Автоматизированный метод для выполнения в пробирке Micronucleus Анализ с помощью многоспектральных изображений потока цитометрии

Анализ микроядерного ядра in vitro (MN) является широко используемым тестом для оценки цитотоксичности и генотоксичности в качестве инструмента скрининга в нескольких областях исследования, таких как химическое и фармацевтическое развитие, а также биомониторинг человека среди людей, подвергающихся различным экологические, профессиональные или факторы образа жизни^1,2,³. MN состоят из фрагментов хромосом или целых хромосом, генерируемых при делении клеток, которые не включены в одно из двух основных ядер дочери. После телофазы, этот хромосомный материал образуется в индивидуальном, округлые тела внутри цитоплазмы, которая отделена от любого из основных ядер². Таким образом, MN являются репрезентативными повреждения ДНК и были использованы в течение многих лет в качестве конечной точки в генотоксичности тестирования⁴. Наиболее подходящим методом измерения MN является цитокинез-блок микронуклеуса (CBMN) анализ. Используя анализ CBMN, частота MN в binucleated клетках (BNCs) может быть забита путем включения циточалазин B (Cyt-B) в образец. Cyt-B позволяет ядерное деление, но предотвращает клеточное деление и, таким образом, ограничивает скоринг MN для BNCs, которые разделились только один раз⁵.

Протоколы с использованием микроскопии и цитометрии потока были разработаны и проверены и обычно используются для выполнения in vitro MN анализ^{6,7,8,9,10, 11,12,13,14}. Микроскопия выгоды от возможности визуально подтвердить, что MN являются законными, но отнимает много времени и склонны к изменчивости между бомбардирами¹⁵. Для решения этой проблемы были разработаны автоматизированные методы микроскопии для сканирования слайдов и захвата изображений ядер и MN^16,17,18,19, но цитоплазма не может быть визуализирована, что делает ее трудно определить, если MN на самом деле связано с конкретной ячейкой. Кроме того, эти методы имеют трудности с определением полинуклидированных (POLY) клеток (в том числе трех- ичетырехъядерных клеток), которые необходимы для расчета цитотоксичности при использовании Cyt-B 9. Методы цитометрии потока, разработанные для выполнения MN-оценки, используют флуоресценцию, а также интенсивность рассеяния вперед и боковой стороны для определения популяций как ядер, так и MN, которые были освобождены от клетки после лизиса^{20,21 ,22}. Это позволяет получить данные из нескольких тысяч ячеек за несколько минут и позволяет автоматизированный анализ^23; однако, неспособность визуализировать ячейки делает невозможным подтверждение того, что забитые события являются подлинными. Кроме того, лизинирование клеточной мембраны ингибирует использование Cyt-B, а также создает подвеску, которая содержит другие обломки, такие как хромосомные агрегаты или апоптотические тела, и нет никакого способа, чтобы отличить их от MN²⁴.

В свете этих ограничений, Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) является идеальной системой для выполнения анализа MN, поскольку она сочетает в себе высокое разрешение флуоресцентных изображений микроскопии со статистической надежностью и скоростью обычной цитометрии потока. В MIFC все клетки вводятся в систему жидкости и затем гидродинамически сфокусированы в центре кветки из струек. Ортогональная подсветка всех клеток достигается с помощью светоизлучающего диода (LED) яркого поля (BF), лазера бокового рассеяния и (по крайней мере) одного флуоресцентного лазера. Флуоресцентные фотоны запечатлены одним из трех (20x, 40x или 60x) высокочисленных линз цели диафрагмы, а затем проходят через элемент спектрального разложения. Фотоны затем сосредоточены на заряд-связанных устройств (CCD) камеры для получения высокого разрешения изображения всех клеток, которые проходят через ячейку потока. Чтобы избежать размытия или полос, CCD работает в режиме интеграции задержки времени (TDI), который отслеживает объекты путем передачи содержимого пикселей из строки в строку вниз CCD в синхронизации со скоростью ячейки в потоке. Информация о пикселе собирается из последнего ряда пикселей. TDI изображений в сочетании со спектральным разложением позволяет до 12 изображений (2 BF, 10 флуоресцентных), которые будут захвачены одновременно из всех клеток, проходящих через клетку потока. Все захваченные изображения хранятся в файлах данных, специфичных для примеров, что позволяет проводить анализ в любое время с использованием программного обеспечения для анализа данных MIFC. Наконец, файлы данных сохраняют связь между сотовыми изображениями и точками на всех бивариатовых участках. Это означает, что любая точка на традиционном бивариатном участке может быть выделена, а ее соответствующие BF и флуоресцентные изображения будут отображаться²⁵.

Недавно, MIFC основе методы были разработаны для выполнения MN-осечку для обоих сортировки излучения биодозиметрии^{26,27,28,29,30,31} и генетические токсикология^32,33 тестирования. Эта работа показала, что клеточные изображения основных ядер, MN и цитоплазмы могут быть изображены с более высокой пропускной всей, чем другие методы²⁶. Все типы клеток, необходимые для анализа, включая клетки MONO, BNCs (с и без MN) и POLY-клетки, могут быть автоматически идентифицированы в программном обеспечении для анализа данных MIFC, а реализация критериев оценки, разработанных Fenech et al. использование различных математических алгоритмов^6,34. Результаты биодозиметрии показали, что кривые калибровки реакции дозы были аналогичны по величине тем, которые были получены из других автоматизированных методов в литературе при количественной оценке скорости MN на BNC²⁹. Кроме того, недавняя работа в области токсикологии показала, что изображения клеток MONO, BNCs (с и без MN) и POLY клетки могут быть автоматически захвачены, определены, классифицированы и перечислены с помощью MIFC. Протокол и анализ данных позволили просчитать цитотоксичность и генотоксичность после разоблачения клеток ТК6 нескольким кластогенам и анегенгенам^32.

