Последовательная иммунофлуоресценция и иммуногистохимия на криосекционированных эмбрионах зебры

Зебрафиш является чрезвычайно надежной моделью организма, которая в настоящее время используется в самых различных дисциплинах в биомедицинских исследованиях. В частности, быстрое внешнее развитие и прозрачность эмбрионов зебры являются отличным инструментом для исследований in vivo. Здесь мы описываем метод последовательного иммунофлуоресценции (ИФ) и иммуногистохимический (IHC) анализ криосекционных эмбрионов зебры. Эта новая процедура использует последовательное применение двух антител на одном слайде, что позволяет точно идентифицировать colocalized белки на клеточном уровне при сохранении секций тканей. Этот протокол особенно полезен для исследований с моделью зебры, так как относительно небольшое количество антител было проверено для использования в приложениях IF and/or IHC в зебрафишах по сравнению с моделями мыши.

Наблюдение межклеточных взаимодействий является важным элементом во многих исследованиях, и может обеспечить ключевое понимание молекулярных механизмов, функционирующих на клеточном уровне, которые лежат в основе фенотипов на уровне организма. Кроме того, экспрессия белка может дать информацию о клеточной функции, особенно при изучении экспрессии нескольких белков одновременно внутри клетки (колокализация). Хотя цельномонтаж IHC и ЕСЛИ являются широко используемыми методамидля анализа экспрессии белка в эмбрионах зебры 1,^2,3,5,целые процедуры крепления могут быть проблематичным для получения точных данных о колокализации. По нашему опыту, может быть трудно различать слои ткани и визуализировать экспрессию белка на одноклеточном уровне в цельномонтажных образцах. Воображение программ ных программ, как правило, не в состоянии различать поверхности окрашивания по сравнению с глубоким окрашивание. Неповерхностные протеиновые выражения могут быть скрыты более ярко выраженным выражением уровня поверхности, что приводит к неточностям в количественной оценке. Кроме того, большинство традиционных методов очистки зебры являются довольно токсичными⁶ и, таким образом, менее желательныдля для использования.

Методы на основе антител, такие как IF и IHC, часто используются для обнаружения экспрессии белка в секционированном материале, упрощая идентификацию популяций дискретных клеток, которые выражают определенный белок в сложных тканях. IHC обычно используется для колокализации, чаще всего с помощью двух различных антител, спряженныху разных видов хозяев и визуализированных с различными цветными хромогенами 4,^{7,8,9 , 10}. Однако, использование нескольких хромогенов может привести к неспецифическим фоновым окрашиванием или несовместимости цветов^11,12.

Мы разработали новый протокол для обнаружения нескольких белков последовательными IF и IHC на криосекционных эмбрионах зебры на ранней стадии. Криосекция особенно хорошо подходит для деликатных тканей, таких как эмбрионы зебры, и криосекции превосходят парафин встроенных разделов для флуоресценции на основе анализов^13,14. Мы решили оптимизировать комбинированные IF и IHC, а не двухцветный IF или IHC, чтобы обойти проблему несовместимости антител для одного типа асссе. Эти проблемы особенно актуальны для исследований с участием зебры из-за ограниченного количества коммерчески доступных антител, которые проверяются для использования в зебрафиш. В самом деле, исследование четырех крупных компаний показали, что коммерчески доступные антитела для использования в мыши было около 112000 против около 5300 для использования в зебрафиш¹⁵. Наконец, мы решили разработать протокол, который может быть выполнен на одном криосекции, что имеет важное значение при работе с небольшими или ограниченными образцами тканей, такими как полученные из эмбрионов зебры.

Этот протокол был разработан для оценки пролиферативного поведения донорских клеток в 48 ч после оплодотворения эмбрионов химерных зебры, которые были созданы путем пересадки бластулы до бластулы, как описано Кармани-Рампе и Moens¹⁶. Эмбрионы доноров вводились на одноклеточной стадии с флуоресцентно помечены dextran конъюгировать до трансплантации донорских клеток в эмбрионы реципиента. Мы использовали иммунофлуоресценцию для S 10 фосфорилированных Histone H3 (pH3) для обнаружения размножающихся клеток, а затем иммуногистохимии для помечены dextran для обнаружения донорских клеток в химерных эмбрионов зебрафиш. Последовательное обнаружение pH3 и помеченного декеспна в пределах одной криосекции позволило нам определить и количественно определить отдельные клетки, которые выражали оба маркера.

