Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изображений, обработки протокол для анализа распространения и размер кластера мембранных рецепторов по микроскопии флуоресцирования

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59314

⸱

9 апреля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем собой протокол для одной частицы, отслеживания анализа изображений, что позволяет дать количественную оценку коэффициентов диффузии, типы движения и кластер размеров одной частицы, обнаруженных микроскопии флуоресцирования.

Аннотация

Отслеживание на видео последовательности и задняя анализ их траекторий частиц в настоящее время является общей операцией во многих биологических исследованиях. С помощью анализа рецептор клеточной мембраны кластеры как модель, мы представляем подробный протокол для этой задачи анализа изображений, с помощью Matlab процедуры и Фиджи (ImageJ): 1) определить регионы интереса и дизайн масок, адаптированных для этих регионов; 2) отслеживать частицы в видео микроскопии флуоресцирования; 3) проанализируйте характеристики распространения и интенсивности выбранных треков. Количественный анализ коэффициентов диффузии, типы движения и размер кластера получены микроскопии флуоресцирования и обработки изображений обеспечивает ценный инструмент для объективно определить динамику частиц и последствия изменения условия окружающей среды. В этой статье мы представляем подробные протоколы для анализа этих функций. Метод, описанный здесь не только позволяет одной молекулы отслеживания обнаружения, но также автоматизирует Оценка параметров поперечной диффузии на клеточные мембраны, классифицирует тип траектории и позволяет полный анализ таким образом преодолеть трудности в количественном определении размера пятна по всей траектории в клеточной мембраны.

Введение

Мембранных белков, встроенных в липидный бислой находятся в постоянном движении, за счет диффузии тепловой. Их динамика необходимо регулировать клеток ответов, как межмолекулярные взаимодействия позволяют образование комплексов, которые варьируются в размерах от мономеров олигомеров и повлиять на стабильность сигнализации комплексов. Таким образом, изучение механизмов контроля динамики белков является новый вызов в клеточной биологии, необходимо понять сигнальных путей и определить функции непредвиденные клеток.

Были разработаны некоторые оптические методы для изучения этих взаимодействий в живых клетках1. Среди них полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF), разработанная в начале 1980-х годов, позволяет изучения молекулярных взаимодействий на или вблизи мембраны клетки2. Для изучения динамических параметров мембранных белков траекторий полученных данных TIRF в живых клетках, требуется одна частица отслеживания метод (SPT). Хотя некоторые алгоритмы доступны для этого, мы в настоящее время использовать тех, опубликованной3 Jaqaman et al., что адрес неоднородности движения частиц в поле плотные частицы, связывая частицы между последовательными кадрами для подключения в результате трек сегменты в полной траектории (временные частиц исчезновение). Программное обеспечение захватывает частицы, объединение и разбиение что результат агрегации и диссоциации события3. Один из выходных данных этого программного обеспечения является обнаружение частиц по всей траектории, определяя их X и Y позиции в каждом кадре.

После обнаружения частиц, мы применяем различные алгоритмы для определения короткий слаборазвитость диффузии коэффициент (D1-4)4,5. Применяя анализ8 момент расширения спектра (MSS)6,7,или путем установки значения «альфа» регулировка среднеквадратичной перемещения (MSD) на кривой9мы также классифицировать частицы согласно Тип траектории.

Анализ пятно интенсивности флуоресценции изображения является общей целью для ученых в области10,11. Наиболее распространенными алгоритм, используемый является так называемый номер и яркость. Этот метод тем не менее не позволяет правильно по кадрам интенсивности обнаружения частиц в мобильных фракции. Таким образом, мы породили новый алгоритм для оценки этих частиц света--кадра и определить состояние их агрегирования. Как только координаты каждой частицы определяются с помощью программного обеспечения U-Track23, мы определяем его интенсивность в каждом фрейме над полным траектории, принимая также во внимание фона ячейки в каждом кадре. Это программное обеспечение предлагает различные возможности для определения интенсивности пятно и фона ячейки и, используя известные мономерные и димерной белков в качестве ссылки, вычисляет приблизительное количество белков в обнаруженных частиц (размер кластера).