Протокол, представленный в настоящем документе, описывает метод выполнения анализа in vitro MN с использованием MIFC. Метод обработки образцов, используемый в этой работе, требует менее 2 ч для обработки одного образца и относительно прост в выполнении по сравнению с другими методами. Анализ данных в программном обеспечении для анализа MIFC является сложным, но создание шаблона анализа может быть осуществлено в течение нескольких часов после шагов, изложенных в настоящем документе. Кроме того, после создания шаблона он может автоматически применяться ко всем собранным данным без дальнейшей работы. Протокол описывает все шаги, необходимые для разоблачения клеток TK6 для кластогенов и анефинов, описывает, как культура, процесс и пятно клеток, и демонстрирует, как приобрести изображения высокого разрешения с помощью MIFC. Кроме того, в настоящем документе иллюстрируются современные передовые методы анализа данных в программном обеспечении MIFC для автоматической идентификации и оценки клеток MONO, BNCs и POLY для расчета как цитотоксичности, так и генотоксичности.

1. Подготовка культуры среды и культивирование клеток ТК6

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые химические вещества, используемые в этом протоколе, являются токсичными. Вдыхание, глотание или контакт кожи с циточалазин B может быть фатальным. Носите соответствующее оборудование для индивидуальной защиты, включая лабораторное пальто и две пары нитрильных перчаток. Тщательно вымойте руки после обработки. Формалин/формальдегид является токсичным при вдыхании или проглатывании; раздражает глаза, дыхательную систему и кожу; и может вызвать сенсибилизацию при вдыхании или контакте с кожей. Существует риск серьезного повреждения глаз. Это потенциальный канцероген.

1. Подготовьте 565 мл культуры 1x RPMI среды. Добавьте 5 мл несущественных аминокислот MEM (100x), 5 мл пирувата натрия (100 мМ), 5 мл пенициллина-стрептомицина-глютамина (100x) и 50 мл сыворотки плода (FBS) до бутылки 500 мл 1xMI RP 1644. Подготовка среды в кабинете биобезопасности и хранить на 2-8 градусов по Цельсию. Нагрейте среду до 37 градусов по Цельсию, прежде чем добавить его в клетки TK6 (см. Таблицаматериалов).
2. Оттепель 1 мл клеток ТК6 (хранится при -80 градусов по Цельсию в DMSO) в 10 мл среднего. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 8 мин и аспирации супернатанта. Перенесите клетки на 50 мл носителей и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂. Время удвоения клеток TK6 варьируется от 12-18 ч, и для того, чтобы клетки достигли максимальной скорости пролиферации,12-18 ч.
3. Культура 100 мл клеток до концентрации 7-8 х 10⁵ клеток/мл.

2. Подготовка кластогенов и/или анагенов и циточалазин B

1. Подготовьте соответствующие концентрации запасов желаемых кластогенов и анагенов. Например, для митомицина С растворите бутылку объемом 2 мг в 10 мл стерильной воды, чтобы достичь конечной концентрации запасов в 200 мкг/мл. Митомицин С может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение трех месяцев (см. Таблицаматериалов).
2. В день эксперимента подготовьте разбавления желаемых химических веществ, которые либо в 10, либо в 100 раз превышают желаемые концентрации воздействия при разбавлении стерильной воды или ДМСО, соответственно.
3. Для митомицина С приготовьте 3 мл разбавления в стерильной воде 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 и 5,0 мкг/мл. Для колхицина приготовьте 3 мл разбавления в стерильной воде 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 мкг/мл. Наконец, для Маннитол, подготовить 3 мл разбавления в стерильной воде 5, 10, 20, 30, 40 и 50 мг /мл.
4. Подготовьте 200 мкг/мл концентрации запасов циточалазин B путем растворения 5 мг бутылки в 25 мл DMSO. Циточалазин B может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.

3. Воздействие клеток на кластогены и/или анегены

1. Добавьте 1 мл желаемого химического вещества (например, митомицин С) к 9 мл клеток при 7-8x10 5-клеток/мл в колбе T25. Для контрольных проб добавьте 1 мл стерильной воды. Поместите колбы в 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂ инкубатор на 3 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если химические вещества разбавлены в DMSO, добавить только 100 л химического вещества к каждой колбе и добавить 100 л DMSO для контроля. Каждая колба должна содержать 9,900 мл клеток.
2. После 3 ч удалите колбы из инкубатора и перенесите клетки в полипропиленовые трубки мощностью 15 мл. Центрифуга на 200 х г в течение 8 минут, аспирировать супернатант и передачи клеток на новые t25 колбы, содержащие в общей сложности 10 мл свежей среды культуры. Добавьте 150 кл/л концентрации запасов (200 мкг/мл) циточалазин В к каждой колбе для достижения конечной концентрации 3 мкг/мл.
3. Вернуть колбы в 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂ инкубатор для времени восстановления, равного 1,5-2,0 удвоения раз, как это рекомендовано руководящими принципами ОЭСР⁹. Для клеток ТК6, используемых в этой работе, время восстановления составило 24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удвоение времени TK6 клеток, используемых здесь было 15 ч и время восстановления 24 ч (1,6 раза в два раза) был использован. Восстановление раз менее чем в 1,5 раза меньше, чем в 1,5 раза сократит распространение в пробах, подверженных более высоким дозам, влияющих на количество БНК. И наоборот, время восстановления более 2,0 приведет к непропорциональному числу полинуклиированных клеток в контрольных образцах, перекос цитотоксичности расчетов.

