Method Article

Использование Elegans Caenorhabditis для изучения транс- и мульти-поколения эффекты токсичных веществ

DOI:

10.3791/59367

⸱

July 29th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1College of Environmental Sciences and Engineering, Tongji University, 2Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security, 3Jiaxing Tongji Institute of Environment, 4College of Ecological Technique and Engineering, Shanghai Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транс- и несколько поколений воздействие стойких химических веществ имеют важное значение для оценки их долгосрочных последствий в окружающей среде и для здоровья человека. Мы предоставляем новые подробные методы для изучения транс- и нескольких поколений эффекты с использованием свободного проживания nematode Caenorhabditis elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Информация о токсичности химических веществ имеет важное значение в их применении и обращении с отходами. Для химических веществ при низких концентрациях долгосрочные последствия имеют очень важное значение для оценки их последствий в окружающей среде и для здоровья человека. Демонстрируя долгосрочное влияние, воздействие химических веществ на протяжении поколений в последних исследованиях дают новое понимание. Здесь мы описываем протоколы для изучения воздействия химических веществ в течение нескольких поколений с помощью свободного проживания nematode Caenorhabditis elegans. Представлены два аспекта: (1) транс-поколения (TG) и (2) нескольких поколений эффект исследований, последний из которых отделен от нескольких поколений воздействия (MGE) и нескольких поколений остаточного (MGR) исследования эффекта. Исследование эффекта TG является надежным с простой целью определить, может ли химическое воздействие на родителей привести к каким-либо остаточным последствиям для потомства. После того, как эффекты измеряются на родителей, гипохлорит натрия решения используются, чтобы убить родителей и сохранить потомство, с тем чтобы облегчить измерение эффекта на потомство. Исследование эффекта TG используется для определения того, страдают ли потомство, когда их родитель подвергается воздействию загрязняющих веществ. Исследование эффекта MGE и MGR систематически используется для определения того, может ли непрерывное воздействие поколений привести к адаптивной реакции у потомства на протяжении поколений. Тщательный пикап и передача используются для различения поколений для облегчения измерения эффекта на каждое поколение. Мы также объединили протоколы для измерения поведения движения, воспроизводства, продолжительности жизни, биохимических и изменений экспрессии генов. Некоторые примеры экспериментов также представлены, чтобы проиллюстрировать транс- и нескольких поколений эффект исследований.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Применение и утилизация отходов химических веществ в значительной степени зависит от информации об их воздействии в определенных концентрациях. Примечательно, что время является еще одним важным элементом между эффектами и концентрациями. То есть, химических веществ, особенно при низких концентрациях в реальной среде, нужно время, чтобы спровоцировать измеримые эффекты1. Поэтому исследователи устраивают разную продолжительность экспозиции в экспериментах на животных и даже охватывают весь жизненный цикл. Например, мыши подвергались воздействию никотина в течение 30, 90 или 180 дней для изучения его токсического воздействия 2. Тем не менее, продолжительность такого воздействия по-прежнему недостаточно для выяснения долгосрочных последствий загрязняющих веществ (например, стойких органических загрязнителей), которые могут длиться более поколений организмов в окружающей среде. Поэтому исследования воздействия на протяжении поколений приобретают все больше ею все больше внимания.

Есть два основных аспекта в исследованиях эффекта поколений. Первый из них является транс-поколения (TG) эффект исследования, которые могут надежно проверить ли химическое воздействие на родителей может привести к каким-либо последствиям для потомства3. Второе исследование представляет собой исследование эффекта нескольких поколений, которое носит более систематический характер с учетом как воздействия, так и остаточного воздействия. С одной стороны, эффекты воздействия нескольких поколений (MGE) используются для иллюстрации адаптивных реакций животных на долгосрочные сложные условия. С другой стороны, эффекты остатков нескольких поколений (MGR) используются для демонстрации долгосрочных остаточных последствий после воздействия, так как воздействие матери сопровождается воздействием эмбриона на первое потомство и воздействием зародышевой линии потомство, которое делает третье потомство, как первое поколение полностью из экспозиции4.