В этой статье мы опишем тщательное руководство выполнение этих трех шагов: 1) обнаружения и отслеживания одной частицы вдоль видео микроскопии флуоресцирования, с помощью U-трек; 2) анализ коэффициент мгновенной диффузии (D1-4) из этих частиц и типа движения (замкнутых, бесплатно или режиссер) частиц с длиной траекторий по УВО; 3) измерения интенсивность пятно вдоль видео исправить предполагаемое фон флуоресценции для каждого пятна. Это позволяет Оценка размера кластера и определение Фотообесцвечивание шагов.

Использование этого протокола не требует специальных навыков и может быть выполнена в любой лаборатории с клеточной культуры, поток цитометрии и микроскопии. Протокол использует ImageJ или Фиджи (распределение ImageJ12), U-track3и некоторые ad hoc сделал процедуры (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-трек и специальных процедур пробегают Matlab, который может быть установлен в любой совместимый компьютер.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка биологических образцов

  1. Расти Jurkat клеток в среде RPMI 1640 с 10% FCS, NaPyr и L-глютамин (полная RPMI). Electroporate Jurkat клетки (20 x 106 клеток/400 мкл RPMI 1640 с 10% FCS) с вектором мономерных GFP-помечены хемокиновых рецепторов (CXCR4-AcGFP, 20 мкг) чтобы разрешить ее обнаружения, с помощью микроскопии флуоресцирования.
    Примечание: Это позволяет использовать другие мономерных флуоресцентных белков, таких как mCherry, mScarlet и др.
  2. 24 ч после трансфекции анализа клеток в проточный цитометр определить жизнеспособность клеток и CXCR4-AcGFP выражение.
  3. Выделите ячейки, выражая низкий уровень CXCR4-AcGFP путем сортировки клеток GFPнизких положительных клеток (рис. 1), как низкая выражение transfected рецептора требуется в TIRFM эксперименты для того, чтобы обеспечить отслеживание одной частицы для отслеживания отдельных траекторий9.
  4. Подсчитать количество рецепторов на поверхности клетки.
    Примечание: Как пример13, AcGFP меченых рецепторов ~ 8500-22000/клетки, соответствуют ~ 2-4.5 частиц/мкм2.
  5. Ресуспензируйте сортируются клеток в полной RPMI и проинкубируйте по крайней мере 2 ч при 37 ° C, 5% CO2. Центрифуга клетки (300 x g, 5 минут) и высокомобильна их в буфере TIRF (HBSS, 25 мм HEPES, 2% FCS, рН 7.3).
    1. Плита на 35 мм прозрачным дном микрорезервуар блюда (2-3 x 105 клеток/блюдо) покрытая фибронектина (20 мкг/мл, 1 ч., 37 ° C) в присутствии или отсутствии надлежащих лиганда (то есть, CXCL12, 100 Нм, 1 ч., 37 ° C). Инкубируйте клетки (20 мин при 37 ° C, 5% CO2) до приобретения изображений.
  6. Эксперименты с помощью микроскопа TIRF, оснащены EM-ПЗС, 100 x нефти погружение цель (HCX PL АПО 100 x / 1,46 NA) и 488 нм Лазер диода. Микроскоп позволяет контроля температуры и инкубации с CO2. Найдите и фокус ячейки с грубой и тонкой фокус ручки, используя яркие поля для сведения к минимуму эффекты Фотообесцвечивание. Для регулировки тонкой фокус в режиме TIRF используйте низкий лазерной интенсивности, недостаточно для обнаружения сингл частиц или побудить Фотообесцвечивание эффекты (мощность лазера 5%, 28 мкВт).
  7. Приобрести фильмы (последовательности изображений) приблизительно 50 s, минимизации временной интервал между кадрами. Проникновение затухающих поля должна быть 70-90 Нм глубины. Сохраните приобретенные фильмы для каждого экспериментальные условия как «.lif» (video.lif).
    Примечание: Фильмы в описываемом примере были приобретены на 49% при мощности лазера (2 МВт) с временем экспозиции 90 мс и интервал времени 98 МС, 49 s (500 кадров). Проникновение выбранного затухающих волн был 90 Нм.