4. Подготовка буферов для фиксации и маркировки содержания ДНК (см. Таблицу материалов)

1. Приготовьте 75 мМ хлорида калия (KCl), добавив 2,79 г до 500 мл ультрачистой воды. Перемешать раствор в течение 5 минут с помощью магнитного мешалки и стерильного фильтра через фильтр 200 мкм. Раствор KCl 75 мм может храниться при 4 градусах Цельсия в течение нескольких месяцев.
2. Подготовьте достаточное количество 4% формалина для эксперимента, предвидя, что в общей сложности 2,1 мл должны быть добавлены к каждому образцу. Например, чтобы подготовить 10 мл 4% формалина, добавьте 4 мл 10% акций формалина к 6 мл 1x Dulbecco в фосфатно-буферированный соленрешение без Ca^{2 "} или Mg^2" (PBS). Этот 4% формалин может храниться при комнатной температуре в течение нескольких недель.
3. Приготовьте 510 мл буфера для мытья (2% FBS в 1X PBS), добавив 10 мл FBS к бутылке 500 мл 1x PBS.
4. Приготовьте 10 мл концентрации Hoechst 33342, добавляя 100 мл концентрации запасов (1 мг/мл) до 9900 л 1X PBS. Раствор Hoechst 33342 может храниться при 4 градусах по Цельсию в течение нескольких месяцев.

5. Обработка образцов: гипотонический отек, фиксация, подсчет клеток и маркировка содержания ДНК

1. В конце восстановительного периода удалите все колбы из инкубатора и перенесите все образцы на полипропиленовые трубки мощностью 15 мл. Центрифуга все образцы на 200 х г в течение 8 мин.
2. Прибавьте супернатант, отдохните клетки и добавьте 5 мл 75 мМ KCl. Смешайте аккуратно инверсией три раза и инкубировать при 4 градусах По Цельсию в течение 7 мин.
3. Добавьте 2 мл 4% формалина к каждому образцу, аккуратно перемешайте инверсией три раза и инкубинуприт при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин. Этот шаг действует как "мягкая фиксация".
4. Centrifuge все образцы на 200 х г в течение 8 мин. Аспирируй супернатант и resuspend в 100 зл и 4% формалин в течение 20 мин. Этот шаг действует как "жесткая фиксация".
5. Добавьте 5 мл буфера для мытья и центрифуги при 200 х г в течение 8 мин. Аспирировать супернатант и повторно в 100 л буфера стирки.
6. Перенесите все образцы в микроцентрифугные трубки мощностью 1,5 мл.
7. Выполните ячейку рассчитывать на каждый образец, чтобы определить количество клеток на образец. Образцы будут высококонцентрированными, поэтому для получения точного подсчета, скорее всего, потребуется разбавление 1:100 в 1x PBS (10 л выборки в 990 Л Л ПБС).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент лучше всего выполнять подсчеты клеток с помощью гемоситометра. Добавление KCl придает цитоплазме полупрозрачный вид, что затрудняет их распознавание автоматических счетчиков клеток. Кроме того, автоматизированные счетчики испытывают трудности с оценкой полинуклиированных клеток из-за их размера.
8. Если не запустить образцы на MIFC немедленно, они могут храниться при 4 градусах По Цельсию в течение нескольких дней. Когда готовы к запуску образцов, добавьте 5 кЛ 100 мкг/мл на 1x10⁶ ячеек/мл к каждому образцу. Также добавьте 10 мкг/мл RNase на 100 л образца для конечной концентрации 50 мкг/мл. Инкубировать образцы при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂ в течение 30 мин.
9. Микро-центрифуга все образцы на 200 х г в течение 8 мин и использовать пипетку, чтобы удалить супернатант оставляя 30 qL. Используйте пипетку, чтобы повторно приостановить все образцы перед запуском на MIFC обеспечения Есть нет пузырьков в трубке. Не вихрь.

6. Запуск и калибровка ММФК

1. Убедитесь, что оболочка, система калибровочным реагентом, депублером, моющим средством и контейнерами для стерилизатора заполнены, а резервуар для отходов пуст. Включите систему и дважды нажмите на значок программного обеспечения MIFC. Нажмите кнопку "Пуск" и убедитесь, что "Пуск" проверяет все калибровки и тесты флажка. Это позволит промыть систему, загрузить оболочку и калибровочные реагенты системы, а также откалибровать систему (см. ТаблицуМатериалов).

