Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ортотопические эндометрия рака модель с ретроперитонеальной лимфаденопатии Сделано из In Vivo распространяется и культивированных VX2 клеток

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59340

⸱

12 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой стандартизированный метод для выращивания клеток VX2 в культуре и создания ортотопической модели VX2 рака эндометрия с ретроперитонеальными лимфатическими метастазами у кроликов. Ортотопические модели рака эндометрия имеют важное значение для доклинического исследования новых методов визуализации для диагностики метастаз лимфатических узлов.

Аннотация

Рак эндометрия является наиболее распространенным гинекологических злокачественных новообразований в Северной Америке и заболеваемость растет во всем мире. Лечение состоит из хирургии с или без адъювантной терапии в зависимости от участия лимфатических узлов, как это определено лимфаденэктомии. Лимфаденэктомия является болезненной процедурой, которая не была показана, чтобы иметь терапевтическую пользу у многих пациентов, и, таким образом, новый метод диагностики метастазов лимфатических узлов не требуется. Для тестирования новых агентов визуализации необходима надежная модель рака эндометрия с ретроперитонеальными метастазами лимфатических узлов. Модель рака эндометрия VX2 часто описывается в литературе; однако существуют значительные различия в отношении метода создания моделей. Кроме того, никаких исследований не сообщалось об использовании культивированных клеток VX2 для создания этой модели, поскольку только клетки, распространяемые in vivo, ранее использовались. В этом виде мы представляем стандартизированный хирургический метод и метод послеоперационного мониторинга для создания модели рака эндометрия VX2 и сообщаем о первом использовании культивированных клеток VX2 для создания этой модели.

Введение

Рак эндометрия, или рак слизистой оболочки матки, является вторым наиболее распространенным гинекологических злокачественных новообразований во всем мире и наиболее распространенных злокачественных новообразований в развитых странах1. Заболеваемость раком эндометрия неуклонно растет, увеличившись на 2,3% в год в период 2005-2013 годов с соответствующим 2,2% увеличение смертности1,2,3. Диагноз метастазах лимфатических узлов имеет первостепенное значение, так как наличие положительных лимфатических узлов является сильным отрицательным предиктором выживания4,5,6,7 и может направлять администрирование адъювантная терапия8,9,10,11,12,13. Метастазовые лимфатические узлы в настоящее время диагностируются хирургическим путем удаления лимфатических тканей, лежащих в основных кровеносных сосудов в тазе и животе. Эта процедура, известная как лимфаденэктомия, является спорным из-за противоречивых данных выживания из двух больших испытаний14,15,16,17,18 и известных риск внутриоперационной15,19,20 и послеоперационной заболеваемости21,22,23. Поскольку современные неинвазивные методы визуализации не обладают необходимой чувствительностью и специфичностью для замены рассечения лимфатических узлов24,был предотврачив разработку новых методов диагностической визуализации. Для проверки этих новых методов в доклинических условиях требуется надежная модель рака эндометрия с ретроперитонеальными метастазами лимфатических узлов.

Модель опухоли кролика VX2 является устоявшейся моделью, которая широко используется для изучения нескольких опухолей твердых органов человека25, включая легкие26,голову и шею27,28, печень29, почки30, кости31,32, мозг33, поджелудочная железа34 и матка35,36,37. Модель VX2 была первоначально разработана в 1940 году Кидд и Рус38 путем успешной трансплантации хлопчатобумажный вирус папилломы кролика обнаружили Shope в 193339. С тех пор модель VX2 поддерживается in vivo, требуя серийного прохождения в четырехглавой мышце белых новозеландских кроликов40. Совсем недавно, однако, несколько групп успешно выросли VX2 клетки в пробирке40,41,42 и продемонстрировали сохраненные tumorigenecity культивированных клеточной линии31, 42,43. Опухоли VX2 гистологически определены как анапластические плоскоклеточные карциномы44 и содержат железистые особенности, которые напоминают аденокарциному26. Опухоли характеризуются простотой имплантации, быстрым ростом и гиперваскулярностью44,45 и надежно метастазируют, чаще всего в региональные и отдаленные лимфатические узлы45. Сходства в маточных сосудистой и лимфатической анатомии46, а также ортотопический рост сайта обеспечить, чтобы метастатическая картина рака кролика VX2 имитирует, что из рака эндометрия человека, что делает модель VX2 надежной моделью для изучения человека метастатического заболевания. Кроме того, гистологические особенности, такие как аномальная микрососудистая пролиферация47 , а также иммунологические48 и генетические сходства49,50 между людьми и кроликами предполагают, что опухоль микроокружение может отражать рак эндометрия человека.

