Методическая статья

Очистка и трансплантация миогенных прогениторных клеток производные Exosomes для улучшения сердечной функции мышечной дистрофические мышей Дюшенна

5.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59320

⸱

10 апреля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia, Augusta University, 2Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол временно улучшить функции сердца в мышах мышечная дистрофия Дюшенна, трансплантация exosomes, производные от нормальных миогенных прародитель клеток.

Аннотация

Мышечная дистрофия Дюшена (МДД) является Х-сцепленный рецессивный генетическое заболевание вызвано отсутствием функциональной делеций белка. Болезнь нельзя вылечить, а как болезнь прогрессирует, пациент развивает симптомы Дилатационная кардиомиопатия, аритмии и застойной сердечной недостаточности. ДМДMDX мутантных мышей не выражают делеций и широко используются как мыши модель DMD. В нашем недавнем исследовании, мы наблюдали что intramyocardial инъекции широкий типа (WT)-миогенных прогениторных клеток, полученных exosomes (MPC-Exo) временно восстановлен выражение делеций в миокарде DMDMDX мутантных мышей, который был связан с временным улучшением функции сердца, предполагая, что WT-MPC-Exo может предоставить возможность для облегчения сердечных симптомов DMD. Эта статья описывает технику MPC-Exo очищения и трансплантации в сердцах DMDMDX мутантных мышей.

Введение

Мышечной дистрофии Дюшенна (ДМД) является Х-хромосомой рецессивных, прогрессивный нервно-мышечные заболевания вызванные мутация в гене DMD и потере функциональных делеций1. Делеций выражается главным образом в скелетных мышцах и миокарда и менее выражена в гладкие мышцы, железы внутренней секреции и нейроны2,3. DMD-это наиболее распространенный тип мышечной дистрофии с заболеваемостью одному 3500 до 5000 новорожденных мальчиков во всем мире4,5. Люди обычно развиваются прогрессивная мышечная некроза, потеря независимых мимо раннего подросткового возраста и смерть в второй-третьей декадах их жизни из-за сердечной и дыхательной недостаточности6.

Расширенная кардиомиопатия, аритмии и застойной сердечной недостаточности являются проявлением DMD7,8общих сердечно-сосудистой системы. Болезнь нельзя вылечить, поддерживающее лечение может улучшить симптомы или задержать прогрессирование сердечной недостаточности, но это очень трудно улучшить сердце функции9,10.

Похож на ДМД пациентов, Х-хромосомой мышечная дистрофия (MDX) мышах дефицит белка делеций и настоящем симптомы кардиомиопатия11и поэтому широко используются в ДМД связанные кардиомиопатия исследований. Чтобы восстановить делеций в пораженных мышц, аллогенных стволовых клеток оказалось эффективным средством лечения для ДМД12,,1314. Exosomes, 30-150 Нм мембрана везикулы выделяемый различных типов клеток, играют ключевую роль в области коммуникации к ячейке посредством генетического материала транспорта, таких как матричная РНК (мРНК) и некодирующих RNAs15,16,17 ,18,19,,2021.

Наши предыдущие исследования показали, что exosomes, производные от миогенных прогениторных клеток (ПДК), например C2C12 клеточной линии, могут передавать делеций мРНК в принимающей кардиомиоцитов после прямого впрыска сердца22, указывающее что аллогенной доставки MPC-производные exosomes (MPC-Exo) может временно восстановить DMD экспрессии генов мышей многомерных выражений. Эта статья посвящена методам очистки и трансплантации MPC-Экзо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животные были обработаны согласно утвержденных протоколов и правил животных институциональный уход животных и использование Комитета медицинский колледж Грузии в университете Augusta.

1. изоляция и очищение MPC-производные Exosomes

  1. Семена 5 x 106 C2C12 клеток в клетки культуры блюдо 15 см с полным Дульбекко 20 мл изменение орла носитель (DMEM) содержит 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 100 ед/мл пенициллин G и 100 мкг/мл стрептомицина. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2.
  2. Подготовки обедненного exosome среднего ultracentrifugation FBS в 100,000 x g для 18 ч при 4 ° C, с помощью поворотной ведро ротора. Выбросите гранулы.
  3. Замените полный DMEM обедненного exosome среднего когда монослоя клеток достигают 80% слияния в культуре блюдо.
  4. Используйте передачу пипетки для сбора супернатант от клеток культуры блюдо каждые 48 ч, в общей сложности три раза. Соберите супернатант в 50 мл пробирок и центрифуги на 150 x g за 10 минут, чтобы удалить оставшиеся ячейки.
  5. Фильтр супернатант через фильтр 0,22 мкм для ликвидации ячейки мусор. Ультрацентрифуги отфильтрованных среднего в ультрачистый труб с использованием размахивая ротор ведро на 100,000 x g для 120 мин при температуре 4 ° C для exosomes.
  6. Ресуспензируйте Пелле exosome содержащих в-фосфатный буфер (PBS) и заполнить весь ультрачистый трубки с PBS. Выполните ultracentrifugation Эта подвеска в 100,000 x g для 120 мин на 4 ° C для ликвидации загрязняясь протеины.
  7. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы exosome в 100 мкл PBS. Хранить при температуре-80 ° C для использования в будущем.
  8. Для анализа электронной микроскопии место 3 мкл суспензии exosomal на 200 formvar покрытием меди микроскопа сетки для 5 мин при комнатной температуре. Продолжите с стандартным уранила ацетат пятнать23. Изучите сетке полусухое, просвечивающей электронной микроскопии.