2. Выбор изображений и создания масок

  1. Для каждого экспериментальные условия (video.lif) создайте новую папку (VideoName), который должен содержать разные папки для каждой серии. Каждая папка будет содержать папку «videoSeq» для изображений, видео и папку «результаты» для результатов анализа. Убедитесь, что структура файла на данный момент является следующее:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Ряд1/videoSeq
    VideoName/Ряд1/результаты
    Примечание: От Микроскоп различных .lif файлы получаются с несколькими видео для каждого лечения состояние (т.е. FN, FN + SDF). «video.lif» соответствует input.lif видео файл со всеми TIRF фильмы поглощения (серия) в Микроскоп. «videoSeq» папка будет содержать 500 кадров фильма, который мы анализируем. «Результаты» папка будет содержать все файлы, в результате проведенного анализа. Точная номенклатуры и локализация различных папок необходимы для правильного функционирования алгоритмы. Имена полужирным шрифтом в списке выше являются фиксированными (то есть, они должны называться таким образом, потому что эти имена, разыскивается скрипты). Имена не жирным можно изменить для отражения эксперимент выполняется.
  2. Откройте TIRFM видео (файл .lif) с Фиджи или ImageJ, перетаскивая файл на Фиджи меню и нажмите на кнопку ОК для импорта файл lif с помощью BioFormats (дополнительный рис. 1).
  3. Выберите серию для обработки и нажмите кнопку OK (дополнительный рисунок 2A). Чтобы создать маску для анализа видео, импорт также многоканальное изображение с различных хромофоры (в примере, серии 1-многоканальное изображение и серии 2 соответствующего видео). Видео (и многоканальное изображение) следует открыть как ImageJ стека. В этом примере (дополнительный рисунок 2B) изображение находится на левой стороне и видео находится на правой.
    Примечание: Если не требуется создание маски для видео, перейдите к шагу 2.5.
  4. Создание маски. Создайте единый образ с каналами, полезных для разработки маски. В этом случае интересные каналы являются те, красный, зеленый и серый.
    1. Разделение каналов многоканального изображения (дополнительный рисунок 3а): выберите изображение в панели меню и нажмите Цвет | Разделение каналов. Различные каналы будут отображаться как отдельные изображения (дополнительный рисунок 3B).
    2. Слияние снова трех каналов в один образ (дополнительный рисунок 4A): выберите изображение в строке меню и выберите Цвет | Объединение каналов. Выберите соответствующие каналы и нажмите кнопку OK (дополнительный рисунок 4B). Новый-штабелироваться образ будет создан (дополнительная цифра 4 c).
    3. Синхронизировать два окна, используя средство Синхронизации Windows (Дополнительные рисунок 5A): выберите анализировать в строке меню | Инструменты | Синхронизация Windows. Новое окно с возможности синхронизировать изображение будет показан (дополнительный рисунок 5B).
    4. С двумя окнами синхронизированы (только видео, если есть многоканальное изображение не связанных) могут быть подрезаны того же региона в обеих окнах. Нарисуйте региона интерес с инструментом прямоугольного выделения ImageJ плавающего меню. Выберите изображение в строке меню и выберите культур (дополнительный рисунок 6A). Два обрезанного изображения будут показаны индивидуально (дополнительный рисунок 6B).
    5. Unsynchronize оба окна (дополнительный рисунок 6B), нажав кнопку Unsynchronize все в диспетчере Синхронизации Windows .
  5. Если маска не был создан как шаг 2.4, нарисуйте региона интерес с инструментом прямоугольного выделения ImageJ плавающего меню.
  6. Сохранить видео как последовательность изображений в каталоге videoSeq в каталоге соответствующего видео (дополнительная цифра 7A): выберите файл в строке меню и нажмите Сохранить как | Изображения последовательности... переименовать этикетки для видео последовательности как video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (дополнительный рисунок 7B): в диалоговом окне имя переименовать как видео и нажмите кнопку ОК. Последовательность должна быть в одиночестве в своей директории успешно использоваться U-трек.
    Примечание: Если не проектирование маску для видео, перейдите к шагу 2.8.
  7. Дизайн маски. Выберите многоканальное изображение и откройте редактор сегментации плагин (дополнительная цифра 8A): выберите плагины в строке меню и выберите сегментации | Сегментация редактор. Добавление и переименовать ярлыки сегментации при необходимости щелкнув правой кнопкой мыши на этикетках сегментации редактора (дополнительный рисунок 8B, C).
    1. Выберите инструмент выбор в ImageJ плавающего меню (здесь, использовать руки), выберите метку (зеленый) и сначала дизайн внешней маске (дополнительная цифра 9A). После того, как дизайн, нажмите + в параметр выбора составного окна и выбранный маска будет отображаться в средстве просмотра (дополнительная цифра 9A). Повторите этот шаг с следующей метки (интерьер, в красном) (дополнительный рисунок 9B).
      Примечание: После разработки маска для меток зеленый и интерьер, экстерьер маска будет занимать остальную часть изображения.
    2. Маски закодированы в изображении как регионы 0, 1, 2... Согласно приказу метки в окне метки RGB. Когда все маски для различных меток предназначены, сохранить маску с тем же именем файла как видео, с именем mask.tif (дополнительная цифра 9C): выберите файл в строке меню и выберите Сохранить как | TIFF....
      Примечание: Выбранной маски будут использоваться в расчет коэффициентов диффузии и классификации траекторий (см. шаг 4.2).
  8. Проверьте, что структуру файлов на данный момент заключается в следующем:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Ряд1/mask.tif
    VideoName/Ряд1/ videoSeq / video0000.tif
    VideoName/Ряд1/ videoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Ряд1/ videoSeq / video0499.tif
    VideoName/Ряд1/результаты
    Примечание: Mask.tif — это изображение с маской в шаги 2.4 и 2.7. Video*.tiff это видео как сохраненные в 2.6 шаг. Как указано выше, имена в жирным шрифтом в списке выше являются фиксированными, т.е., они должны называться таким образом, потому что эти имена, разыскивается скрипты. Имена не жирным можно изменить для отражения эксперимент выполняется.

3. Отслеживание частицы

  1. Отслеживайте все частицы, видели в выбранного видео с помощью U-трек.
  2. Откройте Matlab и добавить U-трек каталог в путь с помощью задать путь | Добавить с опцией подпапки в меню. Сохраните путь, так что в будущем казней, Matlab U-трек в пути. Этот параметр путь необходимо сделать только один раз.
  3. Измените рабочую папку на каталог, содержащий серии для анализа. Вызова U-трек, набрав в консоли (дополнительный рисунок 10) movieSelectorGUI и нажмите клавишу ВВОД. Окно выбора фильма будет открыт (дополнительная цифра 11А).
  4. Нажмите на кнопку Новый фильм и фильм издание окно (Дополнительные рис. 11B).
  5. Нажмите на Добавить канал , чтобы выбрать каталог с видео (VideoName/Ряд1/видео) и заполнить параметры информации фильма. Задайте выходной каталог для результаты U-трек результаты (videoName/Ряд1/результаты).
    Примечание: Фильм информации параметров можно получить от условий приобретения и Микроскоп.
  6. Нажмите на настройки дополнительных каналов и заполните параметры, связанные с приобретением. Посмотрите значения параметров в этом примере (дополнительный рисунок 11C).
  7. Нажмите кнопку сохранить в окне настройки дополнительных каналов и сэкономить на окне фильма издание . Программа запросит подтверждение записи в файл под названием movieData.mat на каталог результатов . Подтверждения.
  8. После создания фильма, нажмите на продолжить в окне выбора фильма. U-трек будет просить о типе объекта для анализа. Выберите Single частиц (дополнительный рисунок 12). (Дополнительные рис. 13A) появится окно панели управления.
    1. Выберите первый шаг Шаг 1: определение и нажмите на параметр. (Дополнительные рис. 13B) появится окно Установки параметр Гаусса смесь-модель . В этом примере «альфа для сравнения с местными фон» значение 0,001 и «Rolling-окно времени усреднения» 3 (дополнительный рис. 13B).
    2. Нажмите на Применить в окне Параметры Гаусса смесь-модель установки и запуска на панели управления. С конфигурацией в дополнительном рисунок 13только шаг обнаружения запускается. Этот шаг занимает несколько минут (2-5). Проверьте результаты, нажав на кнопку результат шага 1 (обнаружение, Дополнительные рис. 14).
      Примечание: Как показано выше, фильм показывает красные круги на обнаруженных частиц. Если не красный круг, то этот шаг не работал правильно.
  9. Выполняйте определение треков, то есть, слияния частиц, обнаруженные на предыдущем шаге на треки, которые охватывают несколько кадров. Это Шаг 2: отслеживание U-трек, параметры которого должны быть определены, как показано на Рис. Дополнительные 15A-C. Параметры функции стоимости шаг 2 для увязки кадра к кадру и разрыв закрытия, слияния и разделения в примере показаны Дополнительные деятель 15B и C, соответственно.
  10. После установки параметров для шага 2, нажмите кнопку Запуск на панели управления и только шаг 2 работает (дополнительный рисунок 16).
  11. Выполните анализ трек, шаг 3. Задайте параметры, как показано в дополнительном рисунок 17 (правая панель). Нажмите кнопку Применить на панели настройки-движение анализа, и запустить в элемент управления панели-U-Track. Этот шаг занимает несколько секунд.
  12. С кнопкой результат шага 3 Убедитесь, что процесс правильно определил все треки. Для этого, нажмите на Показать трек номер окна Параметры фильма и проверьте, кадр за кадром, что каждый трек был правильно определил (дополнительный рисунок 18). Вручную добавлять аннотации те частицы, которые не являются действительно частиц.
    Примечание: Если этот ручной выбор не делается, слабее автоматический выбор может выполняться позднее при расчете коэффициента диффузии (см. шаг 4).