Хотя млекопитающие (например, мыши) являются модельорганизмов в исследованиях токсичности, особенно в отношении человека, их применение в изучении эффектов поколений является довольно трудоемким, дорогим и этически относительно 5. Соответственно, организмы, включая ракообразных Дафния Магна6, насекомое Drosophila melanogaster7 и зебрафиш Данио Рерио8, обеспечить альтернативный выбор. Тем не менее, эти организмы либо не имеют сходства с людьми, или требуют специального оборудования в исследованиях.

Caenorhabditis elegans - это небольшой свободно живущий нематод (примерно 1 мм в длину) с коротким жизненным циклом (примерно 84 ч при 20 градусах По кв.)9. Этот нематод разделяет многие биологические пути консервативныки для человека, и поэтому он был широко используется, чтобы проиллюстрировать последствия различных стрессов или токсикантов10. Примечательно, что 99,5% нематод являются гермафродитами, что делает эти организмы чрезвычайно подходящими для изучения эффектов поколений, например, TG эффекты тяжелых металлов и сульфонамидов3,11, MGE эффекты золотых наночастиц и тяжелых металлы12 и температура13, MGR эффекты сульфонамида14, и как MGE и MGR эффекты гамма облучения15 и линдан4. Кроме того, были найдены сопоставимые результаты между воздействием химических веществ (например, зеарабенана) на развитие и размножение мышей и C. elegans16,17, что обеспечило бы преимущество экстраполировать эффекты от этого маленького животного к человеку.

Оба TG и MG эффект исследований являются трудоемкими и нуждаются в тщательной конструкции и производительности. Примечательно, что в вышеупомянутых исследованиях существуют различия в выборе жизненных этапов, условиях воздействия и методах разделения поколений. Такие различия препятствуют прямому сопоставлению результатов и препятствуют дальнейшему толкованию результатов. Поэтому крайне важно установить единые протоколы для проведения исследований эффектов ТГ и МГ, а также обеспечить более широкую картину для выявления аналогичных моделей различных токсикантов или загрязняющих веществ в долгосрочных последствиях. Над целью настоящих протоколов продемонстрирует ясные процессы деятельности в изучении trans- и multi-generational влияния с C. elegans. Протоколы принесут пользу исследователям, которые заинтересованы в изучении долгосрочных последствий токсикантов или загрязняющих веществ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура E. coli OP50

  1. Приготовьте 1 M раствор гидроксида натрия, растворив 4 г гидроксида натрия в воде 100 мл.
  2. Подготовка лисогенного бульона (LB) среды путем растворения 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г хлорида натрия с 1 л ультрачистой воды в 1 l конической колбы. Отрегулируйте рН до 7,0 раствором гидроксида натрия.
  3. Aliquot жидкостная среда LB от step1.2 до 20 конических колб (максимально допустимый объем: 100 мл) с 50 мл среды в каждой. Обложка конические колбы с крафт овой бумагой.
  4. Стерилизовать LB жидкой среде при температуре 121 градусов по Цельсию и 0,105 MPa в течение 20 мин. Охладите среднюю LB до комнатной температуры.
  5. Пипетка 200 л от бактериальных суспензий (см. шаг 1.8) или выбрать небольшую колонию из агаров (в шаге 2.14) с помощью инкуляции петли, поместите его в СРЕДе LB.
  6. Инкубировать среду LB с встряхиванием при 150 об/мин при 37 градусах по Цельсию в течение 24-48 ч. Среда LB будет меняться от коричневой прозрачной жидкости к мутной подвеске цвета хаки.
  7. Используйте бактериальные суспензии от 80% от общего количества колб, чтобы обеспечить E. coli OP50 в качестве нематодной пищи, которая будет использоваться в шаге 2.11.
  8. Храните остальные фляги, содержащие бактериальные суспензии, в холодильнике при 4 градусах Цельсия. Пипетка 200 л LB суспензий на верхней стороне свежей среды LB (шаг 1.4) и повторить step1.6 для последующей инкубации.

2. Культура C. elegans

ПРИМЕЧАНИЕ: Культура C. elegans, использующих в соответствии с шагами от 2,1 до 2,11 на основе стандартных методов18.