Этот последовательный протокол IF/IHC для криосекционных зебр ыбры станет полезным инструментом для исследователей зебры, которые желают протокола колокализации для экспрессии белка. Проблемы, которые этот протокол был разработан для решения, такие как небольшие образцы тканей и ограниченной доступности антител, не являются уникальными для модели зебры. Таким образом, этот метод может быть поймем любому исследователю, желая выполнить последовательный IF/IHC.

ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ ЭТИКЕ:

Все исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию, Университетом штата Северная Каролина, Роли, Северная Каролина, США.

1. Подготовка эмбрионов

1. Исправить 48 ч после оплодотворения (hpf) химерных эмбрионов зебры, порожденных blastula-to-blastula трансплантации между AB дикого типа эмбрионов зебры в 4% параформальдегида (PFA) ночь с качания на 4 КС. Выполните два 5 мин моет с качания при комнатной температуре с помощью 500 злител 1x фосфат буферного сосудистого, содержащего 0,1% от не-ионического сурфактанта (1x PBSt; см. Таблицу материалов)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параформальдегид является токсичным и канцерогеном и должен быть надлежащим образом утилизирован в соответствии с институциональными нормами. Работа с параформальдегидом должна выполняться в химическом капюшоне, а также всегда использовать соответствующее средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторное пальто и защитные очки).
2. Обезвоживать эмбрионы путем последовательного мытья с 500 зл и 30%, 50%, и 70% метанола (MeOH) разбавленной 1x PBSt в течение 10 минут каждый при комнатной температуре с качания. Инкубировать эмбрионы в 500 л 100% MeOH при -20 градусах по Цельсию, по крайней мере 14 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Метанол является токсичным и должен быть надлежащим образом утилизирован в соответствии с институциональными нормами. Работа с метанолом должна выполняться в химическом капюшоне, а также всегда использовать соответствующее средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторное пальто и защитные очки).
3. Регидратировать эмбрионы путем мытья последовательно с 500 зл 70%, 50%, и 30% MeOH разбавленной 1x PBSt в течение 10 минут каждый при комнатной температуре с качания. Выполните два 5 мин стир с 500 л 1x PBSt при комнатной температуре с качания.
4. Удалить 1x PBSt и инкубировать в 500 л 30% сахарозы, разбавленной деионизированной водой при комнатной температуре с качания, пока эмбрионы не опустятся на дно трубки (примерно 1 ч). Замените сахарозу 500 л из 15% рыбного желатина/25% сахарозы (15/25; см. Таблицу Материалов) и инкубация при комнатной температуре с качания на ночь.
5. Замените примерно половину объема 15/25 оптимальной температурной средой резки (OCT medium) и инкубация при комнатной температуре с качания до тех пор, пока эмбрионы не опустятся на дно трубки (примерно 1 ч).
6. Замените примерно половину объема OCT-средой и инкубация при комнатной температуре с качания в течение 1 ч. Повторите этот шаг один раз.
7. Во время инкубационных ступеней с 15/25 и OCT среды, инвертировать или флик трубки по мере необходимости, чтобы объединить эти реагенты.

2. Эмbedding и подготовка криосекций эмбрионов

1. Перенос эмбрионов в пластиковую форму (см. таблицуматериалов) с помощью щипц, минимизируя любой перенос смеси 15/25-OCT. Заполните форму примерно наполовину полной с OCT среды и аккуратно смешать эмбрионы в OCT среды.
2. Подготовьте помеченные пластиковые формы и перенесите желаемые эмбрионы (обычно эмбрионы 1'u20123) в пустые, помеченные пластиковые формы, минимизируя перенос OCT medium. Как только желаемые эмбрионы находятся в пластиковой плесени, аккуратно заполните OCT среды в верхней части формы.
3. Используйте щипцы или 25 G иглы, чтобы организовать эмбрионы в желаемой ориентации, используя свет овой стереомикроскоп для визуализации(Рисунок 1A, B).
4. Заморозить подготовленные формы на сухом льду в изолированном контейнере с металлической платформой. Поместите ведро льда или пены кулер осторожно над металлической платформой для создания холодной камеры(Рисунок 1C, D)
5. Приготовьте криосекции толщиной 10 х u201212 мкм с помощью криостата, установленного при -20 градусов по Цельсию.
   1. Назначьте один блок за один раз и использовать OCT среды заморозить блок на диск / чак с нижней части блока, обращенного к лезвию (Рисунок 2A). Убедитесь, что блок полностью заморожен на диске (среда OCT станет белой) перед началом секции(рисунок 2B).
   2. Место криосекций на заряженных стеклянных слайдов(Рисунок 2C, D) и воздух сухой слайды на ночь при комнатной температуре.

