Изображений, обработки протокол для анализа распространения и размер кластера мембранных рецепторов по микроскопии флуоресцирования

Summary

Здесь мы представляем собой протокол для одной частицы, отслеживания анализа изображений, что позволяет дать количественную оценку коэффициентов диффузии, типы движения и кластер размеров одной частицы, обнаруженных микроскопии флуоресцирования.

Abstract

Отслеживание на видео последовательности и задняя анализ их траекторий частиц в настоящее время является общей операцией во многих биологических исследованиях. С помощью анализа рецептор клеточной мембраны кластеры как модель, мы представляем подробный протокол для этой задачи анализа изображений, с помощью Matlab процедуры и Фиджи (ImageJ): 1) определить регионы интереса и дизайн масок, адаптированных для этих регионов; 2) отслеживать частицы в видео микроскопии флуоресцирования; 3) проанализируйте характеристики распространения и интенсивности выбранных треков. Количественный анализ коэффициентов диффузии, типы движения и размер кластера получены микроскопии флуоресцирования и обработки изображений обеспечивает ценный инструмент для объективно определить динамику частиц и последствия изменения условия окружающей среды. В этой статье мы представляем подробные протоколы для анализа этих функций. Метод, описанный здесь не только позволяет одной молекулы отслеживания обнаружения, но также автоматизирует Оценка параметров поперечной диффузии на клеточные мембраны, классифицирует тип траектории и позволяет полный анализ таким образом преодолеть трудности в количественном определении размера пятна по всей траектории в клеточной мембраны.

Introduction

Мембранных белков, встроенных в липидный бислой находятся в постоянном движении, за счет диффузии тепловой. Их динамика необходимо регулировать клеток ответов, как межмолекулярные взаимодействия позволяют образование комплексов, которые варьируются в размерах от мономеров олигомеров и повлиять на стабильность сигнализации комплексов. Таким образом, изучение механизмов контроля динамики белков является новый вызов в клеточной биологии, необходимо понять сигнальных путей и определить функции непредвиденные клеток.

Были разработаны некоторые оптические методы для изучения этих взаимодействий в живых клетках¹. Среди них ....

Protocol

1. Подготовка биологических образцов

1. Расти Jurkat клеток в среде RPMI 1640 с 10% FCS, NaPyr и L-глютамин (полная RPMI). Electroporate Jurkat клетки (20 x 10⁶ клеток/400 мкл RPMI 1640 с 10% FCS) с вектором мономерных GFP-помечены хемокиновых рецепторов (CXCR4-AcGFP, 20 мкг) чтобы разрешить ее обнаружения, с помощью микроскопии флуоресцирования.
   Примечание: Это позволяет использовать другие мономерных флуоресцентных белков, таких как mCherry, mScarlet и др.
2. 24 ч после трансфекции анализа клеток в проточный цитометр определить жизнеспособность клеток и CXCR4-AcGFP выражение.
3. Выделите ячейки, выражая низкий уров....

Results

Использование этого протокола позволяет автоматизированного отслеживания частиц, обнаруженной в микроскопии флуоресцирования фильмы и анализ их динамических характеристик. Первоначально клетки являются transfected с белком дневно в сочетании отслеживаться. Соответствующий уровень рецепторов представляет на поверхности клетки, что позволяет SPT получается путем ячейку Сортировка (рис. 1). Выбранные ячейки анализируются TIRF микроскопии, который генерирует виде.......

Discussion

Описан метод легко выполнять даже без каких-либо предыдущий опыт работы с Matlab. Однако Matlab процедуры требуют чрезвычайно точность с номенклатуры различных команд и локализация различных папок, используемых программой. В деле отслеживания процедура анализа (шаг 3), несколько параметров могут быть изменены. Окно «Настройка Гаусса-смесь модель арматура» (шаг 3,8) контролирует, как U-трек будет обнаруживать одной частицы на видео. Это делается путем установки Гаусса смесь модель, как описано в разделе^3.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Клетки Jurkat человека	ATCC	CRL-10915	Т-клеточная линия человека. Любой другой тип клеток может быть проанализирован с помощью этого программного обеспечения
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Различные флуоресцентные белки могут быть прослежены и проанализированы с помощью этого рутинного
электропоратора Gene Pulse X Cell	BioRad		Мы используем 280 В, 975 мФ, для ячеек Jurkat. Используйте метод трансфекции, который лучше всего работает в ваших руках.
Проточный цитометр Cytomics FC 500	Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter	Beckman Coulter		В зависимости от уровня трансфекции, сортировка клеток может не потребоваться. Вы также можете использовать клетки со стабильной экспрессией адекватных уровней интересующего рецептора.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Используется для количественного определения количества рецепторов на поверхности клетки.
Стеклянное дно микролуночных тарелок	корпорации	MatTek P35G-1.5-10-C
Фибронектин человека из плазмы	Sigma-Aldrich	F0895
Рекомбинантный человек CXCL12	PeproTech	300928A
Перевернутый Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD камера	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	MathWorks, Natick, MA
Программное обеспечение U-Track2	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 программное обеспечение			Инструмент Matlab.  Для установки скачайте .zip файл с веб-страницы (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) и распакуйте файл в каталоге выбранного вами
программного обеспечения			GraphPad Prism