  1. Растворите 22,8 г K2HPO4Х3H2O в 100 мл стерильной дистиллированной воды.
  2. Растворите 6,8 г KH2PO4 в 50 мл стерильной дистиллированной воды.
  3. Смешайте решения со ступеней 2.1 и 2.2, чтобы подготовить 1 M K2HPO4-KH2PO4 буфер (pH 6.0, 150 мл в общей сложности).
  4. Приготовьте 1,0 M MgSO 4, растворив 1,232 г MgSO4Х7H2O в 5 мл стерильной дистиллированной воды, и стерилизуйте его, фильтруя раствор через стерильный одноразовый мембранный фильтр 0,22 мкм в стерильный контейнер.
  5. Приготовьте 1 M CaCl2 путем растворения 0,554 г CaCl2 в 5 мл стерильной дистиллированной воды и стерилизуем его путем фильтрации растворов через стерильный одноразовый фильтр 0,22 мкм в стерильный контейнер.
  6. Приготовьте раствор холестерина 1 м, растворив 0,025 г холестерина в 5 мл абсолютного этанола, и стерилизуем его путем фильтрации раствора через стерильный одноразовый мембранный фильтр 0,22 мкм в стерильный контейнер.
  7. Приготовьте агар роста нематод (NGM), добавив 17 г агар-порошка, 2,5 г пептона и 3 г хлорида натрия в коническую колбу 1 л, содержащую 1 л ультрачистой воды. Добавьте 25 мл K2HPO4-KH2PO4 раствора от шага 2.3.
  8. Стерилизовать агар NGM со ступени 2.7 при 121 кв с 0,105 MPa в течение 20 минут.
  9. Охладите агар NGM примерно до 50 градусов поЦельсию, добавьте 1 мл 1 M MgSO 4, 1 M CaCl2,и 5 мг/мл холестерин-этанол раствор от шагов 2,4 до 2,6 в среду и тщательно перемешайте их.
  10. Налейте 10 мл NGM агар средний на блюдо в 100 стерильных блюд Петри (6,0 см в диаметре). Охладить среду в чашках Петри до комнатной температуры, чтобы сформировать твердый агар.
  11. Пипетка 170 л бактериальных суспензий от шага 1.7 на вышеупомянутый агар NGM с помощью стерильного наконечника. Встряхните агар NGM немного, чтобы равномерно распределить среду LB по поверхности агара NGM.
  12. Привить агар NGM с верхней стороны вверх на 37 градусов по Цельсию для 8-12 ч, чтобы сформировать бактериальный газон.
  13. Используйте большую часть агара с бактериальными газонами от шага 2.12 до культуры нематод в шаге 2.15 или 2.19.
  14. Хранить 1 или 2 агара вверх-вниз, чтобы избежать испарения воды и загрязнения в холодильниках при 4 градусах Цельсия, с тем чтобы поддерживать бактерии в загрязнении.
  15. Когда Есть менее 2000 нематод на чулок NGM агары (из предыдущих экспериментов или одаренных из других лабораторий), вырезать одну шестую часть NGM агар, который содержит C. elegans с стерильной кончиком и передать его на недавно подготовленные агары NGM с бактериальной газон (от шага 2.13). Держите NGM агары вверх-вниз в инкубаторе 22 градусов по Цельсию для последующей культуры.
  16. Когда Есть более чем 2000 нематод на чулок NGM агар, промыть нематод NGM агар с 2 мл стерильной воды в центрифуговых труб. Ввод 2 мл воды приведет к выходу примерно 1,5 мл.
  17. Разрешить нематод, чтобы поселиться в центрифуговых труб от 30 мин. Отбросьте 1 мл супернатантов путем pipetting и добавить 1 мл стерильной воды в каждой трубке для мытья гранул (т.е., нематоды).
  18. Установить вниз нематод в центрифуговых труб в течение 30 мин. Отбросьте 1 мл супернатантов путем pipetting. Добавьте 1 мл стерильной воды в каждую трубку, чтобы повторно приостановить работу нематод.
  19. Распределите суспензии нематод (всего около 1,5 мл) путем подачи 150 л на каждый новый агар NGM с бактериальным газоном (от шага 2.13), делая 8-10 новых агаров NGM в общей сложности.
  20. Держите NGM агары от шага 2.19 вверх-вверх в инкубаторе 20 градусов на ночь, а затем вверх-вниз для последующей культуры.
  21. Повторите шаг 2.15 или шаг 2.16-2.20 каждые три дня.