3. Иммунофлуоресценция для pH3

1. Выполните три 5 минут стирок в 1x PBS в соответствующем контейнере, таких как банку Коплин. Если ткани не очень хорошо прилипли к слайду, выполняйте стирание, укладывая горки на плоскую поверхность и аккуратно прокладывая на поверхность 500 зл 1x PBS. Налейте 1x PBS между омывает, мягко опрокидывания слайдов.
2. Очертите разделы с барьерной ручкой или восковым карандашом, чтобы сохранить жидкость на слайдах(рисунок 3).
3. Положите слайды на плоскую поверхность во влажной камере и пипетке 200 зл блока буфера на секцию на слайды. Инкубировать в блок-буфере на 2 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
4. Подготовка первичного разбавления антител (кролик анти-pH3 антитела, 1:200; см. Таблица материалов) в блок буфера и хорошо перемешать путем пипетки. Аккуратно наконечник слайдов, чтобы слить блок буфера, вернуться к влажной камере, и пипетка 200 Л первичного раствора антитела на секцию на слайдах. Для управления только на вторичном, пипетка 200 Л блока буфера на соответствующие разделы.
5. Инкубировать горки при 4 градусах Цельсия в ночное время во влажной камере, наполненной деионизированной водой. Печать края влажной камеры, чтобы помочь сохранить влагу.
6. Выполните три 5 минут стирок в 1x PBS в соответствующем контейнере, таких как банку Коплин. Во время мытья шаги, подготовить вторичное разбавление антител (анти-кролилич флуоресцентных вторичных антител конъюгированы, 1:2,000; см. Таблица материалов) в блок буфера и хорошо перемешать путем пипеттинг.
7. Положите слайды на плоскую поверхность во влажной камере и пипетке 200 л вторичного раствора антитела на секцию на слайды. Инкубировать слайды во вторичном растворе антитела (ы) при комнатной температуре, защищенной от света, в течение 30 мин.
8. Выполните три 5 минут стирок в 1x PBS в соответствующем контейнере, таких как банку Коплин, защищенной от света. Во время мытья шаги, подготовить ядерный раствор окрашивания (см. таблицу материалов).
9. Поместите слайды на плоскую поверхность и пипетку 200-u2012500 л (в зависимости от размера образца) раствора ядерного окрашивания на каждом участке. Инкубировать горки в ядерном растворе окрашивания в течение 10 минут, защищенных от света.
10. Слейте с себя ядерный раствор окрашивания и смонтировать слайды с незатвердевшимфлялю монтажа и стеклянным крышкой. Поддерживайте слайды в темноте при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока не будет выполнена визуализация.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшие результаты получены, когда слайды изображены в тот же день или на следующий день.
11. Следуя IF, визуализируйте и нанесем изображение слайдов с помощью конфокального флуоресценционного микроскопа и цифровой камеры с использованием 555 нм (красный) и 645 нм (далеко-красный) эмиссионных фильтров при 100-кратном увеличении (10x глазное увеличение и 10x объективное увеличение). Держите лазерную мощность последовательной на протяжении всей визуализации.
12. После изображения поместите слайды в отдельные контейнеры 1x PBS и хранить плоские на 4 кв с ночь, чтобы подготовиться к удалению coverslip. При размещении слайдов в 1x PBS, осторожно агитировать слайды, чтобы помочь в удалении coverslip.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не нажимаете вниз на coverslip или попытка извлечь coverslip вручную, по мере того как это может поставить под угрозу качество разделов. Крышки должны быть удалены горизонтально с минимальным и вынужденным движением.