Несколько групп сообщили об использовании VX2 для создания модели рака эндометрия с ретроперитонеальной метастазы с высоким уровнем сообщили успеха36,51,52; однако в нынешней литературе существуют значительные различия в отношении метода создания модели. Сотовые дозы подвески как низко как 4 х 105 клеток / матки рога51 и выше, чем 5 х 109 клеток / матки рога37,53 были зарегистрированы без стандартного консенсуса по требуемой дозы VX2 клеточной. Кроме того, различные методы прививки были зарегистрированы в том числе микро-хирургической имплантации опухоли в миометрию матки36, инъекция VX2 клеточной суспензии37,44,52 , 53 и в некоторых случаях, добавление зашвы роговой матки зашивания до инноциуляции52. Наконец, ни одна группа не сообщила об использовании культивированных ячеек VX2 для создания этой модели. Таким образом, цель этого исследования состоит в том, чтобы продемонстрировать успешный стандартизированный метод создания модели VX2 и сообщить о первом использовании культивированных клеток VX2 для создания модели рака эндометрия с ретроперитонеальными метастазами в кролике.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Глубокое закрытие брюшной стенки: Определите вершину брюшного разреза и похитить брюшную мышцу, ректусную мышцу и фасцию с помощью щипц. Все исследования на животных были проведены в Центре ресурсов животных (ARC), утвержденных объектов сети здравоохранения университета и в соответствии с утвержденными протоколами использования и ухода за животными (AUP #3994/#4299). Линия клеток VX2 была получена из лаборатории доктора Акена в университетской сети здравоохранения.