3. Подготовка синхронизированных яиц и личинок L3 C. elegans

  1. Флеш с gravid нематод и вновь произведенных яиц из агаров NGM в стерильные центрифуги труб, с 2 мл стерильной воды на каждом NGM агар в результате чего примерно 1,5 мл продукции.
  2. Установить вниз нематод в центрифуговых труб в течение 30 мин, а затем отбросить 85% супернатантов путем pipetting.
  3. Подготовка натрия гипохлорит решений путем растворения 0,6 г NaOH и 5 мл NaOCl (4-6% активных градиентов, см. Таблица материалов для деталей) с 25 мл воды довести NaOH до 0,5 м и NaOCl до 1%.
  4. Смешайте гранулы со ступени 3.2 (отметьте объем как V0)с 7-кратным V0 растворами гипохлорит натрия из (шаг 3.3, т.е. коэффициент объема 1:7)19.
  5. Встряхните центрифуги трубки каждые 2 мин в течение 10-15 минут, чтобы лизировать личинки и взрослых нематод; цвет нематод ныхповидной подвески превратится из мутной в прозрачный.
  6. Centrifuge труб на 700 х г в течение 3 мин при 20 градусах Цельсия, а затем отбросить супернатанты путем pipetting.
  7. Отдохните гранулы в 5 раз V0 стерильной воды, чтобы мыть возраст синхронизированные яйца. Центрифуга при 700 х г в течение 3 мин при 20 градусах Цельсия, а затем отбросить супернатанты.
  8. Повторите шаг 3,7 дважды.
  9. Добавьте 1 раз V0 стерильной воды в трубки, чтобы повторно приостановить возрастсинхронизированных яиц.
  10. Распределите яйцеклетки, проветривая 50 л на каждый новый ngM-агар с бактериальным газоном со ступени 2.13. Держите NGM агары сверху вверх в инкубаторе 20 градусов по Цельсию в течение 30 минут, что позволяет воде испаряться или быть адсорбируется бактериальной лужайке. Затем сделайте NGM агары вверх-вниз для последующей культуры. Отметьте время как время яичка (Tяичко).
  11. Подготовка K-средних путем растворения 3 г NaCl и 2,36 г KCl в 1 л воды. Стерилизовать среду при температуре 121 градусов по Цельсию и 0,105 Мпа в течение 20 минут и охладить его до комнатной температуры.
  12. Когда время достигает 36 ч после Tяйцо, нематоды достигнет L3 личинки стадии (L3 нематод)20. Промыть нематод от агаров NGM в центрифуговых труб, с 2 мл стерильной воды на каждом агаре NGM в результате чего примерно 1,5 мл продукции.
  13. После урегулирования в течение 30 минут, заменить 85% супернатантов (путем пипетки) с K-средних от 2 ч, чтобы переварить пищу в кишечнике3.
  14. Откажитесь от супернационтов. Используйте K-средний (от шага 3.11) для регулировки суспензий нематод до примерно 200 нематод на 100 Л для последующих экспериментов.