4. Расчет коэффициентов диффузии и классификации траекторий

  1. Будьте уверены, что все сценарии вызываются из каталога видео, анализируются (в примере, VideoName/Serie1).
  2. Читать все траектории для вычисления коэффициентов диффузии путем выпуска в Matlab консоли команду: trajectories=readTrajectories(0.1), где 0,1 представляет время в секундах между двумя последовательными кадрами (интервал времени, отображаемые в панели кино Информация, Дополнительные рис. 11B).
  3. Исключить траекторий, соответствующий неправильно определили пятна/траекторий. Дать список мест для исключения. Например, чтобы исключить пятна, 4, 5 и 28, введите: траекторий = readTrajectories (0,1 [4, 5, 28]).
  4. Вычислите мгновенного распространения Коэффициенты для каждого из треков этой ячейки. В этом случае, рассчитать коэффициент диффузии для временной лаг = 4, называется D1-4. Для этого выполните в консоли Matlab команду: D = calculateDiffusion (траектории, 113.88e-3, 0.0015, 'Альфа') где траекториях являются траекторий, полученные на шаге 3, 113.88e-3 является размер пикселя изображения полученные со сканера в мкм, 0.0015 Верхняя граница для коэффициентов диффузии неподвижной частиц, измеряется в мкм2/s и «альфа» является встроенная модель, как объяснено ниже.
    Примечание: При использовании быстрее камеры и необходимости больше кадров для вычисления параметра диффузии увеличить его, например до 20, по D = calculateDiffusion (траектории, 113.88e-3, 0.0015, 'Альфа', '', 20). Параметр string до 20, в примере выше, '', это суффикс добавляется выходных файлов. Этот суффикс может использоваться для различения различных анализов.
  5. Соответствовать MSD с другой функцией путем вызова функции calculateDiffusion снова с другой установки режим («лишь», «свободный» или «режиссер»). В этом примере, «лишь»: D = calculateDiffusion (траектории, 113.88e-3, 0.0015, 'лишь').
  6. Получите результаты установки для направленного модели, как показано на рисунке 20 дополнительных.
  7. Разложить траекторий на краткосрочной и долгосрочной траектории. Используйте команду: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) где 50-минимальная длина в кадрах траектории может считаться долго (в примере).
  8. Изучение короткие траектории, используя ту же процедуру установки, описанной в шаге 4.3: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'режиссер', 'Короткий'). Анализ коротких и аномальных траектории с помощью команды: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'Альфа', «Короткая»).
  9. Анализ долгосрочной траектории классифицировать тип движения через их момент расширения спектра (MSS)7. Команда: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'длинный') показывает анализ в экране и генерирует файл с названием trajectoryClassification < суффикс > .txt каталог results\TrackingPackage\tracks.

5. Расчет Ssize кластера через плотность частиц

Примечание: Будьте уверены, что все сценарии вызываются из каталога видео, анализируются (в примере, VideoName/Serie1).