1. Создание линии клеток in vitro VX2

  1. Урожай опухоли VX2 из кролика четырехглавой мышцы и роста в мышином фланге.
    1. Оттепель замороженных блоков опухоли VX2 (1 см х 1 см), фарш на культурной пластине с помощью скальпеля лезвия и процедить через 70 мкм фильтр, добавив небольшое количество Хэнкс сбалансированное решение соли (HBSS) последовательно, чтобы обеспечить все клетки напряжены для окончательного объема 1 мл.
    2. Подсчитайте клетки и разбавьте 0,9% фосфатбуферизированного солейного раствора до концентрации 1 х 107/мли поместите на лед в стерильной трубке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опухолевые блоки были получены от сотрудника лаборатории от предыдущего распространения опухолей VX2 в мышцах кроличьего квадрицепса.
    3. Анестезить самку белого новозеландского кролика (вес 2,5-3,5 кг) с 2-5% ингаляционным изофрураном, удалить мех над местом инъекции и очистить место инъекции с помощью повидон-йодного раствора. Введите 500 л подготовленной подвески клеток VX2 (5 х 106 клеток/мл) в четырехглавую мышцу кролика. Мониторинг кролика клинически для роста опухоли, начиная с 10-го дня.
    4. Эвтаназия кроликов после опухоли достигает 1-1,5 см в диаметре (измеряется внешне с калиперами) с помощью ветеринарного утвержденного метода. Подтвердите эвтаназию, проверяя жизненно важные признаки, включая частоту сердечных приступов и частоту дыхания. Акциз опухоли с помощью стерильных инструментов после очистки области с бетадин раствором.
    5. В шкафу биологической безопасности с использованием стерильных инструментов, фарш опухоли на мелкие кусочки (0,2 см) на 10 см ткани культуры блюдо с помощью скальпеля лезвия. Передайте фрагменты опухоли через 70 мкм клеточный ситечко, используя 1 мл HBSS, как описано в шаге 1.1.1. Подсчитайте клетки и разбавьте с помощью 0,9% соленового раствора для получения 7,5 х 105 ячеек в 200 Л.
    6. Анестезия мужской NOD scid гамма мышей (вес 25 г) с использованием 4% изофлуран на 1 л / мин и поддерживать анестезию с помощью 2% изофлуран. После того, как мыши обезглавлены, введите 200 л раствора со ступени 1.1.5 в подкожную ткань мышкой фланга с помощью 27 калибровочных игл.
  2. Сбор и пропуск клеток VX2 в пробирке
    1. Монитор ксенотрансплантата роста клинически два раза в неделю, пока опухоли достигают 1 см в диаметре с помощью калиперов.
    2. Эвтаназия мышей путем размещения в камере CO2 или выполнения вывихшей шейки матки после анестезии с 4% изофлуран газа. Акцизные опухоли в стерильных условиях в шкафу биологической безопасности.
    3. Опухоли фарша с кальпелью на 1-2 мм в 6 см ткани культуры блюдо, содержащее 3 мл Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) / Хэм F12 "10% сыворотки для крупного рогатого скота (FBS) сми.
    4. Оставьте фрагменты опухоли нетронутыми в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 в течение двух дней, пока клетки не начнут расти из опухолевых кусочков. Впоследствии, проверить культивированные пластины ежедневно световой микроскопии для клеточной слоивости. По достижении 70% сплава, trypsinize клеток, добавив 1 мл 0,05% трипсина в колбу и размещение обратно в 37 КС инкубатор в течение 5 мин.
    5. Нейтрализовать трипсин с 6 мл DMEM / Ham's F12 и 10% FBS среды, собирать клетки и центрифуги при 4 КК в течение 5 мин при 300 х г. Удалите супернатант и повторно приостановить гранулы в 3,5 мл новых DMEM / Хэм F12 - 10% FBS средств массовой информации. Семена свежего 6 см коллагена я покрытием пластин ы 1,6 х 106 клеток на тарелку для достижения примерно 50% плотность посева клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 50% плотность клеток относится к клеткам, занимая 50% площади поверхности пластины при прикреплении.
    6. Раннее прохождение: Повторите выше процесс (трипсинизации, посева), пока клетки были проходят 5 раз, а затем оценить чистоту клеточной линии с ПЦР с помощью количественного ПЦР анализ различать кролика геномной ДНК от мыши геномной ДНК (см. шаг 1.3.1-1.3.4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После 8 проходов, клетки могут распространяться на неколлагена покрытием регулярных приверженцев ткани культуры пластин.
    7. Прохождение, trypsinize и заморозить aliquots клеток в DMEM / HAM F12'30% FBS'10%DMSO в концентрации 2 х 106 за флакон. Храните клетки в жидком азоте до тех пор, пока не потребуются для экспериментов.
  3. Подтверждение происхождения VX2 выживших клеток:
    1. Создайте стандартное лекарство от очищенной геномной мыши и ДНК кролика (Шаг 1.3.2 и Шаг 1.3.3). Используйте грунтовки, которые нацелены на конкретные по зыгню видов во время второго открытого чтения элемента ретротранспозон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Праймер последовательности для CRPV E6 являются: 5'- GATCCTGGCAACCAGTGand 5'-CCTGCCGGTTGATTAT. Использовались элементы ретротранспозонов LINE-1. Праймер последовательности для кролика LINE-1: 5'-TCAGGAACCCCAGAAGTATGC и 5'-TTGATTTCTTGAATGACCCAGTGTGTGTГ Егерь последовательности для мыши LINE-1 являются: 5'-AATGGAAGCCACATTCACGTGИи и 5'-CCTTCCTTT
    2. Чтобы создать стандартную кривую для CRPV E6, очистите lysate опухолевых клеток VX2 (Шаг 1.1.1) с помощью коммерческого комплекта, следуя протоколу производителя. Количественная эта ДНК с помощью коммерческого анализа. Выполните 6 серийных разбавлений от 225 пг/Зл до 0,925 пг/Л в низком буфере EDTA-TE. Чтобы создать стандартную кривую для геномной ДНК мыши, разбавьте 100 мкг коммерческой геномной ДНК мыши в низком буфере EDTA-TE в 5 разбавлениях от 125 пг/Л до 0,0125 пг/Л.
    3. Поместите 4 qL от каждого разбавленного раствора из образцов с ступени 1.3.2 в скважинах и запустите образцы в термоцикле ПЦР. Используйте значения Cq от каждого запуска вместе с суммами ДНК в скважине, чтобы вычислить стандартную кривую, используя настройки автоматического порога программного обеспечения thermocycler.
    4. Используйте стандартные процедуры qPCR для выполнения ПЦР с 40 циклами 2-ступенчатого цикла (98 градусов по Цельсию и 60 градусов по Цельсию) на термоциклере. Установите пороговые значения, и установить значения дельты Ct на йgt;35, чтобы обеспечить минимальное загрязнение мыши в линии клеток кролика VX2. Общий объем каждой реакции составил 10 л, состоящий из 5 зл 2x Mastermix, 1 зл и обратных грунтовок с конечной концентрацией грунтовки в реакции на уровне 250 нм, и 4 Зл образца ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите ссылки54,55 для получения подробной информации о выполнении ПЦР. Пороговые значения устанавливаются, и значения дельты Ct устанавливаются на уровне йgt;35, чтобы обеспечить минимальное загрязнение мыши в линии клеток кролика VX2. Рекомендуемый уровень ДНК VX2 для надежного обнаружения qPCR составляет 1-10 пг.

2. Культура клеток VX2 и создание клеточной подвески

  1. Оттепель флаконы, содержащие vX2 клетки (замороженные в шаге 1.2.7) в водяной бане при 37 градусах По Цельсию в течение 1 минуты и перенесите клетки в коническую центрифугу трубки с 10 мл культуры среды (1:1 DMEM/F-12 и 10% FBS и 1% пенициллилин-стрептомицин). Центрифуга в течение 8 мин при 107 х г,отбросить супернатант и повторно приостановить клеточной гранулы в 9 мл носителей.
  2. Передача повторно приостановленных ячеек в большую культурную колбу. Инкубировать клетки без тряски при 37 градусах Цельсия. Проверяйте клетки ежедневно на наличие световой микроскопии и меняйте культуры носителей каждые три дня.
  3. Создание культивированных VX2 клеточной подвески для инъекций
    1. Трипсинизуйте клетки, добавив 3 мл 0,25% трипсина в колбу, как только клетки достигли 80% слияния. Поместите колбу в инкубатор (37 градусов по Цельсию) в течение 5 мин. Передача раствора в коническую центрифугу трубки и центрифуги в течение 8 мин при 107 х г, а затем удалить супернатант.
    2. Вымойте клетки гранулы 3 раза с 9 мл фосфата буферного солине, центрифуга и удалить супернатант, как указано выше. Подсчитайте клетки и разбавьте 0,9% фосфатбуферизированного солейного раствора до концентрации 4 х 107 клеток/мл и поместите в стерильную конильную центрифугу трубки на льду.
  4. Создание in vivo распространяется VX2 клеточная подвеска для инъекций
    1. Оттепель замороженных блоков опухоли VX2 (1 см х 1 см), фарш на культурной пластине с помощью скальпеля лезвия и процедить через фильтр 70 мкм, как в шаге 1.1.1. Добавить небольшое количество HBSS последовательно, чтобы убедиться, что все клетки напряжены для окончательного объема 1 мл. Подсчитайте клетки и разбавьте 0,9% фосфатами буферногосолей до концентрации 1 x10 7/мл и поместите на лед в стерильной трубке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опухолевые блоки были получены от сотрудника лаборатории от предыдущего распространения опухолей VX2 в мышцах кроличьего квадрицепса.

3. Хирургическое создание модели

  1. Создание хирургической анестезии и предоперационной подготовки
    1. Предварительное медикаментозное самок белых новозеландских кроликов (2,5-3,5 кг) 1 ч до запланированной хирургической процедуры с использованием инъекций ацепромазина (1 мг/кг IM) и мелоксикама (0,2 мг/кг СЗ). Анестезить самку белого новозеландского кролика (вес 2,5-3,5 кг) с 2-5% ингаляционным изофрураном, удалить мех над местом инъекции и очистить место инъекции с помощью повидон-йодного раствора.
    2. Интубат обезболивайте кроликов с помощью ларинговой маски дыхательных путей (LMA) и безопасны на месте с лентой, поддерживая глубокую анестезию, одыщая ингаляционную дозу изофролана между 2-5%. Мониторинг хирургической анестезии регулярно на протяжении всей процедуры, проверяя жизненно важные признаки (скорость дыхания, капиллярная заправка, насыщение кислородом при наличии) и мониторинг признаков, указывающих на боль (движение, снятие стимулов, шумов) или света анестезия (движение, жевание на трубке LMA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть сделано кем-то с опытом мониторинга хирургической анестезии.
    3. Поместите 22-калиберный катетер из ушей в маргинальную вену. Администрирование цефазолина (20 мг/кг) внутривенно 10 мин до хирургического разреза кожи.
    4. Закрепите волосы над тазом и животом до размещения кролика на операционном столе, а затем поместите кроликов в подошву на операционном столе. Очистите хирургическое поле с помощью 3-ступенчатой хирургической подготовки кожи (бетадин мыло, хлоргексидин раствор, бетадин решение). Drape хирургическое поле с лапаротомии шторы после посадки маркировки верхней части лобковой кости, в результате чего 5 см х 5 см области нижней части живота подвергаются.
  2. Создание разреза лапаротомии и идентификация рогов матки
    1. Наденьте хирургическую кепку и маску для лица. Скраб руки с помощью хлоргексидина или бетадина хирургического раствора скраб. Используя стерильную технику, наденьте стерильное платье и стерильные хирургические перчатки.
    2. Используя скальпель длиной 11-лезвия, сделайте разрез длиной 2,5 см черепа на симфизию лобка через кожу и подкожную ткань живота кролика. Резцы прямой фасции и вскрыть мышцы прямой кишки боковой подвергать основной перитонеум. Введите брюшной полости резко после обеспечения подповерхности очищается от кишечника или других органов брюшной полости.
    3. Найдите рога матки, идентифицирующие мочевой пузырь и подметающие палец в перчатках превосходно, заднее и боковое над вершиной мочевого пузыря.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости, полный мочевой пузырь может быть опорожнен с помощью цифрового давления. После того, как расположен, принести рога матки через разрез брюшной полости, чтобы отдохнуть на брюшной стенке.
    4. Используя 3-0 плетеный абсорбируемый шов, выполните один шовную перевязку каждого рога матки примерно на 1,5-2,0 см дистального к шейке матки. Поместите шов просто медиаль носовой к артериям матки, которые проходят вдоль бокового аспекта каждого рога. Свяжите швы плотно, чтобы окклюзия дистальных рогов матки(рисунок 1).
  3. Прививка миомитрия VX2
    1. Используя 27-калиберную иглу, введите 0,5 мл ранее подготовленной подвески клеток VX2 с 2,3,2 (для культивированной модели VX2) или 2.4 (для in vivo, распространяемой модели VX2) в миометрию каждого рога матки, проксимального к месту шва (между местом шву (между местом шву (между местом шву (между местом шву (между местом шву (между местом швутки) и шейки матки). Вводят более 1 минуты и убедитесь, что клетки не вводятся в основной полости матки. Анестезия животных с использованием ингаляционных изофлюран (2-5%) и анестезиологическая машина с схемой Bain.
    2. Применить давление на место инъекции миометрия в течение 30 с после инъекции, чтобы свести к минимуму утечки клеток. Осмотрите места инъекций и швов на гемостаз и поместите рога матки обратно в брюшную полость.
  4. Закрытие хирургического разреза
    1. Глубокое закрытие брюшной стенки: Определите вершину брюшного разреза и похитить брюшную мышцу, ректусную мышцу и фасцию с помощью щипц.
      1. Для этого закрепите шов на одной вершине разреза, зашивая поверхностное до глубокого с одной стороны разреза и глубокое к поверхностному с другой. Завяжите узел. Используя прикрепленный шов, сделайте бегущими стежки перпендикулярно разрезу через слои брюшной стенки, работая шаг за шагом вдоль разреза из стороны в сторону. Свяжите шов и порез.
    2. Поверхностное закрытие брюшной стенки: Определите вершину разреза кожи и шов брюшной кожи с помощью похоронен работает подкатикулярный 3-0 поглощаемых поли-нитянити швут. Нанесите хирургический клей на закрытый разрез, чтобы противостоять краям кожи.
      1. Для этого закрепите шов на одной вершине разреза, зашивая глубоко поверхностно ею с одной стороны разреза и поверхностно до глубины с другой. Завяжите узел. Используя прикрепленные швы, сделайте бегущий стежк в дермальном слое параллельно разрезу, работая поэтапно вдоль разреза из стороны в сторону. Свяжите шов и порез.
  5. Послеоперационный уход
    1. Пробуждение от анестезии: Выключите изофлуран, как только разрез закрыт, и пусть кролик дыхание кислорода с помощью маски при мониторинге признаков пробуждения (например, спонтанные движения, открытие глаз и жевание движений на ларингальной маски дыхательных путей). Extubate кролика, как только эти признаки отмечены и обеспечить кислородом с помощью маски и теплое одеяло, пока кролики не начеку и в состоянии сидеть самостоятельно.
    2. Послеоперационный мониторинг: мониторинг кроликов два раза в день в течение 4 дней и ежедневно в течение дополнительных 10 дней после операции. Для мониторинга, оценить их общее состояние, их потребление пищи и воды, мочи и фекальных выход, оценка боли, вес, жизненно важные признаки (частота сердечных приступов, частота дыхания) и их хирургическое место ищет отек, эритема, разряда или дегистации.
    3. Послеоперационный контроль боли: Администрирование Meloxicam ежедневно (0,2 мг/кг СЗ) для 48 ч после операции, а затем по мере необходимости на основе оценки боли. Администрирование бупренорфин сразу после операции и каждые 12 ч (0,01-0,05 мг/кг СЗ) в течение 24 ч, а затем по мере необходимости на основе оценки боли
    4. Антибиотики (энрофлоксацин 5 мг/кг IM) могут вводиться ежедневно в течение семи дней после операции, чтобы предотвратить раневую инфекцию, как рекомендовано вашим ветеринаром. Администрирование подкожных жидкостей (15 мл СЗ) два раза в день, как это необходимо для обезвоживания и мягких продуктов питания или других пищевых добавок предоставляются ежедневно по мере необходимости для потери веса.

4. Мониторинг роста опухоли

  1. Клинический мониторинг: Мониторинг кроликов каждые 2 дня для клинических признаков роста опухоли, начиная с послеоперационного дня 14. Клинические признаки роста опухоли могут включать снижение перорального накопительного, вялость, брюшную нежность, ощутимую брюшную массу и потерю цекотрофии.
  2. Визуализация и инвазивный мониторинг
    1. КТ изображения: На послеоперационный день 21-28, предварительное лечение, анестезию, и интубировать кроликов, как ранее описано в 3.1.1-3.1.2. Расположите кроликов в подошвавом положении в доклиническом томографе и получите изображения таза и живота после введения 10 мл внутривенного контрастного агента иохесола.
    2. Хирургический мониторинг: Передача кроликов в операционную после визуализации в то время как еще под общим анестетиком. Позиция, prep и драпировка кроликов, как ранее описано в шаге 3.1.4 и выполнить повторный разрез лапаротомии примерно 1,5 см в длину через предыдущий разрез. Определите и рога матки и тщательно обследовать на опухоль. Закройте разрез и предоставьте послеоперационную помощь, как описано ранее в шаге 3.5.2-3.5.4.
    3. Использование модели кролика: Если кролики найдены, что имеют туморы во время хирургического мониторинга, то используйте модели рака endometrial кролика для запланированных экспериментов. Используйте кроликов, созданных из in vivo размножаемых клеток для дополнительных экспериментов на 4-недельный пост-прививки и использовать кролика модели, созданные из культивированных клеток VX2 примерно 5-6 недель после прививки для учета замедления роста опухоли. Эвтаназия кроликов после опухоли достигает 1-1,5 см в диаметре (измеряется внешне с калиперами) с помощью ветеринарного утвержденного метода. Подтвердите эвтаназию, проверяя жизненно важные признаки, включая частоту сердечных приступов и частоту дыхания. Акциз опухоли с помощью стерильных инструментов после очистки области с бетадин раствором.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Двадцать восемь кроликов были использованы для создания модели рака эндометрия. На момент эксперимента средний вес кроликов составил 2,83 кг (2,71-3,58 кг). Опухоли матки успешно росли в 21 кроликов для общего успеха модели 75%. До включения маточных сшивок в протокол, показатель успеха составил 57% по сравнению с 81% после маточных сшивания был добавлен. Зашивание моты было добавлено в протокол после7-го кролика в ответ на первоначальный низкий показатель успеха модели. Пять м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом мы сообщили о стандартизированном хирургическом методе для создания модели рака эндометрия VX2 и сообщили о первом использовании культивированных клеток VX2 для создания этой модели. Уровень опухоли 75% ниже, чем 100% процент ставка ранее сообщалось в литературе35,37,53,56; однако, thw 90% скорость патологически подтвержденных метастазах лимфатических узлов согласуется с предыдущими иссл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было профинансировано Научно-исследовательским институтом Терри Фокса (PPG-1075), Канадским институтом исследований в области здравоохранения (Фонд Грант #154326), Канадским институтом исследований онкологического общества (704718), Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады, Фонд инноваций ИАнада и Фонд принцессы Маргарет Рак.

Я хотел бы поблагодарить доктора Маргариту Акенс за предоставление первоначальных клеток VX2 для создания первоначальной модели VX2 и замороженных блоков опухоли VX2. Я хотел бы поблагодарить Марко DiGrappa за помощь в выполнении первоначальных экспериментов Культуры клеток VX2 и Лили Дин за помощь с культурой клеток VX2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
скальпель с 11 лезвиями, стерильный, одноразовыйосиновый хирургический (VWR)80094-086
катетер для ушных вен с 22 лезвиямиCDMV14332
3-0 рассасывающийся полифиламентный шовный материал (Polysorb)Covidien356718
3-0 плетеный рассасывающийся шовный материал (Polysorb)Covidien356718
ситечко 70 мкм, индивидуально упакованный, нейлонFalcon352350
Ацепромазин (Атравет)CDMV1047
Бетадиновое мыло (Повиодон йод 7,5%)CDMV4363
Раствор бетадина (Повиодон йод 10%)UHN Stores457955
БупренорфинУниверситет
ЦефазолинUHN стационарная аптекаНет Cat # Требуется
Раствор хлоргексидинаCDMV119872
Corning BioCoatCellware, Коллаген Тип I, 100мм посудаCorning354450марка не важна
Corning BioCoatCellware, Коллаген Тип I, 24-луночные пластиныCorning354408марка не важна
Corning BioCoatCellware, Коллаген Тип I, 6-луночные пластиныCorning354400марки не важно
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 млCorning354234
DMEM/HAM F12 1:1Life Technologies11320торговая марка
не важна DMSOCaledon Lab Chem1/10/4100
Энрофлоксацин (Байтрил инъекционный)CDMV11242
Falcon TubeCorning Centri-Star430828
Фетальная бычья сыворотка, квалифицированная, канадского происхождения, 500 млLife Technologies12483020бренд/источник не важно
ИзофлуранUHN стационарная аптекаNo Cat # Требуется
изогексол контрастGE Healthcare407141210
мелоксикам (Метакам 0,5%)CDMV104674
бренд Normal SaltHouse (UofT) Medstore)1011
PBSMulticell или Sigma331-010-CL или D8537-500mL
пенициллин/стрептомицин (100mL; 10000U пенициллин, 10000 мкг стрептомицина)Corning-CellgroCA45000-652
Стерильный сбалансированный раствор соли Hanks (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)T.C.M.F (Dr Bristow)28-Jan-11
Хирургический клей (тканевый адгезий)3M Vetbond14695B
Трипсин (0,25%), протеомный классSigmaT-6567-5X20UG
Трипсин-ЭДТА, 0,05%, 100млWisent Inc325-542-ELторговая марка не важна
Макгилла

Ссылки

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Canada, S. Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic cancer. , (2017).
  3. Siegel, R. Cáncer Statistics. Cáncer Journal. 67, 7-30 (2017).
  4. Creasman, W. T., et al. Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 60, 2035-2041 (1987).
  5. Morrow, C. P., et al. Relationship between surgical-pathological risk factors and outcome in clinical stage I and II carcinoma of the endometrium: A gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology. 40, 55-65 (1991).
  6. Hicks, M., et al. The National Cancer Data Base report on Endometrial carcinoma in African-American women. Cancer. 83, 2629-2637 (1998).
  7. Barrena Medel, N. I., et al. Comparison of the prognostic significance of uterine factors and nodal status for endometrial cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 204, 1-7 (2011).
  8. Randall, M. E., et al. Randomized phase III trial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma: A gynecologic oncology group study. Journal of Clinical Oncology. 24, 36-44 (2006).
  9. Galaal, K., Al Moundhri, M., Bryant, A., Lopes, A. D., Lawrie, T. A. Adjuvant chemotherapy for advanced endometrial cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014, 2-4 (2014).
  10. Orr, J. W., Holimon, J. L., Orr, P. F. Stage I corpus cancer: is teletherapy necessary? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176, discussion 788-789 777-788 (1997).
  11. Ng, T. Y., Perrin, L. C., Nicklin, J. L., Cheuk, R., Crandon, A. J. Local recurrence in high-risk node-negative stage I endometrial carcinoma treated with postoperative vaginal vault brachytherapy. Gynecologic Oncology. 79, 490-494 (2000).
  12. Mohan, D. S., et al. Long-term outcomes of therapeutic pelvic lymphadenectomy for stage I endometrial adenocarcinoma. Gynecologic Oncology. 70, 165-171 (1998).
  13. Straughn, J. M., et al. Stage IC adenocarcinoma of the endometrium: Survival comparisons of surgically staged patients with and without adjuvant radiation therapy. Gynecologic Oncology. 89, 295-300 (2003).
  14. Panici, P. B., et al. Systematic pelvic lymphadenectomy vs no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: Randomized clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 100, 1707-1716 (2008).
  15. ASTEC study group,, et al. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomised study. The Lancet. 373, 125-126 (2009).
  16. Kilgore, L., et al. Adenocarcinoma of the Endometrium: Survival comparisons of patients with and without pelvic node sampling. Gynecologic Oncology. 56, 29-33 (1995).
  17. Trimble, E. L., Kosary, C., Park, R. C. Lymph node sampling and survival in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 71, 340-343 (1998).
  18. Chan, J. K., et al. The outcomes of 27,063 women with unstaged endometrioid uterine cancer. Gynecologic Oncology. 106, 282-288 (2007).
  19. Cragun, J. M., et al. Retrospective analysis of selective lymphadenectomy in apparent early-stage endometrial cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 3668-3675 (2005).
  20. Piovano, E., et al. Complications after the treatment of endometrial cancer: A prospective study using the French-Italian glossary. International Journal of Gynecological Cancer. 24, 418-426 (2014).
  21. Abu-Rustum, N. R., et al. The incidence of symptomatic lower-extremity lymphedema following treatment of uterine corpus malignancies: A 12-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Gynecologic Oncology. , 714-718 (2006).
  22. Todo, Y., et al. Risk factors for postoperative lower-extremity lymphedema in endometrial cancer survivors who had treatment including lymphadenectomy. Gynecologic Oncology. 119, 60-64 (2010).
  23. Beesley, V., Janda, M., Eakin, E., Obermair, A., Battistutta, D. Lymphedema after gynecological cancer treatment: Prevalence, correlates, and supportive care needs. Cancer. 109, 2607-2614 (2007).
  24. Haldorsen, I. S., Salvesen, H. B. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer? Current Oncology Reports. 18, 1-11 (2016).
  25. Aravalli, R., Cressman, E. Relevance of Rabbit VX2 Tumor Model for Studies on Human Hepatocellular Carcinoma: A MicroRNA-Based Study. Journal of Clinical Medicine. 4, 1989-1997 (2015).
  26. Kreuter, K. A., et al. Development of a rabbit pleural cancer model by using VX2 tumors. Comparative Medicine. 58, 287-293 (2008).
  27. Li, S., Ren, G., Jin, W., Guo, W. Establishment and characterization of a rabbit oral squamous cell carcinoma cell line as a model for in vivo studies. Oral Oncology. 47, 39-44 (2011).
  28. Muhanna, N., et al. Multimodal Nanoparticle for Primary Tumor Delineation and Lymphatic Metastasis Mapping in a Head-and-Neck Cancer Rabbit Model. Advanced Healthcare Materials. 4, 2164-2169 (2015).
  29. Tong, H., Duan, L., Zhou, H., Feng, S. Modification of the method to establish a hepatic VX2 carcinoma model in rabbits. Oncology Letters. 15, 22-23 (2018).
