Method Article

Модель In Vitro 3D и вычислительный трубопровод для количественной оценки васкулогенного потенциала iPSC-производных эндотелиальных прародителей

DOI:

10.3791/59342

⸱

May 13th, 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндотелиальные прародители, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC-EPs), обладают потенциалом для революционизации лечения сердечно-сосудистых заболеваний и создания более верных моделей сердечно-сосудистых заболеваний. Здесь описана инкапсуляция iPSC-EPs в трехмерных (3D) коллагеновых микросредах и количественный анализ васкулогенного потенциала этих клеток.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) являются специфическим для пациента, пролиферативным источником клеток, который может дифференцироваться в любой тип соматических клеток. Бипотентэндилиальных прародителей (EPs), которые могут дифференцировать в типы клеток, необходимых для сборки зрелых, функциональных сосуд, были получены из эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Однако эти клетки не были тщательно оценены в трехмерных средах, и количественное измерение их васкулогенного потенциала остается неуловимым. Здесь сначала очерчиваются генерация и изоляция iPSC-EPs с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток, за которым ипотретешься инкапсуляция и культура iPSC-EPs в коллагеновых гидрогелях. Эта внеклеточная матрица (ECM)-мимикрирующая микроокружение поощряет надежную васкулогенную реакцию; сосудистые сети образуются после недели культуры. Очертивалось создание вычислительного конвейера, используюго программное обеспечение с открытым исходным кодом для количественной оценки этого васкулогенного ответа. Этот конвейер специально разработан для сохранения 3D-архитектуры капиллярного сплетения для надежного определения количества ветвей, точек ветвления и общей длины сети с минимальным пользовательским входом.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческие пупочные вены эндотелиальных клеток (HUVECs) и других основных типов эндотелиальных клеток были использованы в течение двух десятилетий для моделирования прорастания кровеносных сосудов и развития в пробирке1. Такие сосудистые платформы обещают осветить молекулярные и тканевые механизмы сердечно-сосудистых заболеваний и могут представить физиологическое понимание развития примитивных сосудистых сетей2,3. Хотя область сосудистого моделирования стала свидетелем значительных достижений, "золотой стандарт" анализ, который может количественно моделировать и оценивать физиологиче....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка культурных носителей и покрытий