4. Использование C. elegans для исследования транс-поколения эффект

  1. Подготовьте химические растворы с 5 уровнями концентрации и одним растворителем или абсолютным контролем, т.е. 6 группами в общей сложности.
  2. Добавьте 100 юл контрольных или химических растворов с 10 скважинами в качестве репликаций в каждой группе (т.е. 60 скважин в общей сложности) в среднюю область стерильной микроплиты 96 колодцев, чтобы избежать эффектов края.
  3. Разбавить нематод подвески от шага 3.14 с K-средний от шага 3.11 в 10 раз. Добавьте 100 суспензий нематод на каждую из 60 скважин со ступени 4.2. Отметьте время как т0.
  4. Когда время достигает 24 ч после т0, подсчитайте живых и мертвых нематод в колодцах. Рассчитайте среднюю летальную концентрацию (LC50).
  5. Подготовьте серию из 5 концентраций ниже 10% от значений LC50.
  6. Добавьте 100 юл контрольных или химических растворов (от шага 4.5) с 10 скважинами в качестве репликаций в каждой группе (т.е. 60 скважин в общей сложности) в среднюю область стерильной микроплиты 96 колодцев, чтобы избежать эффектов края.
  7. Добавьте 100 кЛ K-среды, содержащей приблизительно 200 нематод L3 (от шага 3.14) к каждой из 60 скважин со ступени 4.6. Отметьте время как T0.
  8. Выполните экспозицию от 24 до 96 ч с T0.
  9. После облучения соберите нематод из пяти скважин каждой группы в центрифугные трубки мощностью 1,5 мл путем трубопроката (т.е. в общей сложности 6 труб).
  10. Установить нематод в течение 30 минут, отбросить супернатанты путем pipetting, и resuspend и мыть нематоды на дне с 1 мл стерилизованной воды.
  11. Установить нематод в течение 30 минут, отказаться от супернационтов путем pipetting и использовать нематод в нижней части для измерения индикатора (см. раздел 7) подвергаются поколения родителей отмечены как F0.
  12. Соберите, поселите и помойте (путем повторного приостановки) нематод из оставшихся пяти скважин в каждой группе в шаге 4.9 в соответствии с шагом 4.10.
  13. Установить нематод от шага 4.12 в течение 30 мин. Отбросьте супернатанты путем pipetting и добавить 100 л стерильной воды, чтобы повторно приостановить нематод. Передача нематод подвески равномерно на три недавно подготовленных NGM агары с бактериальным газоном от шага 2.13.
  14. Инкубировать нематод на 36 ч, чтобы стать gravid и выполнять возрастной синхронизации в соответствии с шагами 3.1-3.9. Инкубировать синхронизированные яйца на соответствующих агарах NGM с бактериальным газоном от шага 2.13 на 36 ч.
  15. Промыть нематод на ngM агары от шага 4.14 в шесть центрифуг труб.
  16. Установить нематод в течение 30 минут, и отбросить супернатанты путем pipetting. Отдохните и промойте гранулы 1 мл стерилизованной воды.
  17. Установить нематод в течение 30 минут, и отбросить супернатанты путем pipetting. Используйте нематоды внизу для измерения индикатора (см. раздел 7) поколения потомства, отмеченного как T1.

5. Использование C. elegans для исследования эффекта от воздействия нескольких поколений (MGE)

  1. Смешайте 99,0 мл агаров NGM (от шага 2.9) с 1 мл контрольных или химических растворов (низкие и высокие концентрации в настоящем протоколе в качестве примеров, т.е. три группы в общей сложности).
  2. Налейте примерно 10 мл ngM агар средних на блюдо от шага 5,1 в 100 стерильных блюд Петри (6,0 см в диаметре). Охладить среду в чашках Петри до комнатной температуры, чтобы сформировать твердый агар.
  3. Пипетка бактериальных суспензий на агар в зависимости от шага 2.11.
  4. Отложите верхние крышки посуды Петри и вынаните бактериальныйгазон ультрафиолетовым светом (145 кВт/см 2) в шкафу для биобезопасности в течение 15 минут.
  5. Выберите небольшую колонию, используя цикл прививки, поместите ее в среду LB от агаров в шаге 1.4. Инкубировать среде LB с встряхивания со скоростью 150 об/мин при 37 кв. м в течение 24 ч, чтобы подтвердить незначительный рост бактерий, подтверждая убийство шаг 5.4.
  6. Pipette возраст-синхронизированные яичка от шага 3.9 на агары (от шага 5.4). Отметьте начало экспозиции родительского поколения F0 и отметьте как День 0 (D0).
  7. Инкубировать агары для 3 d при 20 градусах Цельсия. Затем (т.е. на D3) используйте зрелые нематоды для измерения эффектов в F0 (см. раздел 7).
  8. Кроме того, на D3, выбрать F0 зрелых нематод на новые агары NGM (от шага 5.4) с помощью стеклянного стержня, конец которого оснащен антропогенным проводом волокна согнуты в кольцо.
  9. На D4, выбрать и отказаться от зрелых F0 нематод от NGM агаров. Отметьте нематод от вылупившихся потомков в пределах этих 24 ч (от D3 до D4) в качестве F1, чтобы испытать экспозицию второго поколения.
  10. На D6 измеряйте индексы (см. раздел 7) зрелых нематод F1, которые испытывали воздействие в течение 3 дней.
  11. На D9, повторить шаги 5.8-5.10, использовать F1 нематод для воспроизведения F2 червей и измерения воздействия на F2 нематод.
  12. На D12, повторить шаг 5.11, использовать F2 нематод для воспроизведения F3 червей и измерения воздействия на F3 нематод. Таким же образом, воспроизвести потомство и измерить влияние MGE на nth поколения потомства (Fn).