7. Запуск проб на ММКК

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел предполагает использование 2 камеры MIFC. При использовании 1 камеры MIFC, пожалуйста, см. Дополнение 1 - Полный протокол, раздел 7 для создания участков во время приобретения

1. Запуск программного обеспечения для сбора данных MIFC (см. Таблицу материалов). На рисунке 1 показаны настройки инструмента. Включите лазер 405 нм и установите мощностьлазера до 10 мВт (A). Отключите все другие лазеры (включая SSC) иустановите BF на каналы 1 и 9 (B). Подтвердите, что ползунок увеличения установлен на 60x (C), режим высокой чувствительности выбран (D), и что только каналы 1, 7 и 9 отображаются в картинной галерее.
2. Нажмите на значок Scatterplot. Выберите всю популяцию и выберите область M01 на X-оси и аспектном соотношении M01 на оси Y. Нажмите на значок Квадратного региона и нарисуйте область вокруг одиночных ячеек. Назовите этот регион одноклеточными ячейками. Нажмите правой кнопкой мыши на участок и выберите Регионы. Выделите область одиночных ячеек и измените X-координаты до 100 и 900 и измените y-координаты до 0.75 и 1 (Рисунок1I).
3. Нажмите на значок Scatterplot. Выберите одиночные ячейки в качестве родительской популяции, выберите Gradient RMS M01 на X-оси и Gradient RMS M07 на оси Y. Нажмите на значок Квадратного региона и нарисуйте область вокруг большинства ячеек. Назовите эту область Фокусированные ячейки. Нажмите правой кнопкой мыши на участок и выберите Регионы. Выделите область фокусированных ячеек и измените x-координаты на 55 и 75 и измените y-координаты до 9,5 и 20(рисунок 1J).
4. Нажмите на значок гистограммы. Выберите популяцию фокусированных ячеек и выберите в качестве функции Intensity M07. Нажмите на значок Линейного региона и нарисуйте область через главную вершину гистограммы. Назовите этот регион ДНК-положительным. Нажмите правой кнопкой мыши на участок и выберите Регионы. Выделите ДНК-положительную область и измените координаты до 2 x 10⁵ и 2 x 10^6. Диапазон, возможно, придется корректировать в зависимости от пика интенсивности на гистограмме(рисунок 1K).
5. Установите параметры приобретения(рисунок 1E). Укажите имя файла и папку назначения, измените количество событий до 20 000 и выберите днк-положительную популяцию.
6. Нажмите Нагрузка (рисунок 1F)и поместите контрольный образец в MIFC. Нажмите кнопку «Приобретение», чтобы собрать данные(рисунок 1G). После завершения приобретения нажмите кнопку Return, чтобы вернуть образец (рисунок1H). Снимите образец трубки с инструмента. Повторите этот процесс для всех оставшихся образцов в эксперименте.

8. Открытие файла данных в IDEAS

1. Запуск пакета программного обеспечения анализа MIFC (см. Таблицу материалов). Нажмите на стартовый анализ, чтобы начать Открытый файл мастера. Выберите файл данных, просматривая нужный необработанный файл изображения (.rif). Нажмите кнопку "Открытая" и нажмите далее.
2. Так как это единый анализ цвета, компенсация не является необходимым, поэтому нажмите Далее, чтобы обойти шаг компенсации. На этом этапе нет шаблона анализа для применения, так что нажмите Далее еще раз. Если шаблон анализа был загружен из дополнительного материала, выберите его прямо сейчас. Эти шаблоны работают только с 2 камерой MIFC с BF набор каналов 1 и 9 и ядерных изображений в канале 7 во время приобретения.
3. По умолчанию имена файлов .cif и .daf автоматически генерируются в соответствии с .rif. Не рекомендуется менять названия .cif и .daf. Нажмите далее. Установите свойства отображения изображения, выбрав 01 и 07. Нажмите далее. Существует не мастер для этого приложения, так что нажмите Закончить. Очень важно сохранять файл анализа данных (.daf) и шаблон анализа (.ast) часто во время разделов 9-14, чтобы избежать потери прогресса.