4. Иммуногистохимия для маркированного Декентна

1. После того, как крышки были удалены, аккуратно перенесите слайды в новый 1x PBS в соответствующем контейнере, например, банку Coplin. Удалите 1x PBS и выполнить три 5 мин инкубации слайдов в 1x Tris-буферный физраствор с 0,1% от не-ионического сурфактанта (1x TBSt) при комнатной температуре.
2. Приготовьте 250 мл перекиси 3% водорода (H₂O₂₎разбавленной в деионизированной воде в контейнере соответствующего размера. Инкубировать горки в 3% H₂O₂ раствор при комнатной температуре в течение 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перекись водорода является коррозионной и должна быть надлежащим образом утилизирована в соответствии с институциональными нормами. Всегда следует использовать соответствующее оборудование для индивидуальной защиты (перчатки, лабораторное пальто и защитные очки).
3. Быстро промыть горки деионированной водой. Выполните три 5 мин стирок в 1x TBSt. Тщательно высушить область вокруг секций ткани и поместить слайды плоским во влажной камере. Очертите разделы ткани с барьерной ручкой или восковым карандашом, чтобы сохранить жидкость на секциях, если это необходимо.
4. Примените готовое к использованию решение для блокирования сыворотки с ываточной сыворотки с вторичным набором для маркировки антител (см. таблицуматериалов) к каждому разделу. Инкубировать горки во влажной камере при комнатной температуре 20 мин.
5. Подготовьте первичное антитело, разбавленное разбавителем антител (кролик антимаркированный деквент, 1:7,500; см. таблицу материалов)и перемешайте нежным пипеттингом. Аккуратно наконечник слайдов, чтобы слить блок буфера, высушить область вокруг разделов, и место слайды плоские во влажной камере.
6. Не мыть перед нанесением первичного раствора антитела. Пипетка 200 л первичного раствора антитела на секцию на слайды и инкубировать во влажной камере при 4 градусах Цельсия в одночасье. Для контроля только на вторичном, пипетка 200 Л разбавитель антител на соответствующие разделы.
7. Аккуратно наконечник слайдов, чтобы слить основной раствор антитела и поместить в 1x TBSt в соответствующий контейнер, таких как банку Коплин. Выполните два 5 минут стирок в 1x TBSt. Сухой области вокруг разделов и место плоским во влажной камере.
8. Примените готовый к использованию фоноснижающий блокирующий реагент (см. ТаблицуМатериалов) к каждому разделу. Инкубировать горки во влажной камере при комнатной температуре 20 мин.
9. Аккуратно наконечник слайдов, чтобы слить блок буфера, тщательно высушить область вокруг разделов, и место слайды плоские во влажной камере. Не мыть перед нанесением вторичного раствора антитела.
10. Нанесите готовый к использованию вторичный антитела (анти-кролиличский конедида пероксидазы (HRP) полимерное вторичное антитело; см. Таблицу материалов) к каждому разделу dropwise и инкубировать во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 минут.
11. Аккуратно наконечник слайдов, чтобы слить вторичный раствор антитела и поместить в 1x TBSt в соответствующий контейнер, таких как банку Коплин. Выполните два 5 минут стирок в 1x TBSt.
12. Подготовьте хромогенный субстрат HRP непосредственно перед использованием в соответствии с протоколом производителя (см. таблицуматериалов).
13. Высушите область вокруг секций, поместите слайды на плоскую поверхность и нанесите на каждую секцию 200 л хромогенного субстрата HRP. Инкубировать при комнатной температуре в течение 3 мин, начиная таймер, когда субстрат был применен к первому слайду(рисунок 4).
14. Слейте с передний спереди субстрат и кратко промойте слайды в банке Coplin, содержащей 1x PBS. Поместите горки в деионизированную воду в соответствующий контейнер, например, банку Коплин, и выполнить два 5 мин стирки в деионизированной воде с нежным возбуждением.
15. Противокоесть слайдов, поместив их в гематаксилин окрашивая раствор до 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гематоксилин является токсичным и должен быть удален в соответствии с институциональными нормами. Всегда следует использовать соответствующее оборудование для индивидуальной защиты (перчатки, лабораторное пальто и защитные очки).
16. Поместите горки в деионизированную воду в соответствующий контейнер, например, банку Коплин, и выполните три 5 мин смывает в деионизированной воде. Перенесите слайды в контейнер, содержащий водопроводную воду Скотта (см. таблицуматериалов) и инкубировать в течение 1 мин.
17. Поместите горки в деионизированную воду в соответствующий контейнер, например, банку Коплин, и выполните три 5 мин смывает в деионизированной воде.
18. Обезвоживать слайды через ряд этанола (EtOH) сортов (разбавленных в деионизированной воде) и ксилен в химическом капоте. Выполните одну 2 мин инкубации в 70% EtOH, два 1 мин инкубаций в 95% EtOH, два 1 мин инкубаций в 100% EtOH, и три 1 мин инкубаций в ксилене. Удалите слайды из ксилена и поместите coverslip в то время как мокрый с толуолом основе монтажа среды в химическом капоте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ксилен и толуол токсичны и легковоспламеняющиеся и должны быть надлежащим образом утилизированы в соответствии с институциональными нормами. Работа с ксиленом и толуолом должна выполняться в химическом капюшоне, а также всегда использовать соответствующее средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторное пальто и защитные очки).
19. Вслед за IHC визуализируйте и нанизируйте слайды со сложным световым микроскопом и цифровой камерой при 100-кратном увеличении (10x глазное увеличение и 10-кратное объективное увеличение). (Рисунок 5).