6. Используйте C. elegans для исследования эффекта нескольких поколений (MGR)

  1. Повторите шаги 5.1-5.7. На D3, выбрать F0 зрелых нематод на новые агары NGM без добавления химических веществ (от шага 2.13).
  2. На D4, выбрать и отказаться от зрелых нематод F0. Отметьте нематод нематод, вылупившихся потомками, в пределах этих 24 ч как нематоды T1.
  3. На D6 измеряйте индексы (см. раздел 7) зрелых нематод T1, которые выросли в течение 3 дней.
  4. На D9, повторить шаги 6.2-6.3, использовать T1 нематод для воспроизведения T2 нематод и измерения воздействия в T1 нематод.
  5. На D12, повторить шаги 6.4, использовать T2 нематод для воспроизведения T3 нематод и измерения эффектов в T2 нематод. Таким же образом, воспроизвести потомство и измерить воздействие MGR на nth потомства поколения (Tn) нематод F0, или nth потомство (Tn') нематод Fn от шага 5.12.

7. Показатели измерения

  1. Измерьте поведение передвижения.
    1. Промыть нематод от ангаров NGM с помощью стерильной воды и собирать их в центрифуговых труб. Установить нематод в течение 30 минут, отбросить супернатанты и использовать нематод в гранулы для измерения эффекта.
    2. Приостановите нематод в гранулах с 1 мл стерильной воды и пипетка их на NGM агары без бактериального газона от шага 2.10.
    3. Используйте рассекающий микроскоп, чтобы забить нематод для (количество) частоты изгиба тела (BBF), которая относится к временам задняя лампа глоткса меняет направление вдоль вертикального направления пути перемещения в течение 60-х годов интервал.
    4. Используйте рассекающий микроскоп, чтобы набрать разворотдвижения (RM), который относится к временам, когда направление движения меняется более чем на 90 градусов, включая обратные повороты и поворот Омега (OT) в интервале 60 с. OT относится к движению, когда голова нематод касается или почти касается его хвоста, делая форму нематод, как греческая буква Омега .
      ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере 6 нематод были рассмотрены для каждого лечения в каждой экспериментальной репликации.
Примеры влияния MGE (F0 до F3) на размножение и продолжительность жизни с 3 группами (один контроль и два лечения воздействия).
ДеньНомер NGM agar для исследования MGEОбъяснение
Срок службыВоспроизведение
0.0030 (Экспозиция F0)10 репликдляет для каждой группы, помечены как F0-1-1-0 на F0-3-10-0, с последней цифрой, чтобы показать дни выживания.
130 (F0 выжить 1 г)F0-1-1-0 к F0-3-10-0 должны быть изменены на F0-1-1-1 на F0-3-10-1.
230 (F0 выжить 2 d)F0-1-1-1 до F0-3-10-1 следует изменить на F0-1-1-2 на F0-3-10-2.
Нет необходимости передавать F0 нематод до 3 d.
330 (F0 выжить 3 г, очищены после передачи нематод и сбора)После 3 d, F0 нематод созрели и 36 новых агаров NGM (с 2 нематод на каждом агаре) используются для наблюдения за их выживанием и размножением.
36 (F0-1-1-3 до F0-3-12-3)Предварительные эксперименты должны быть проведены, чтобы организовать количество F0 нематод, гарантируя, по крайней мере 200 потомство для последующих нескольких поколений операций.