9. Создание масок и функций для идентификации БНК

1. Нажмите на значок Image Gallery Properties (синий/белый значок). В вкладке Display Properties нажмите Set Range to Pixel Data, а затем измените цвет на желтый. Нажмите OK. Изображения Hoechst теперь легче просматривать на черном фоне.
2. Создайте участок неапоптотические клетки.
   1. Нажмите на вкладку Анализ, а затем нажмите Маски. Нажмите Новый, то нажмите функция. Под функцией выберите Порог,под маской выберите M07 и установите Процент интенсивности до 50. Нажмите OK, то OK снова. Нажмите Закрыть.
   2. Нажмите на вкладку Анализ, нажмите Кнопка Особенности, а затем нажмите Новый. Для типа функций выберите область. Для маски выберите Порог (M07,Ch07,50). Нажмите Установить имя по умолчанию и нажмите OK. Нажмите Близко, чтобы начать расчет значений функций.
   3. Нажмите на значок Dot Plot. Выберите все население. Для функции X-оси выберите функцию Контрастность-M01'Ch01, а для функции Y-оси выберите Area-Threshold (M07,Ch07,50). Нажмите OK.
   4. Нажмите кнопку Square Region и нарисуйте область вокруг большинства ячеек. Называйте этот регион неапоптотической. Нажмите право на участок и нажмите Регионы. Выделите неапоптотическую область. Установите x-координаты до 0 и 15 и установите y-координаты до 50 и 300. Нажмите Закрыть.
3. Создайте маску BNC (шаги 9.3.1-9.3.5) для идентификации ячеек, содержащих только два ядра.
   1. Просмотрите бНК в фотогалерее и нажмите на нее. Это для визуализации создания маски в канале Hoechst.
   2. Нажмите на вкладку Анализ, а затем нажмите Маски. Нажмите Новый, то нажмите функция. Под функцией выберите LevelSet, под маска выберите M07, выберите кнопку радио "Маска среднего уровня" и установите шкалу детали контура до 3.00. Нажмите OK, то OK снова.
   3. Нажмите Новый, то нажмите функция. Под функцией,выберите Dilate,и под маской выберите LevelSet (M07,Ch07,Middle,3). Установите изображение для отображения на Ch07и установите количество пикселей до 2. Нажмите OK, то OK снова.
   4. Нажмите Новый, то нажмите функция. Под функцией выбирайте водораздел,а под маской выбирайте Dilate (LevelSet(M07,Ch07,Middle,3)2). Установите изображение для отображения на Ch07и установите толщину линии до 1. Нажмите OK, то OK снова.
   5. Нажмите Новый, то нажмите функция. Под выбор функции Диапазон, под маска выбрать водораздел (Dilate(LevelSet (M07,Ch07,Middle,3)2)). Установите изображение для отображения на Ch07. Установите минимальные и максимальные значения площади до 115 и 5000 соответственно. Установите минимальные и максимальные значения соотношения сторон до 0,4 и 1 соответственно. Нажмите OK. В поле имени изменить текст для чтения BNC затем нажмите OK.
4. Создание функций и участков для получения окончательного населения БНК
   1. Функция Spot Count BNC: Нажмите на вкладку Анализ, затем функции,затем новые. Для типа функций выберите спотовый отсчет. Для Маскавыберите окончательную маску BNC, созданную в 9.3.5. Установите связь к четырем и измените название на Spot Count BNC. Нажмите OK, затем Близко, чтобы вычислить значения функции.
   2. Точечный граф гистограмма БНК. Нажмите на значок гистограммы. Выберите неапоптотик в качестве родительской популяции. Для функции X-оси выберите функцию Spot Count BNC. Нажмите OK. Нажмите на значок Линейного региона. Нарисуйте область через бен 2. Позвоните в этот регион 2N.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к разделу 9 в дополнении 1 - Полный протокол для создания оставшихся масок, функций и участков для определения окончательного населения БНК

10. Создание масок и функций для идентификации MN в популяции БНК

1. Создайте маску MN. Просмотрите бНк, содержащий MN в галерее изображений, и нажмите на него. Это для визуализации создания маски MN в канале Hoechst. Нажмите на вкладку Анализ, а затем нажмите Маски.
   1. Создайте маску идентификации точек 1:
      1. Нажмите Новый, то нажмите функция. Под функцией выберите Spot и убедитесь, что кнопка Яркое радио выбрана. Под маской выбрать M07, установить пятно на сотовый фон соотношение до 2,00. Установите минимальный радиус до 2 и максимальный радиус до 6. Нажмите OK, то OK снова.
      2. Нажмите Новый, то нажмите функция. Под функцией выбирайте диапазон,а под маской выбирайте LevelSet (M07,Ch07,Middle,3). Установите изображение для отображения на Ch07. Установите минимальную и максимальную площадь до 80 и 5000, соответственно. Установите минимальное и максимальное соотношение аспектов до 0 и 1, соответственно. Нажмите OK, то OK снова.
      3. Нажмите Новый, то нажмите функция. Под функцией выберите Dilate,под Маски выберите Диапазон (LevelSet(M07,Ch07,Middle,3),80-5000,0-1). Установите изображение для отображения на Ch07. Установить количество пикселей до 2. Нажмите OK, то OK снова.
      4. Нажмите новый. Дважды нажмите на пятно (M07, Ch07, Яркий, 2, 6, 2) маска, чтобы добавить его в определение маски. Нажмите на оператора, а затем оператора Not. Дважды щелкните маску Dilate (LevelSet(M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2), чтобы добавить ее в определение маски. Нажмите OK.
      5. Нажмите новый, затем функция. Под функцией выберите Диапазон и под маской выбрать маску, созданную в 10.1.1.4:
         1. Выберите пятно (M07, Ch07, Яркий, 2, 6, 2) и не сползайте (Диапазон (Levelset(M07, Ch07, Средний, 3), 80-5000, 0-1), 2).
         2. Установите изображение для отображения на Ch07. Установите минимальную и максимальную площадь до 10 и 80 соответственно. Установите коэффициент минимального и максимального аспекта до 0,4 и 1 соответственно. Нажмите OK, то OK снова. Маска идентификации точек 1 завершена.
            ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к разделу 10 в дополнение 1 - Полный протокол для создания масок, функций и участков для определения окончательного MN населения

11. Создание масок, особенностей и участков для идентификации мононуклиированных и полинуклиадных популяций

1. Создайте маску POLY. Нажмите Анализ, то маски, то новые, то функция. Под функцией выберите диапазон, под маской выбрать водораздел (Dilate(LevelSet (M07, Ch07, Средний, 3), 2)). Установите изображение для отображения на Ch07. Установите значения минимальной и максимальной площади до 135 и 5000 соответственно. Установите значения минимального и максимального коэффициента аспекта до 0,4 и 1 соответственно. Нажмите OK. В поле имени, изменить текст, чтобы прочитать POLY затем нажмите OK затем Закрыть. Маска из полинуклиатов полинуклеатов является полной.
2. Создайте маски компонентов POLY.
   1. POLY Компонентная маска 1: Нажмите на вкладку Анализ, затем маски, то новые, то функция. Под функцией выберите компонент,а под маской выберите маску POLY. Для ранжирования функция выберите область, и для сортировки Порядка нажмите кнопку Поуденство радио. Установить ранг до 1. Нажмите OK, то OK снова.
   2. Poly Компонентные маски 2, 3 и 4: Повторите все шаги в 11.2.1, за исключением набора Ранга до 2, 3 и 4 для создания индивидуальных компонентов маски.
3. Spot Count с помощью маски POLY.
   1. Нажмите на вкладку Анализ, а затем особенности, то новые. Для типа функцийвыберите SpotCount. Для маски выберите маску POLY и установите связь на 4. Нажмите Установить имя по умолчанию и нажмите OK затем Близко, чтобы вычислить значения функции.
   2. Нажмите на значок гистограммы. Выберите неапоптотические популяции. Для функции X-оси выберите функцию Spot Count-POLY-4.
   3. Mono области отсчета пятен. Нажмите на значок Линейного региона. Нарисуйте область через бен 1 на гистограмме, созданной в 11.3.2. Позвоните в этот регион 1N.
   4. Регион подсчета мест TRI. Нажмите на значок Линейного региона. Нарисуйте область через бен 3 на гистограмме, созданной в 11.3.2. Позвоните в этот регион 3N.
   5. Регион спотового счета ЗУАД МОНО. Нажмите на значок Линейного региона. Нарисуйте область через бен 4 на гистограмме, созданной в 11.3.2. Позвоните в этот регион 4N.
4. Определить популяцию MONO.
   1. Создайте функцию соотношения аспектов MONO. Нажмите на вкладку Анализ, а затем особенности, то новые. Под типом функции, выберите функцию соотношение аспектов и под маска выберите Компонент (1, Площадь, POLY, Поусходят). Нажмите Установить имя по умолчанию, а затем нажмите OK.
   2. Создайте функцию кругового круговорота MONO. С окном функции manager по-прежнему открыты, нажмите Новый. Под типом функции, выберите функцию Круговой и под маска выберите Компонент (1, Площадь, POLY, Поусшие). Нажмите Установить имя по умолчанию, а затем нажмите OK, а затем нажмите Близко, чтобы вычислить значения функции.
   3. Для кругового участка точек MONO щелкните значок Dot Plot. Выберите 1N в качестве родительской популяции. Для функции X Axis выберите Круговой компонент (1, Площадь, POLY, Поус) и для y Axis Feature выберите Аспект коэффициента (1, Площадь, POLY, Поусс). Нажмите OK. Нажмите кнопку Square Region и нарисуйте область вокруг популяции ячеек к правой верхней части участка. Назовите этот регион Циркуляром 1N. Нажмите право на участок и нажмите Регионы. Выделите область Циркулярno 1N. Измените X Координаты на 20 и 55 и измените Координаты Y на 0,85 и 1,0. Нажмите Закрыть.
   4. Создайте функцию Area POLY/Area-M07. Нажмите на вкладку Анализ, а затем особенности, то новые. Под типом функции, выберите функцию области и под маска выберите Компонент (1, Площадь, POLY, Поусшие). Нажмите Установить имя по умолчанию, а затем нажмите OK.
   5. С окном менеджер функции по-прежнему открыты, нажмите Новый затем под типом функции нажмите кнопку Комбинированные радио. Из списка функций выделите «Компонент наятов» (1, Area, POLY, Descending) и нажмите на стрелку вниз, чтобы добавить ее в определение функции. Нажмите символ разделения (/). Выберите функцию Area'M07 и нажмите вниз стрелка, чтобы добавить его в определение функции. Нажмите Установить имя по умолчанию и нажмите OK. Нажмите Близко, чтобы начать расчет значений функций.
   6. Для окончательного участка точки популяции MONO щелкните значок точечного сюжета. Выберите циркуляр No1N в качестве родительской популяции. Для функции X Axis выберите Аспект коэффициента No07, а для y Axis Feature выберите «Компонент»(1, Площадь, POLY, Поус) / Площадь»M07. Нажмите OK. Нажмите кнопку Square Region и нарисуйте область вокруг большинства ячеек. Назовите этот регион мононукливным. Нажмите право на участок и нажмите Регионы. Выделите мононукличенный регион. Измените X Координаты до 0,85 и 1,0 и измените координаты Y на 0,55 и 1,0. Нажмите Закрыть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к разделу 11 в дополнении 1 - Полный протокол для создания масок, функций и участков для определения окончательного тринуклиационизированных и полинюкеированных популяций.

12. Создание пользовательского представления для изучения бНК и маски MN

1. Нажмите на кнопку Image Gallery Свойства затем нажмите на вкладку Просмотр. Нажмите на вкладку Композиты затем нажмите Новый. Под типом имени Ch01/Ch07. Нажмите Добавить изображение. Под изображением выберите Ch01 и установите Процент до 100. Нажмите Добавить изображение снова, под изображением выбрать Ch07 и установить Процент до 100.
2. Нажмите Новые и под названием типа BNC и MN маски
3. Нажмите Добавить колонку. Под типизображения выбрать Ch01 и под маской выбрать Нет
4. Нажмите Добавить колонку. Под типизображения выбрать Ch07 и под маской выбрать Нет
5. Нажмите Добавить колонку. Под типизображения выбрать Ch07 и под маской выбрать BNC
6. Нажмите Добавить колонку. Под типом изображения выберите Ch07 и под маской выберите маску MN
7. Нажмите Добавить колонку. Под типом изображения нажмите кнопку композитного радио. Композитное изображение Ch01/Ch07 должно быть автоматически добавлено в представление. Нажмите OK, чтобы закрыть окно Image Gallery Properties.