  30. Bimonte, S., et al. Induction of VX2 para-renal carcinoma in rabbits: generation of animal model for loco-regional treatments of solid tumors. Infectious Agents and Cancer. 11, 1-8 (2016).
  31. Handal, J. A., et al. Creation of rabbit bone and soft tissue tumor using cultured VX2 cells. Journal of Surgical Research. 179, e127-e132 (2013).
  32. Pezeshki, P. S., et al. Bone targeted bipolar cooled radiofrequency ablation in a VX-2 rabbit femoral carcinoma model. Clinical and Experimental Metastasis. 32, 279-288 (2015).
  33. Wang, Y., et al. Magnetic resonance imaging-navigated argon-helium cryoablation therapy against a rabbit VX2 brain tumor. Experimental and Therapeutic. 9, 2229-2234 (2015).
  34. Zhang, W., et al. Laparotomy cryoablation in rabbit VX2 pancreatic carcinoma. Pancreas. 46, 288-295 (2017).
  35. Xu, L. -Q., Huang, Y. -W., Luo, R. -Z., Zhang, Y. -N. Establishment of the retroperitoneal lymph node metastasis model of endometrial VX2 carcinoma in rabbits and observation of its metastatic features. World Journal of Surgical Oncology. 13, 109(2015).
  36. Duan, P., Lü, J. Q., Tu, Q. M., Yu, Z. K. Magnetic resonance evaluation of transplanted endometrial carcinoma and its lymph node metastasis in rabbits. Chinese Journal of Cancer Research. 19, 201-205 (2007).
  37. Huang, Y. -W., et al. VEGF-c expression in an in vivo model of orthotopic endometrial cancer and retroperitoneal lymph node metastasis. Reproductive Biology and Endocrinology. 11, 49(2013).
  38. Kidd, J. G., Rous, P. A transplantable rabbit carcinoma originating in a virus-induced papilloma and containing the virus in masked or altered form. J Exp Med. 71 (6), 813-838 (1940).
  39. Shope, B. R. E., Hurst, B. E. W. Infectious papillomatosis of rabbits. , (1933).
  40. Galasko, C. S. B., Haynes, D. W. Survival of VX2 carcinoma cells in vitro. European Journal of Cancer. 12 (1965), 1025-1026 (1965).
  41. Osato, B. Y. T., Ito, Y. In vitro Cultivation And Immunofluorescent Studies Of Transplantable Carcinomas Vx2 And Vx7. , Laboratory of Viral Oncology, Research Institute, Aichi Cancer Center. Nagoya, Japan. (1967).
  42. Easty, D. M., Easty, G. C. Establishment of an in vitro cell line from the rabbit VX2 carcinoma. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 39, 333-337 (1982).
  43. Liu, X., et al. Establishment and characterization of a rabbit tumor cell line VX2. Zhonghua bing li xue za zhi Chinese Journal of Pathology. 34, 661-663 (2005).
  44. Parvinian, A., Casadaban, L. C., Gaba, R. C. Development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer: a pictorial primer and “how to” guide. Diagnostic and Interventional Radiology. 20, 335-340 (2014).
  45. Pascale, F., et al. Modified model of VX2 tumor overexpressing vascular endothelial growth factor. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23, 809-817 (2012).
  46. Oshiro, H. The role of the lymphatic system in rabbit models for cancer metastasis research a perspective from comparative anatomy. Okajimas Folia Anatomica Japonica. , 6-7 (2014).
  47. Guan, L., Xu, G. Destructive effect of HIFU on rabbit embedded endometrial carcinoma tissues and their vascularities. Oncotarget. 8, 19577-19591 (2017).
  48. Oshiro, H., et al. Establishment of successively transplantable rabbit VX2 cancer cells that express enhanced green fluorescent protein. Medical Molecular Morphology. 48, 13-23 (2015).
  49. Graur, D., Duret, L., Gouyt, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379, 333-335 (1996).
  50. Bõsze, Z., Houdebine, L. M. Application of rabbits in biomedical research: A review. World Rabbit Science. 14, 1-14 (2006).
  51. Kyotani, S., et al. A study of cis-diamminedichloroplatinum(II) suppositories for the treatment of rabbit uterine endometrial carcinoma. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 16, 55-58 (1993).
  52. Harima, Y., Harima, K., Hasegawa, T., Shikata, N., Tanaka, Y. Histopathological changes in rabbit uterus carcinoma alter transcatheter arterial embolization using cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38, 317-322 (1996).
  53. Huang, Y. W., et al. Tumor-induced VEGF-C overexpression in retroperitoneal lymph nodes in VX2 carcinoma-bearing rabbits. Drug Design, Development and Therapy. 9, 5949-5956 (2015).
  54. Bio-Rad. Real-Time PCR Applications Guide. , Bulletin 5279 (2006).
  55. Taylor, S., et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. BioRad Bulletin. , 5859(2009).
  56. Rhee, T. K., et al. Rabbit VX2 Tumors as an Animal Model of Uterine Fibroids and for Uterine Artery Embolization. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 18, 411-418 (2007).
  57. Takahashi, K., et al. Development of a mouse model for lymph node metastasis with endometrial cancer. Cancer Science. 102, 2272-2277 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

VX2in vivo
Ортотопические эндометрия рака модель с ретроперитонеальной лимфаденопатии Сделано из In Vivo распространяется и культивированных VX2 клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.