2. Intramyocardial Exosome доставки

Примечание: Мы использовали шесть мышей в каждой группе.

  1. Анестезировать DBA/2J-DMDMDX мышей (самец; возраст > 10 месяцев вес тела (BW) > 18 g) с впрыском внутрибрюшинного (и.п.) 100 мг/кг жм кетамина в сочетании с 10 мг/кг жм Ксилазина и подтвердите глубины анестезии, мыс пинча.
  2. Исправьте каждую мышь в лежачем положении на хирургические платформе с помощью ленты для обеспечения каждой конечности и место шва 3-0 горизонтально ниже верхних зубов для хранения верхней челюсти на месте.
  3. Применить депиляционный крем к левой стороне мыши груди, чтобы удалить мех из кожи.
  4. Выполнять эндотрахеальной интубации через полости с помощью катетера 24 G и проветрить мыши с комнатным воздухом в размере 195 вдохов/мин с помощью грызунов Вентилятор (см. Таблицу материалов).
  5. Дезинфекция кожи с 75% алкоголя и 10% повидон йод.
  6. Сделать 10\u201215 мм наклонный разрез от левого края грудины к левой подмышечной впадине, сократить большую грудную крупных и мелких большую грудную ножниц, а затем сделать левая торакотомия через четвертое межреберное пространство. Аккуратно вставьте втягивающего полос распространить грудной полости шириной 10 мм. Позаботьтесь, чтобы избежать повреждения левого легкого.
  7. Используйте две прямые пинцетом удалить перикарда, вытащить их друг от друга, и место их за советы втягивающего подвергать сердце. Придать MPC-Exo (50 мкг в 30 мкл PBS) или 30 мкл PBS (как элемент управления) intramyocardially в передней стенки левого желудочка с помощью 31 G инсулин иглы на одном сайте.
  8. Используйте швы нейлона 6-0, чтобы закрыть грудной полости, большую грудную мышц и кожи в последовательности.
  9. Восстановите мышей. Когда присутствует художественной, спонтанное дыхание, удалите мышей от вентилятора и экстубаций. Наблюдать и записывать состояние мышей после операции.

3. эхокардиография

Примечание: Один наблюдатель, ослепил в экспериментальной группы выполняет эхокардиографии и анализ данных.

  1. Через два дня после пересадки PBS/exosome, анестезировать мышей с 1\u20122% изофлюрановая.
  2. Исправить мышь в лежачем положении, с помощью липкой ленты и применять разогретой акустическая гель на левой груди.
  3. Оценить функции левого желудочка методом эхокардиографии, как описано в16,24.
    1. Получить мнение парастернальной длинной оси левого желудочка (LV) в двух измерениях (режим B) и затем поверните ультразвуковой зонд 90° для получения представления LV короткой оси на уровне папиллярных мышц.
    2. Запись M-режим Эхокардиографические изображений и мера левого желудочка конечного диастолического диаметр (LVEDD), левого желудочка конец систолический объем (LVESD), левого желудочка конечного диастолического объема (LVEDV) и левого желудочка конец систолический объем (LVESV).
      Примечание: Дробные укорочение (FS %) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 и фракция выброса левого желудочка (зна %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.

4. иммуногистохимии

  1. Через два дня после пересадки PBS/exosome, анестезировать мышей (см. шаг 2.1) и разрезали грудины подвергать грудной полости. Вскрыть нижней полой вены и perfuse сердце через верхушки левого желудочка с 3 мл PBS, следуют 3 мл параформальдегида 4% при комнатной температуре, с помощью катетер бабочка с 25 G иглой, придает шприц 5 мл.
  2. Встраивать фиксированной сердца в парафин и разрезать на 5 мкм толщиной секций.
  3. Deparaffinize слайды в ксилоле и увлажняет в растворы этанола в следующем порядке: 100% ксилола (3 мин), 100% ксилола (3 мин), 100% этанола (1 мин), 100% этанола (1 мин), 95% этиловом спирте (1 мин), 80% этанола (1 мин), H2O (1 мин).
  4. Исправьте разделов ткани с параформальдегида 4% за 8 минут при комнатной температуре.
  5. Погружать слайды в цитрат натрия (0.01 М, pH 6.0) и выполнять антигена извлечения с помощью ретривер антигена.
  6. Разрушения разделы за 1 ч при комнатной температуре с 1% полиэтиленгликоль трет octylphenyl эфира в PBS.
  7. Заблокировать разделы с 5% козьего сыворотки в PBS на 1 ч при комнатной температуре.
  8. Инкубировать секции с разбавленным основного антитела (антитела анти делеций) в PBS (1: 100) на ночь при 4 ° C, а затем промойте PBS три раза за 5 мин.
  9. Инкубируйте секции с разбавленным вторичное антитело (Alexa Fluor 488 конъюгированных коза анти кролик IgG) в PBS (1: 400) 45 мин при комнатной температуре.
  10. Управления аутофлюоресценция с помощью закалки аутофлюоресценция комплекта (см. Таблицу материалов).
  11. Использование установки носитель, содержащий DAPI (см. Таблицу материалы), для монтирования слайды.
  12. Наблюдать за слайды под конфокального микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схема для изоляции и очистки exosomes из C2C12 клеток показан на рис. 1A. Чтобы подтвердить присутствие exosomes, мы провели анализ передачи электронной микроскопии. Передача электронной микроскопии изображения (рис. 1Б) показывает морфология яркие и круглой формы везикулы exosomes C2C12 производные. Западный анализ помаркой подтвердили наличие маркеров exosome, в том числе CD63 и TSG101 (рис. 1