  1. Для приготовления раствора покрытия витромонектина разбавляют витромонектин 1:100 в фосфатно-буферном сольниковом растворе Dulbecco (DPBS).
    ВНИМАНИЕ: После разбавления не рекомендуется хранить это решение для использования в будущем.
  2. После получения фенола без красного, фактор роста снижение желатиновой белковой смеси (см. Таблица материалов) от производителя, оттаивать на льду при 4 градусов по Цельсию, пока смесь не станет прозрачной и жидкости. Сохраняя смесь на льду в ламинарном капоте потока, пипетка 75 л. смеси в микроцентрифуге мощностью 1,8 мл и немедленно замерзает при -20 г....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После дифференциации(Рисунок 1), FACS и инкапсуляции iPSC-EPs в коллагеновых гидрогелях, клетки, как правило, остаются округлыми в течение 24 ч, прежде чем начать мигрировать и образуют начальные люмены. Примерно через 6 дней культуры, примитивное капиллярное сплетение будет видно в гидрогеле при просмотре с яркой микроскопией поля(рисунок 2). После визуализации фиксированных, окрашенных гидрогелей нагруженных клетками на конфока.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол включает в себя долгосрочную культуру клеток в трех типах носителей клеточной культуры: E8, LaSR Basal и EGM-2. Поэтому следует провести большую осторожность, чтобы надлежащим образом стерилизовать все материалы. Кроме того, лабораторные пальто и этинол-очищенные перчатки всегда следует носить при работе в ламинарном капоте. Рекомендуется часто тестировать на микоплазму загрязнения; если большое количество мусора наблюдается во время культуры iPSC или внезапное падение эффективности дифференциации отмечаетс.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Американской ассоциацией сердца (грант номер 15SDG25740035, присуждается J.З.), Национальный институт биомедицинской визуализации и биоинженерии (NIBIB) Национальных институтов здравоохранения (грант номер EB007507, присуждается C.C.), и Альянс по исследованиям в области регенеративной реабилитации и обучения (AR3T, грант No 1 P2C HD086843-01, присуждаемый Дж.З.). Мы хотели бы отметить профессора Джин Стаховяк (Техасский университет в Остине) за ее технические рекомендации по конфокальной микроскопии. Мы также признательны за беседы с Сэмюэлем Михеличом (Техасский университет в Остине), д-ром Алисией Аллен (Техасский университет в Остине), д....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
µ-Slide AngiogenesisIbidiN/AПлоская пластина для культуры тканей со стеклянным дном и боковыми стенками позволяет проводить легкую конфокальную визуализацию
96 лунка, круглое дно, микропланшет со сверхнизким прикреплением, стерильныйCorning7007Предотвращает связывание насыщенных клетками коллагеновых гидрогелей с чашкой для клеточной культуры
AccutaseSTEMCELL Technologies7920Щадящий раствор для отслойки клеток; не разрушает внеклеточные эпитопы, жизненно важные для FACS
Advanced DMEM/F12Thermo Scientific12634010Базовая среда для дифференцировки iPSC-EP.
Barnstead GenPure xCAD Plus Thermo Fisher Scientific50136165Система очистки воды; другие могут быть легко заменены
раствором бычьей сыворотки альбумина, 7,5% в DPBS, стерильно-отфильтрованным, BioXtra, подходящим для клеточной культурыFisher ScientificA8412Для сохранения жизнеспособности клеток при сортировке FACs
CD34-PE, человеческий (клон: AC136)Miltenyi Biotec130-098-140Антитело, используемое для выделения FACs iPSC-EP
CHIR99021LC LaboratoriesC-6556Индуцирует образование мезодермы из плюрипотентных стволовых клеток
Коллаген I Rat Tail High Protein 100 мгVWR354249Основной компонент 3D микроокружения
Конические центрифужные пробирки (15/50 мл)Fisher Scientific14-959-49D/AИспользуется для хранения и смешивания относительно больших объемов реагентов и сред
клеточных культурDAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306Для окрашивания и визуализации ядра клеток
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11320-082Для разбавления Матригеля и размораживания плюрипотентных стволовых клеток
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS)ThermoFisher14190-250Для промывки монослойных культур
EDTASigma-AldrichE8008Для пассирования колоний плюрипотентных стволовых клеток и для предотвращения агрегации клеток при сортировке ФАК
Среда для роста эндотелиальных клеток 2PromoCellC-22011Способствует жизнеспособности и пролиферации эндотелиальных клеток
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001   Для поддержания плюрипотентных стволовых клеток
Глицин, BioUltra, для молекулярной биологии, >=99,0% (NT)Sigma-Aldrich50046Нейтрализует оставшийся детергент
L-Аскорбиновая кислота 2-фосфат сесквимагния соль гидрат, >=95%Sigma-AldrichA8960Компонент среды дифференцировки iPSC-EP
MATLABMathWorks1.8.0_152Мультипарадигмальная численная вычислительная среда (бесплатно доступна в большинстве учебных заведений)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 мл (смесь желатиновых белков)Fisher Scientific356231Разведенный в DMEM/F12 для покрытия планшетов для дифференцировки iPSC-EP
Medium-199 10XThermo Fisher Scientific1825015Используется для балансировки конечной осмолярности гидрогеля и pH
Микроцентрифужные пробирки (1,7 мл)VWR87003-294Хранит небольшие объемы реагентов
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma-AldrichP3813Основной ингредиент иммуноокрашивающих растворов
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Thermo Fisher Scientific15140122Антибиотик используется после сортировки для удаления возможных загрязнений из прибора FACS
Рекомбинантный человеческий VEGF 165 ProteinR& D Systems293-VEMitogen, стимулирующий пролиферацию эндотелиальных клеток и тубулогенез
Rhodamine phalloidinThemo Fisher ScientificR415Для идентификации отложения F-актина и последующего определения границ сосудистых сеток
Triton X-100 (неионогенное поверхностно-активное вещество)Sigma-AldrichX-100Моющее средство, используемое для мягкого проникновения в клетки
Tween-20 (эмульгирующий реагент)Fisher ScientificBP337Повышает специфичность связывания добавленных антител
VE-Cadherin (F-8)Santa Cruz Biotechnologysc-9989 Для выявления 3D эндотелиального просвета в коллагеновых гидрогелях
ВитронектинThermoFisherA14700Для поддержания плюрипотентных стволовых клеток
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Сохраняет жизнеспособность плюрипотентных стволовых клеток и iPSC-EP при диссоциации и повторном посеве

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

iPSC Derived Endothelial ProgenitorsFluorescent Activated Cell SortingCollagen Hydrogel EncapsulationVasculogenic Potential Quantification3D Vascular Network FormationConfocal Microscopy AnalysisOpen Source Computational PipelineEndothelial Growth Medium 2ROCK Inhibitor Y 27632Vascular Endothelial Growth Factor

Related Articles