторите шаги 3.19 и 3.20 для каждой скважины.
22. Вернуть пластину в инкубатор, установленный при 37 градусах по Цельсию и 5% CO_2.
23. После 2 дней, начать менять половину среды каждые 4 дня с помощью пост-дифференциации культивирования средств массовой информации, описанные в разделе 1.2. После желаемого времени созревания, исправить культур, используя 3,7% формальдегида при 37 градусов по Цельсию и пятна клеток в соответствии с экспериментальными требованиями.

4. Сотовый Жизнеспособность Анализы после повторного

1. Добавьте репортера ранней смерти клеток (VivaFix: 0,5 л из 50-Л стежка на 500 л культурных носителей на скважину) после краткого вихря акционерного раствора.
2. Изображение живых и мертвых клеток культивируется на стеклянно-дно multiwells, после 20 мин, без каких-либо стирки шаг, так как краситель флуоресцтолько только один раз внутри клеток, или исправить и совместно пятно с 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и / или другие антитела до изображения изображения с помощью конфокального микроскопа.

5. Иммуностогирование

1. Исправьте культуры с 3,7% формальдегида в PBS плюс 120 мм сахарозы в течение 20 мин при 37 градусах Цельсия.
2. Промыть и пронизовать 0,2% Triton X-100 в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем блокировать в течение 30 мин с 2% бычьей сыворотки альбумина (BSA).
3. Аспирировать BSA без промывки и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре с кроликом анти-MAP2 антитела 1:1000, мышь анти-3 тубулин (TuJ1) антитела 1:2,000, курица анти-NeuN антитела (1:100) и крысы анти-CTIP2 антитела (1:500), или с мышью анти-PS9 ( 1:200), кролик анти-синапсин 1 (1:200) и курица анти-MAP2 антитела для синаптической окрашивания.
4. Промыть pbS и инкубировать с Alexa Fluor-конъюгированных вторичных антител плюс DAPI в течение 45 минут при 37 градусах Цельсия.
5. Наконец, мыть дважды с PBS до изображения.

6. Изображение кальция

1. Заразить культивированные клетки AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (Институт биологических исследований Salk, GT3 Core Facility) в течение 10 дней после переплатывания и изображения для оценки спонтанных переходных кальция в 3-4 недели после переплатывания.

7. Приобретение и анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о системе приобретения, пожалуйста, обратитесь к Calabrese et al.¹².

1. Используйте модуль визуализации для ручного или автоматизированного получения изображений, а также модуль программного обеспечения для анализа изображений, такой как CellProfiler^13,для морфометрических измерений.
2. Рассчитайте среднюю длину положительных невритов TuJ1 и положительных дендритов MAP2, измеряя общую длину на поле зрения, разделенную на количество нейронов (DAPI и MAP2 или TuJ1 срабатываний) в одном поле.

Results

Replating hiPSCs-производных нейронов, которые были дифференцированы в течение нескольких недель предлагает несколько преимуществ. Однако, отсоединение и повторное дифференцированное нейроны, которые имеют длинные, взаимосвязанные дендриты и аксоны(Рисунок 1А) может привести к высокой доле необратимо поврежденных нейронов.

Как описано в разделе протокола, мы использовали инкубацию с протеолитическим ферментом, чтобы отделить нейроны от субстрата. ...

Discussion

Мы продемонстрировали прямолинейную процедуру повторного и повторного обновления нейронных культур человека, которая оптимизирует жизнеспособность, успех дифференциации и субклеточную визуализацию таким образом, что она совместима с платформами скрининга с высоким содержанием, и другие анализы, имеющие отношение к обнаружению наркотиков. На рисунке 6 иллюстрируется общий рабочий процесс и примеры таких приложений.

Хотя здесь мы сосредоточились на hiPSC полученных ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильный>Послойный фильтрующий материал
L-аскорбиновая кислота	Sigma	A4403	Добавьте 1 мл 200 мМ материала к 1 л среды N2B27
Дибутирил-цАМФ	Sigma	D0627	Добавьте 1 &микро; M
Human BDNF	Peprotech	450-02	10 нг/мл конечная концентрация
B27 (50x)	Thermofisher Scientific	17504044	Добавить 20 мл к 1 л N2B27 среды
DMEM/F12 с глутамаксом	Thermofisher Scientific	31331093	Добавить N2 и распределить по 50 мл коникул; крышки для парапленки
Human GDNF	Peprotech	450-10	10 нг/мл конечной концентрации
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050038	Добавить 10 мл на 1 л N2B27 среды; глютаминовая добавка
Mouse Laminin	Sigma	P3655-10 мг	Добавить 100 &; L до 50 мл N2B27
MEM Заменимые аминокислоты	Thermofisher Scientific	11140035	Добавить 5 мл до 1 л N2B27 среды
N2 (100x) Дополнить	Life Technologies	17502048	Добавить от 5 мл до 500 мл среды
Нейробазальная среда А	Thermofisher Scientific	10888022	Объединить с DMEM/F12 для получения среды N2B27 для клеток CVB; нейронная базальная среда А
Нейробазальная среда Нейробазальная среда	Thermofisher Scientific	21103049	для клеток WT126; нейробазальная среда
SM1 Добавка	StemCell Technologies	5711	Добавить 1:50 в среду
Бикарбонат натрия	Thermofisher Scientific	25080-094	Добавить 10 мл к 1 л N2B27 среда
Plate Preparation>
10 см Чашки для культуры тканей	Fisher Scientific	08772-E	Пластиковые посуды, обработанные TC
6-луночные тарелки для культуры тканей	Thomas Scientific	1194Y80	NEST пластины
Mouse Laminin	Life Technologies	23017-015	Добавьте 1:400 на пластик
Poly-Ornithine	Sigma	P3655-10mg	Добавьте 1:1,000 на пластик
UltraPure Distilled Water	Life Technologies	10977-015	Для разбавления Поли-L-орнитин
<сильно>регационные реагенты
100 мМ Клеточное сетчатое фильтр	Corning	431752	Стерильный, индивидуально упакованный
384-луночный планшет, непокрытый	PerkinElmer	6007550	Coat с PLO и Laminin
DPBS	Life Technologies	14190144	фосфатно-солевой буфер
Dulbecco384-луночные планшеты с полимерным D-лизином	PerkinElmer	6057500	Промойте перед покрытием ламинином
StemPro Accutase	Life Technologies	A1110501	Нанесите пластину 1 мл/10 см на 30-45 минут; протеолитический фермент
<прочный>Материалы фиксации
37% формальдегида	Fisher Scientific	F79-1	растворенный в PBS
Сахароза	Fisher Scientific	S5-12	0,8 г на 10 мл фиксатора
<сильного>Иммуноокрашивающие материалы
Alexa Fluor 488 Козий антимышиный	Инвитроген	A-11001	вторичное антитело
Alexa Fluor 568 Козье антикуриное	Инвитроген	A-11041	вторичное антитело
Alexa Fluor 647 Козье антикуриное	Invitrogen	A-21449	вторичное антитело
Alexa Fluor 561 Goat anti-rat	Invitrogen	A-11077	вторичное антитело
DAPI	Biotium	40043	визуализирует ДНК
Мышиное антитело против b3-тубулина (TuJ-1)	Нейромика	MO15013	ранней стадии нейронального маркера
Антитело крысы против CTIP2	Abcam	ab18465	слой 5/6 кортикальный нейроны
Куриное антитело против MAP2	LifeSpan Biosciences	LS-B290	ранняя стадия нейронного маркера
Куриное антитело против NeuN	Millipore	ABN91	поздняя стадия нейронального маркера
Кроличьи антитела против MAP2	Шелли Халпейн	N/A	ранняя стадия нейронального маркера
Мышиное антитело против PSD-95	Sigma	P-246	постсинаптический маркер
Антитела кролика против Synapsin 1	Millipore	AB1543	пресинаптический маркер
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	GE Healthcare Life Sciences	SH30574,02	10% в PBS для блокирования
Titon X-100	Sigma	9002931	Разбавить до 0,2% на PBS для пермеабилизации
<сильный>Маркеры жизнеспособности
Vivafix 649/660	Biorad	135-1118	маркер гибели клеток
Calcium Imaging
Название реагента/ Оборудование	Компания	Каталожный номер	Комментарии/Описание
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE	ИНСТИТУТ SALK, GT3 Core Facility	N/A	кальциевый репортер в системе доставки
вирусовhiPSC-derived NPC
WT 126 (Y2610)	Gage lab	N/A	Marchetto et al., 2010
CVB WT24	Yeo and Goldstein labs	N/A	не опубликовано