13. Создайте пользовательский вид для изучения маски POLY

1. Обратитесь к разделу 13 в дополнении 1 - Полный протокол для создания пользовательского представления для изучения маски POLY

14. Создать таблицу статистики для перечисления ключевых событий

1. Нажмите на вкладку Отчеты, а затем нажмите Определите Статистический отчет. В новом окне нажмите «Добавить столбцы».
2. Добавьте статистику подсчета голосов BNC. Под статистикой выберите отсчет и под Выбранным Населенностью выберите населенность BNCs. Нажмите Добавить Статистика, чтобы добавить статистику в список.
3. Повторите шаг 14.2 для создания отдельных столбцов для популяций MN BNCs, MONO, TRI и POLY. Нажмите Закрыть, а затем нажмите OK.
4. Шаблон анализа данных завершен(рисунок 2). Сохранить шаблон (Файл, Сохранить как шаблон). Полный список масок можно найти в дополнение 2 - Маска Список.

15. Файлы экспериментов пакетного процесса с использованием шаблона анализа данных

1. Под меню Инструменты нажмите Пакет данных файлов, а затем нажмите Добавить пакет в новом окне.
2. В новом окне нажмите Добавить файлы, чтобы выбрать файлы эксперимента (.rif), чтобы добавить в пакет. В соответствии с опцией Select the template или data analysis (.ast, .daf) нажмите значок открытой папки, чтобы просмотреть и открыть шаблон анализа данных (.ast file), который был сохранен в шаге 14.4.
3. Нажмите кнопку «Отчет о статистике предварительного просмотра», чтобы просмотреть таблицу статистики. Значения здесь не отображаются, так как они еще не подсчитаны. Тем не менее, этот шаг служит проверкой, чтобы убедиться, что правильный шаблон анализа был выбран до запуска пакета.
4. Нажмите OK, чтобы закрыть текущее окно. Затем нажмите Отправить пакеты, чтобы начать пакетную обработку всех файлов.
5. После завершения пакетной обработки файл .txt будет доступен в папке, содержащей все файлы .rif. Используйте эти статистические данные для расчета генотоксичности и цитотоксичности.

16. Расчет параметров генотоксичности и цитотоксичности

1. Расчет генотоксичности: Для расчета генотоксичности используйте таблицу статистики, созданную в 15,5. Разделите число ячеек в популяции MN BNCs на количество ячеек в популяции БНК, а затем умножаем на 100:
   
2. Расчет цитотоксичности: Определите общее количество клеток POLY путем подведения итогов количества клеток ТРИ и КВАД.
   1. Рассчитайте индекс распространения цитокинеза блока (CBPI) с помощью количества ячеек в MONO, BNCs и POLY следующим образом:
      
   2. Наконец, вычислите цитотоксичность каждой культуры, используя значения CBPI из контрольных культур (C) и химически открытые культуры (T) следующим образом:
      

Метод анализа, изложенный в настоящем документе, позволяет автоматически идентифицировать и забивать БНК, с МН и без нее, для расчета генотоксичности. Кроме того, клетки MONO и POLY также автоматически идентифицируются и забиваются для расчета цитотоксичности. Опубликованныекритерии оценки 6,34, которые должны соблюдаться при подсчете этих событий реализованы в программном обеспечении анализа данных MIFC. Представленные здесь результаты свидетельствуют о том, что статистически значимое увеличение частоты МН с увеличением цитотоксичности может быть обнаружено после воздействия клеток лимфобластоида TK6 человека на известные химические вещества MN (митомицин С и колхицин). Аналогичные результаты по дополнительным химическим веществам были продемонстрированы в отдельной публикации32. Кроме того, результаты использования Маннитол показывают, что не-МН индуцирующих химических веществ также могут быть правильно определены с помощью метода MIFC, изложенные здесь. Параметры, описанные в протоколе для создания всех масок, особенностей и границ регионов, скорее всего, должны быть скорректированы, если для выполнения ассссы будут использоваться различные типы клеток (например, китайские клетки хомяка).

На рисунке 3 показаны четыре выбранные панели для определения БНК(рисунок 3A-3D). Здесь показана гистограмма, которая позволяет подбирать клетки с двумя ядрами(рисунок 3A)и бивариатными участками, которые позволяют подбирать БНК с аналогичной кругосвоестью (рисунок3B), аналогичные области и интенсивности (Рисунок 3C ) и BNCs, которые имеют хорошо разделенные, не перекрывающиеся ядра(рисунок 3D) в качестве скоринга critieria6,34. Рисунок 3 E показывает изображения BF и Hoechst, а также маски BNC и MN, указывающие на то, что БНК с одним или несколькими MN могут быть идентифицированы и перечислены. Это позволяет рассчитывать генотоксичность путем определения скорости микронуклеировой БНК в конечном популяции БНК. На рисунке 4 показано применение функции Spot Count с помощью маски POLY для идентификации клеток MONO, TRI и квАД. Затем можно суммировать количество клеток ТРИ и КВАД, чтобы получить окончательное число клеток POLY(таблица 1). Это позволяет вычислять цитотоксичность с помощью формулы, показанной в протоколе. Поэтому каждая доза в эксперименте может быть оценена как по параметрам генотоксичности, так и по цитотоксичности.