  1. Анализ интенсивности каждой частицы вдоль их траектории. Для этого, вызовите сценарий, набрав в консоли Matlab: analyzeSpotIntensities, который принимает в качестве входных траекторий, вычисляемая U-трек в первом разделе. В своей самой основной форме, просто вызовите сценарий без каких-либо аргументов из каталога видео, анализируются (в примере, VideoName/Ряд1) analyzeSpotIntensities(). Настроить это базовое поведение различными способами, предоставляя аргументы в сценарий как: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, Значение1, ' Arg2´, значение2,...). Допустимые аргументы с соответствующими значениями переменной ('ArgN´, ValueN) перечислены.
    1. ('spotRadius´, 1)
      Анализ интенсивности флуоресценции, используя spotRadius 1 пиксель (по умолчанию), что соответствует участок размером 3 x 3 центрируется в точке ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Примечание: Для патч 5 x 5, сосредоточены на месте, выберите spotRadius 2, и т.д.
    2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      Если этот аргумент (true, значение 1), анализировать только траектории, которые начинаются в первый кадр видео. Это полезно для анализа изображений управления (по умолчанию 0, false).
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      Если этот аргумент имеет значение 0 (false), а затем сохраните координаты места в его первый кадр для всех фреймов (это полезно для неподвижных точек). Если аргумент имеет значение 1 (по умолчанию 1, значение true), то пятно вдоль видео следующие координаты рассчитаны отслеживается U-трек.
    4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Включать траектории количество этих траекторий, исключены в шаге 4.3 (в примере 4, 5, 28).
    5. ('extendTrajectory ´, 1)
      Если этот аргумент имеет значение 1 (true), затем проанализируйте интенсивность в патч до конца видео (даже если траектория останавливается ранее). Координата точки является Последнее координат в траектории (если trackTrajectory имеет значение true) или первая координата в траектории (если trackTrajectory имеет значение false). Этот аргумент имеет значение false (0) по умолчанию.
    6. ('subtractBackground´, 1)
      Если этот параметр установлен, затем правильным сырье флуоресценции измеряется в каждом месте оценку флуоресценции фон для этого месте (см. ниже). Этот аргумент имеет значение true (1), по умолчанию.
    7. ('meanLength´, номер кадра)
      Если этот параметр установлен, средней интенсивности месте измеряется в длину указали. Набор «meanLength», 20 измерить интенсивность средняя спот на первых 20 кадров. Если аргумент не задан, то пятно света рассчитывается на всей траектории (по умолчанию, полная длина).
    8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      Установите этот параметр как 1 (по умолчанию 0, false), для построения профиля интенсивности вдоль различных кадров, а также их происхождения.
      Примечание: Эти участки являются очень полезными для выявления Фотообесцвечивание, как показано в дополнительном рисунок 21. Для каждого пути процедура автоматически анализирует, если это возможно, что был Фотообесцвечивание. Это делается путем сравнения значений интенсивности с t студента в первый и последний кадры N вдоль пути. По умолчанию, N 10, но это значение может быть изменено через аргумент ' Nbleach´.
    9. ('backgroundMethod´, значение)
      Установите этот параметр для определения фона в каждом месте. Это можно сделать несколькими способами, и какой из них использовать может быть выбранные изменения «значение»:
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        Это значение используется, чтобы вручную определить фон для всего видео. Позволяют выбрать 8 очков в первый кадр видео. Патч вокруг этих точек анализируется вдоль всего видео, и 95% квантиль всех этих интенсивностей выбирается в качестве фона интенсивности для всех мест.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
        Это значение используется, чтобы вручную определить фон для каждого кадра. Выберите 8 очков за каждое пятно и каждый кадр. Эта задача требует много времени, но он дает много управления для пользователя. 95% квантиль интенсивностей в эти патчи выбирается в качестве интенсивности фон для этого месте в данном фрейме.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
        Используйте это значение для вычисления на фоне каждое пятно оценкам из 8 пунктов, расположенных в круг вокруг месте с радиусом контролируемых аргумент ' backgroundRadius´ (по умолчанию 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
        Используйте это значение для вычисления фона для каждого кадра, сначала найдите ячейку в видео и затем анализа интенсивности ячейки в каждом кадре (дополнительный рисунок 22).