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод изоляции чисто exosomes имеет важное значение для изучения функции exosomes. Один из распространенных методов для exosome изоляции является полиэтиленгликолей (шпеньки) при посредничестве осадков17,18,25. Exosomes может быть химически осажденный в колышки и гранулированных центрифугированием низкой скорости. ПЭГ опосредованной очистки очень удобным, недорогостоящих, она не нуждается в каких-либо современное оборудование, н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляет, что они имеют без конфликта интересов.

Благодарности

Тан были частично поддержаны американской ассоциации сердца: GRNT31430008, низ-AR070029, низ-HL086555, низ-HL134354.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 μ m ФильтрFisherbrand09-720-004
15 см Чашка для клеточных культурThermo Fisher Scientific157150
24 г катетерTERUMOSR-OX2419CA
31 г инсулинигла BD328291
4% параформальдегида AffymetrixAAJ19943K2
50 мл центрифужные пробиркиThermo Fisher Scientific339652
6-0 шовный материалPro Advantage от NDCP420697
Alexa Fluor 488 козий антикролик IgGThermo Fisher ScientificA-11008
антибиотик антимикотический растворCorning 30-004-CI
Антитела к дистрофинуAbcamab15277
Antigen retriever Aptum BiologicsR2100-USНабор для восстановления
аутофлуоресцентного антигена Vector LaboratoriesSP-8400
C2C12 клеточная линияATCCCRL-1772
ЦентрифугаUnicoC8606
Change-A-Tip Высокотемпературные прижиганияBovie Medical CorporationHIT
Конфокальная микроскопияZeissZeiss 780 Вертикальная конфокальная
мышь DBA/2J-mdxЛаборатория Джексона013141
DMEMCorning 10-013-CM
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Corning 35-011-CV
Сыворотка от козы MP Biomedicals, LLC191356
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
КетаминHenry Schein056344
монтажной средой с DAPI Vector LaboratoriesH-1500
Набор ретракторов для мышей KentScientificSURGI-5001
Полиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфирFisher ScientificBP151-100
Аппарат искусственной вентиляции легких для грызуновHarvard Аппарат55-7066
SW-28 Ti роторBeckman342207
Платформа визуализации Vevo 2100Ультразвуковая система FUJIFILM VisualSonicsVevo 2100 
УльтрацентрифугаBeckman365672
ультрапрозрачные пробиркиBeckman344058
ксилазина (XylaMed)Bimeda-MTC Animal Health Inc.1КСИЛ003 8КСИЛ006

Ссылки

  1. Yiu, E. M., Kornberg, A. J. Duchenne muscular dystrophy. Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).
  2. Nudel, U., et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).
  3. Rae, M. G., O'Malley, D. Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).
  4. Mah, J. K., et al. A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).
  5. D'Amario, D., et al. A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy. Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).
  6. Koeks, Z., et al. Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).
  7. Kamdar, F., Garry, D. J. Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).
  8. Wang, Z., et al. Regenerative Therapy for Cardiomyopathies. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
  9. Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).
  10. Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction. Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).
  11. Quinlan, J. G., et al. Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).
  12. Siemionow, M., et al. Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).
  13. Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice. Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).
  15. Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).
  16. Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).
  17. Ruan, X. F., et al. Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).
  18. Ruan, X. F., et al. Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).
  19. Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).
  20. Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases. Stem Cells International. 2016, 2417268(2016).
  21. Murphy, C., et al. Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases. Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).
  22. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
  23. Hu, G., et al. Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction. Cell Death & Disease. 3, 381(2012).
  24. Bayoumi, A. S., et al. A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).
  25. Wang, Y., et al. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).
  26. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
  27. Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. Magnetic bead-based isolation of exosomes. Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).
  28. Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads. Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).
  29. Teng, X., et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).
  30. Aminzadeh, M. A., et al. Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи