Визуализация структуры лимфатических узлов и клеточной локализации с помощью ex-Vivo Confocal Микроскопии

Summary

Этот протокол описывает метод изображения различных популяций клеток в осушении лимфатических узлов без изменений в структуре органа.

Abstract

Лимфатические узлы (LNs) являются органами, распространяемыми внутри организма, где врожденные иммунные реакции могут соединиться с адаптивным иммунитетом. В самом деле, LNs стратегически вмешались в пути лимфатических сосудов, что позволяет интимный контакт тканевых антигенов со всеми резидентами иммунных клеток в LN. Таким образом, понимание клеточного состава, распределения, местоположения и взаимодействия с помощью ex vivo всего LN изображений будет добавить к знаниям о том, как тело координирует местные и системные иммунные реакции. Этот протокол показывает стратегию визуализации ex vivo после введения виво флуоресцентных антител с меткой, что позволяет очень воспроизводимую и простую в выполнении методологии с помощью обычных конфокальных микроскопов и фондовых реагентов. С помощью подкожной инъекции антител, можно маркировать различные популяции клеток в слива ЛН, не влияя на структуры тканей, которые могут быть потенциально повреждены с помощью обычной иммунофлуоресцентной микроскопии техники.

Introduction

Лимфатические узлы (LNs) являются яйцевидными органами, широко присутствующими по всему телу с важнейшей функцией преодоления врожденных и адаптивных иммунных реакций. LNs фильтруют лимфу для того, чтобы определить посторонние частицы и раковые клетки, чтобы смонтировать иммунный ответ против них¹. Антиген, представляющий клетки (APCs), Т-клетки и В-клетки работают вместе с генерацией антиген-специфических антител (гуморальный иммунитет) и цитотоксических лимфоцитов (клеточный иммунитет) для устранения посторонних частиц и раковых клеток². Таким образом, понимание динамики иммунных клеток, присутствующих в лимфатической ....

Protocol

Протокол был одобрен Постоянным комитетом по животным гарвардской медицинской школы и Бригамской женской больницы, протокол 2016N000230.

1. Мыши, используемые для эксперимента

1. Используйте 8-недельных мышей мужского и женского пола на фоне B6 для администрирования смеси антител.
2. Используйте CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT мышей, чтобы определить, может ли ex vivo всего LN изображения также могут быть применены к репортер умысла без введения антитела смесь, а также для расследования присутствия моноядерных клеток, в том числе антиген представления клеток и фагоцитов, и их распределение в LN.
   ПРИМЕЧАНИЕ: CX3....

Results

Данная рукопись показывает методы удаления паховых и поплитетовых лимфатических узлов, не повреждая их структуру после инъекции флуоресцентных антител для окрашивания конкретных клеточных популяций в этих органах (Рисунок 1 и Рисунок 2 ).

Мощное сочетание иммуномаркировки клеток LN с BV421 анти-CD4 и BB515 анти-CD19 и конфокальный анализ изображений определили локализацию Т-клеток (CD4) и В-клеток (CD19) в ингинале и поплите. В обоих .......

Discussion

Сочетание изображений с другими методами, включая молекулярную биологию и высокомерную иммунофенотипирование, повысило нашу способность исследовать иммунные клетки в их родном контексте. В самом деле, в то время как другие подходы могут потребовать переваривания тканей и изоляции клеток - что может привести к потере целостности тканей - использование in vivo или ex vivo изображений предоставляет большое преимущество в расследовании различных подтипов клеток в географической моды^{3 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 анти-CD4	BD Horizon	562891	GK1,5; 0,2 мг мл-1
BB515 анти-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0,2 мг мл-1
BB515 Rat IgG2a, κ Контроль изотипа	BD Horizon	564418	R35-95; 0,2 мг мл-1
BV421 мышь IgG2b, контроль изотипа K	BD Horizon	562603	R35-38 0,2 мг мл-1
Cellview чашка для культур	Greiner-Bio	627861	35x10 мм со стеклянным дном
Инсулиновые шприцы	BD Plastipak-Insulin		U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	размер 21 x 20 см / 100 листов в коробке
Микрохирургические изогнутые щипцы	WEP Хирургические инструменты	на заказ	12,5 см
Микрохирургические изогнутые	ножницы WEP на	заказ	11,5 см
Игла	BD PrecisionGlide-30		калибр × ½ дюйм
конфокальная головка Nikon Eclipse Te + A1R	Nikon	-	загружен основными 4 лазерными линиями (405, 488, 543 и 647 нм)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0,2 мг мл-1
PE Rat IgG2a, κ Контроль изотипа	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0,2 мг мл-1
Zeiss LSM 710 конфокальный микроскоп		Zeiss-loaded	с 4 основными лазерными линиями (405, 488, 543 и 647 нм)