На рисунке 5 показаны значения генотоксичности и цитотоксичности для анегенского колхицина, кластогена митомицина С и отрицательного контроля, Маннитол. Для колхицина(рисунок 5A) 0,02 до 0,05 мкг/мл дозы производства статистически значимое увеличение частоты МН, в диапазоне от 1,28% до 2,44%, соответственно, над контролем растворителя (Таблица 1). В случае митомицина C(рисунок 5В) две верхние дозы 0,4 и 0,5 мкг/мл дали статистически значимые частоты MN по сравнению с растворителем контроля. Эти частоты MN были 0,93% на 0,4 мкг/мл и 1,02% на 0,5 мкг/мл (Таблица 2). Наконец, для Маннитол(Рисунок 5C), нет дозы испытания вызывают цитотоксичность более 30%, и они не производят значительное увеличение частоты МН по сравнению с растворителем контроля, как ожидалось (Таблица 3).

Рисунок 1 : Настройки приборов MIFC. Скриншот настроек MIFC, описанный в разделе шаг 7 протокола. (A) Установка 405 нм лазерной мощности до 10 мВт. (B) Установка каналов BF 1 и 9. (C) Выбор объектива 60x увеличения объективной. (D) Выбор самой медленной скорости потока, которая генерирует изображения с самым высоким разрешением. (E) Указание количество событий, которые будут собраны до 20000. (F) Нажав кнопку нагрузки, чтобы начать процесс загрузки образца. (G) Нажав кнопку Приобретение, чтобы начать приобретать изображения. (H) Нажав кнопку Return, чтобы вернуть любой неиспользованный образец. (Я) Scatterplot BF Аспект Коэффициент против BF области для выбора отдельных ячеек. (J) Scatterplot Из Hoechst Градиент RMS против BF Gradient RMS для выбора сфокусированных ячеек. (K) Гистограмма интенсивности Hoechst для выбора положительных клеток ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2 : Анализ программного обеспечения gating стратегии. Скриншот стратегии gating, описанный в разделе 9 протокола. Области отображаются в последовательном порядке для идентификации связных клеток (красная коробка), микронукли (желтая коробка) и моно- и полинуклидированных клеток (голубая коробка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3 : Идентификация и скоринг BNCs с и без MN. (A) Выбор клеток, которые имеют два различных ядер. (B) Идентификация связных ячеек (BNCs), которые имеют два высоко круглых ядра с помощью функции интенсивности коэффициента аспекта. (C) Выбор BNCs, которые имеют ядра с аналогичными областями и интенсивностью. Это достигается путем расчета соотношения области обоих ядер и соотношения соотношения сторон обоих ядер. (D) Использование функций соотношения формы и аспекта для определения БНК, которые имеют два хорошо разделенных ядрах. (E) Функция Spot Count с использованием маски микроядерного (MN), демонстрирующая, что БНК с одним или несколькими MN могут быть идентифицированы и перечислены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4 : Идентификация и оценка клеток MONO иPOLY. Использование функции спотового счета для выявления и перечисления моно-, трех- и четырехъядерных клеток. Компонентная маска 1 позволяет идентифицировать моноядерные клетки (верхнее изображение). Компонентные маски от 1 до 3 позволяют идентифицировать тринудальные клетки (среднее изображение). Компонентные маски от 1 до 4 позволяют идентифицировать квадродукливные клетки (нижнее изображение). Эта цифра была изменена с Родригес 201832. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5 : Количественная оценка цитотоксичности. Цитотоксичность количественно с использованием цитокинеза блок пролиферации индекса (черные круги) и генотоксичности количественно с использованием процента MN (ясные полосы) после 3 ч воздействия и 24 ч восстановления для (A) Колхицин, (B) Митомицин C и ( C) Маннитол. Статистически значимое увеличение частоты МН по сравнению с элементами управления указывается звездами (тест на чи-квадрат; йр/л; 0,05, р-л; 0,01,р-р . Все количества в среднем два репликации в каждой точке дозы. Эта цифра была изменена с Родригес 201832. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: Параметры, необходимые для расчета цитотоксичности (количество моно-, би-би- и полинуклеированных клеток) и генотоксичности (количество и процент микронуклеированных биуклеированных клеток) для колхицина. Все расчетные количества представляют собой среднее значение двух репликатов в каждой точке дозы.

Таблица 2: T он параметры,необходимые для расчета цитотоксичности (количество моно-, би-, би-и-полинуклидных клеток) и генотоксичности (количество и процент микронуклеированных клеток) для митомицина С. Все расчетные количества представляют собой среднее значение двух репликатов в каждой точке дозы.

Таблица 3: Параметры, необходимые для расчета цитотоксичности (количество моно-, би-би- и полинуклеированных клеток) и генотоксичности (количество и процент микронуклеированных биуклеированных клеток) для маннитола. Все расчетные количества представляют собой среднее значение двух репликатов в каждой точке дозы.

Дополнение 1: Полный протокол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнение 2: Список масок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Автор работает luminex Corporation, создатель ImageStream многоспектральный цитометр изображения, который был использован в этой работе.