Примечательно, что, если mGR эффекты изучены, F0 нематод должны быть переданы на прозрачные агары NGM без химического воздействия, и следует отметить, как T1 начала.
Большинство нематод F0 собираются для измерения химических и генетических показателей, а 30 агаров f0 очищаются.
436 (F0-1-1-4 до F0-3-12-4)36 (F1-1-1-1 - F1-3-12-1)Измерение продолжительности жизни и воспроизводства требует переноса каждый день.
Родитель нематод на F0-1-1-3 на F0-3-12-3 выбираются на новые агары NGM отмечены как F0-1-1-4 на F0-3-12-4.
Оставшиеся потомки нематод (т.е. F1 в MGE, или T1 в MGR) в F0-1-1-3 до F0-3-12-3 агары выросли на 1 г, и маркеры изменены на F1-1-1-1 на F1-3-12-1. Эти агары также используются для мониторинга срока службы F1 с ежедневной передачей.
536 (F0-1-1-5 до F0-3-12-5)36 (F1-1-1-2 - F1-3-12-2)Нематоды на F1-1-1-1 до F1-3-12-1 агары выросли на 2 г и стали легко наблюдаемыми и нематоды учитываются, и маркеры меняются на F1-1-1-2 на F1-3-12-2.
36 (F0-1-1-4 до F0-3-12-4)Потомство нематод в F0-1-1-4 до F0-3-12-4 агары выросли за 1 г.
636 (F0-1-1-6 до F0-3-12-6)36 (F0-1-1-4 до F0-3-12-4, очищены после подсчета)Нематоды на F1-1-1-2 в F1-3-12-2 агары выросли на 3 d и маркеры изменены на F1-1-1-3 на F1-3-12-3. Примечательно, f1 нематоды начинают воспроизводить F2 в этот день, F1 нематоды должны быть переданы на новые NGM агары решений F2-1-1-0 на F1-3-12-0. Для исследований MGR, T2 начать сегодня.
36 (F1-1-1-3 до F1-3-12-3)36 (F0-1-1-5 до F0-3-12-5)Это может быть отложено от химического воздействия, и поэтому гибкие изменения должны быть выполнены в каждом эксперименте, чтобы обеспечить достаточное количество нематод для последующих поколений.
36 (F2-1-1-0 до F1-3-12-0)Потомство нематод на F0-1-1-4 до F0-3-12-4 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
Потомство нематод на F0-1-1-5 до F0-3-12-5 агары выросли за 1 г.
7 (г.36 (F0-1-1-7 до F0-3-12-7)36 (F0-1-1-5 до F0-3-12-5, очищены после подсчета)Потомство нематод на F0-1-1-5 до F0-3-12-5 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-4 до F1-3-12-4)36 (F0-1-1-6 до F0-3-12-6)Общий номер нематод в F1-1-1 до F1-3-12-1 агары, F0-1-1-4 f0-3-12-4 агары и F0-1-1-5 f0-3-12-5 используются для расчета первоначального воспроизведения F0.
36 (F2-1-1-1 до F2-3-12-1)Потомство нематод на F0-1-1-6 до F0-3-12-6 агары выросли за 1 г.
Нематоды F2 на F2-1-1-0 до F1-3-12-0 выросли на 1 d и их маркеры изменены на F2-1-1-1 на F2-3-12-1.
836 (F0-1-1-8 до F0-3-12-8)36 (F0-1-1-6 до F0-3-12-6, очищены после подсчета)Потомство нематод на F0-1-1-6 до F0-3-12-6 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-5 до F1-3-12-5)36 (F0-1-1-7 до F0-3-12-7)Потомство нематод F0 на F0-1-1-7 до F0-3-12-7 агары выросли за 1 г.
36 (F2-1-1-2 до F2-3-12-2)36 (F1-1-1-4 до F1-3-12-4)Потомство нематод F1 на F1-1-1-4 до F1-3-12-4 агары выросли за 1 г.
36 (F2-1-1-1 на F2-3-12-1, изменен на F2-1-1-2 на F2-3-12-2 после подсчета)Нематоды F2 на F2-1-1-1 до F2-3-12-1 выросли за 2 г, нематоды подсчитываются и их маркеры изменены на F2-1-1-2 на F2-3-12-2.