Мы разработали этот протокол для того, чтобы определить и проанализировать экспрессию белка в отдельных донорских клетках в 48 h после оплодотворения эмбрионов химерных зебры, которые были получены в результате пересадки бластулы до бластрула между эмбрионами зебры AB дикого типа. Успешный анализ экспрессии белка на одноклеточном уровне требовал подготовки криосекций с соответствующим ориентированными эмбрионами(рисунок 1 и рисунок2) и тщательного, последовательного применения методов IF и IHC к этим криосекции(рисунок 3 и рисунок4). Использование специфических антител для одновременного обнаружения размножающихся клеток (анти-pH3, Рисунок 5A, B) и донорских клеток (анти-маркированный декстран, Рисунок 5D)может быть использован для выявления и количественной оценки донорских клеток, которые активно размножаются ( Рисунок 5E). Для точной идентификации отдельных ячеек необходимо создавать высококачественные изображения как по if(рисунок 2A,B) и IHC (рисунок2D). Программа анализа изображений должна использоваться для выполнения наложения изображений(рисунок 5E). В зависимости от используемой программы анализа изображений, можно будет выполнять автоматизированные подсчеты помеченных ячеек, если будет желательна количественная оценка.

Рисунок 1: Приготовление замороженных блоков OCT. (A) 50x микроскопический вид эмбрионов в OCT в криогенной формы, подготовленной для замораживания. Красная стрелка указывает на положение эмбриона зебры на нижней поверхности плесени; черная стрелка указывает на хвост, указывающий на пользователя. (B) Пластиковые формы с эмбрионами и OCT размещены на охлажденной металлической платформе. (C) Пена льда ведро размещены над пластиковыми плесенью для создания замораживания камеры. (D) OCT становится белым от прозрачного, как только блок полностью заморожен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Криосекция замороженных блоков OCT. (A), Применение свежего OCT на криостатный диск и размещение замороженного блока на OCT, вращается на 180 градусов от замораживания ориентации блока. (B) Вид смота блока, замороженного на секционный диск. (C) Вид разделительного блока с рулонной пластиной в положении. (D) Пикап секций с помощью заряженного слайда с металлической платформы криостата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Просмотр подготовленных разделов после размещения на слайде. Стрелка указывает на гидрофобный барьер, а пунктирная линия разграничает зону, содержащую участки внутри барьерного периметра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Подготовка к применению хромогенного субстрата во время IHC. Слайд помещается на плоскую поверхность, покрытую полиэтиленовой пленкой, чтобы обеспечить равномерное применение хромогенного субстрата при одновременном содержании любого разлива опасного материала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Представитель IF и IHC маркировки криосекционных 48 л.с. химерных эмбрионов зебры, порожденных бластулой-к-бластулальной трансплантации между AB дикого типа эмбрионов зебры. (A) ЕСЛИ для обнаружения Ser 10 фосфорилированных Histone H3 (анти-pH3, 1:200) выражение в 48 л.с. химерных эмбрионов зебры. Красные и рН3-положительные клетки; синие и ядра. Желтые стрелки указывают на примеры положительных клеток. (B) Вычитание синего ядерного пятна в цифровом изображении (программное обеспечение ImageJ) повышает визуализацию pH3-положительных ячеек для количественной оценки и наложения изображения. (C) Отрицательный контроль (только вторичные антитела) для IF-исследования в криосекционном 48 л.с. химерного эмбриона зебры. Шкала бар представляет 50 мкм (применяется ко всем панелям). (D) IHC обнаружить помечены dextran (анти-маркированные dextran, 1:7,500) в химерных 48 л.с. зебрафиш эмбриона, порожденных бластулой-к-бластула трансплантации между AB дикого типа эмбрионов зебры. Эмбрионы доноров были введены с флуоресцентно помечены dextran конъюгировать на одноклеточной стадии до использования для blastula-к-blastula трансплантации. Красный цвет указывает на клетки, помеченные dextran conjugate; синий указывает на ядра. Желтые стрелки указывают на примеры положительных клеток. (E) Наложение панели B (IF для pH3) и панели C (IHC для помеченных dextran) показаны colocalization выражения pH3 и dextran маркировки в отдельных клетках. Желтые стрелки указывают на примеры двойных положительных клеток. (F) Отрицательный контроль (только вторичные антитела) для IHC асссев в криосекционном 48 л.с. химерного эмбриона зебры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторам нечего раскрывать.