        Примечание: Фон выбирается в качестве значение серого в данной квантиль распределения (по умолчанию 0.5 (= 50%), хотя этот параметр может управляться через аргумент ' backgroundPercentile´, это значение может быть задано выше, например, 0,9 (= 90%) Если желающих большую часть клетки следует рассматривать как фон. Чтобы помочь в идентификации ячейки, указывают значение Максимальная фон ожидается вдоль рамы, используя аргумент ' maxBackground´ (например, во всех проанализированных видео, значение background обычно никогда не выходит за рамки 6000)13. По умолчанию этот параметр имеет значение 0, что означает, что эта помощь не используется по умолчанию. Увидеть, что обнаружение клеток и района, выбранного для оценки фон, задав аргумент ' showImages´ 1 (остановка выполнения в любое время, нажав CTRL-C).
  2. Соберите информацию распространения и интенсивности для всех траекторий, рассчитывается в шагах 4 и 5.1, соответственно, (gatherDiffusion.AndIntensity). Соберите только распространения и интенсивности информацию для короткой траектории. Для этого, использовать суффиксов в шаге 4.7 и введите: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) где ' Short´ является суффикс, используемый в шаге 4.7.
  3. Собрать момент расширения спектра и интенсивности ввода informationby: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') , где «Долго» суффикс используется в шаге 4.7. Резюме всех файлов, созданных с использованием этого протокола, показано на рисунке 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование этого протокола позволяет автоматизированного отслеживания частиц, обнаруженной в микроскопии флуоресцирования фильмы и анализ их динамических характеристик. Первоначально клетки являются transfected с белком дневно в сочетании отслеживаться. Соответствующий уровень рецепторов представляет на поверхности клетки, что позволяет SPT получается путем ячейку Сортировка (рис. 1). Выбранные ячейки анализируются TIRF микроскопии, который генерирует виде...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описан метод легко выполнять даже без каких-либо предыдущий опыт работы с Matlab. Однако Matlab процедуры требуют чрезвычайно точность с номенклатуры различных команд и локализация различных папок, используемых программой. В деле отслеживания процедура анализа (шаг 3), несколько параметров могут быть изменены. Окно «Настройка Гаусса-смесь модель арматура» (шаг 3,8) контролирует, как U-трек будет обнаруживать одной частицы на видео. Это делается путем установки Гаусса смесь модель, как описано в разделе3...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарны Карло Manzo и Мария Гарсия Parajo за их помощь и исходный код анализа коэффициент диффузии. Эта работа частично поддержали грантов от испанского министерства науки, инноваций и университетов (SAF 2017-82940-R) и программа RETICS Instituto de salud Карлоса III (RD12/0009/009 и RD16/0012/0006; МОЛО). COMFUTURO программы Фонд Генеральной CSIC поддерживаются LMM и СП.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клетки Jurkat человекаATCCCRL-10915Т-клеточная линия человека. Любой другой тип клеток может быть проанализирован с помощью этого программного обеспечения
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFPClontech632469Различные флуоресцентные белки могут быть прослежены и проанализированы с помощью этого рутинного
электропоратора Gene Pulse X Cell BioRad Мы используем 280 В, 975 мФ, для ячеек Jurkat. Используйте метод трансфекции, который лучше всего работает в ваших руках.
Проточный цитометр Cytomics FC 500 Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman CoulterВ зависимости от уровня трансфекции, сортировка клеток может не потребоваться. Вы также можете использовать клетки со стабильной экспрессией адекватных уровней интересующего рецептора.
Dako QifikitDakoCytomationK0078Используется для количественного определения количества рецепторов на поверхности клетки.
Стеклянное дно микролуночных тарелоккорпорацииMatTek P35G-1.5-10-C
Фибронектин человека из плазмыSigma-AldrichF0895
Рекомбинантный человек CXCL12PeproTech300928A
Перевернутый Leica AM TIRFLeica
EM-CCD камераAndor DU 885-CSO-#10-VP
MATLABMathWorks, Natick, MA
Программное обеспечение U-Track2Danuser Laboratory
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
u-Track2 программное обеспечениеИнструмент Matlab.  Для установки скачайте .zip файл с веб-страницы (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) и распакуйте файл в каталоге выбранного вами
программного обеспеченияGraphPad Prism
GraphPad

Ссылки

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  4. Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
  5. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  6. Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
  8. Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601(2015).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
  11. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
  14. Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Трекинг одиночных молекултрекинг частицанализ диффузиианализ размера кластеровобласть интересаразработка маскиFiji ImageJподпрограммы MATLAB
Изображений, обработки протокол для анализа распространения и размер кластера мембранных рецепторов по микроскопии флуоресцирования
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.