9 До 936 (F0-1-1-9 до F0-3-12-9)36 (F0-1-1-7 до F0-3-12-7, очищены после подсчета)Потомство нематод F0 на F0-1-1-7 до F0-3-12-7 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-6 до F1-3-12-6)36 (F1-1-1-4 до F1-3-12-4, очищенпосле после подсчета)Потомство нематод F1 на F1-1-1-4 до F1-3-12-4 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F2-1-1-3 до F2-3-12-3)36 (F0-1-1-8 до F0-3-12-8)Потомство нематод F0 на F0-1-1-8 до F0-3-12-8 агары выросли за 1 г.
36 (F3-1-1-0 до F3-3-12-0)36 (F1-1-1-5 до F1-3-12-5)Потомство нематод F1 на F1-1-1-5 до F1-3-12-5 агары выросли за 1 г.
Нематоды F2 на F2-1-1-2 до F2-3-12-2 выросли в течение 3 дней, и их маркеры изменены на F2-1-1-3 на F2-3-12-3. F2 nematodes начинают размножаться сегодня, и они передаются 36 новых gars NGM необходимы и отмечены как F3-1-1-0 на F3-3-12-0. Для исследований MGR, T3 начать сегодня.
10 Лет36 (F0-1-1-10 до F0-3-12-10)36 (F0-1-1-8 до F0-3-12-8, очищены после подсчета)Потомство нематод F0 на F0-1-1-8 до F0-3-12-8 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-7 до F1-3-12-7)36 (F1-1-1-5 к F1-3-12-5, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F1 на F1-1-1-5 до F1-3-12-5 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F2-1-1-4 до F2-3-12-4)36 (F0-1-1-9 до F0-3-12-9)Общее число нематод в F2-1-1-1 до F2-3-12-1, F1-1-1-4 до F1-3-12-4 агаров и F1-1-1-5 к F1-3-12-5 используются для расчета первоначального воспроизведения F1.
36 (F3-1-1-1 до F3-3-12-1)36 (F1-1-1-6 до F1-3-12-6)Потомство нематод F0 на F0-1-1-9 до F0-3-12-9 агары выросли за 1 г.
Потомство нематод F1 на F1-1-1-6 до F1-3-12-6 агары выросли за 1 г.
Потомство нематод на F3-1-1-0 к F3-3-12-0 агары выросли за 1 г и маркеры изменены на F3-1-1-1 на F3-3-12-1.
Примечательно, что репродукция нематод F0 значительно снизится после первых нескольких дней. Таким образом, передача нематод строго не требуется, чтобы быть ежедневно после D10 и может быть выполнена каждые 2 дня. Тем не менее, выживание по-прежнему требует ежедневного наблюдения.
То же правило действует и в F1 (T1, T1'), F2 (T2, T2') и F3 (T3, T3').
11 Год36 (F0-1-1-11 до F0-3-12-11)36 (F0-1-1-9 до F0-3-12-9, очищены после подсчета)Потомство нематод F0 на F0-1-1-9 до F0-3-12-9 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-8 до F1-3-12-8)36 (F1-1-1-6 до F1-3-12-6, очищены после подсчета)Потомство нематод F1 на F1-1-1-6 до F1-3-12-6 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F2-1-1-5 до F2-3-12-5)36 (F0-1-1-10 до F0-3-12-10)Потомство нематод F0 на F0-1-1-10 до F0-3-12-10 агары выросли за 1 г.
36 (F3-1-1-2 до F3-3-12-2)36 (F1-1-1-7 до F1-3-12-7)Потомство нематод F1 на F1-1-1-7 до F1-3-12-7 агары выросли за 1 г.
36 (F2-1-1-4 до F2-3-12-4)Потомство нематод F2 на F2-1-1-4 до F2-3-12-4 агары выросли за 1 г.
36 (F3-1-1-1 на F3-3-12-1, изменен на F3-1-1-2 на F3-3-12-2 после подсчета)Нематоды на F3-1-1-1 до F3-3-12-1 агары выросли на 2 г, нематоды подсчитываются и маркеры изменены на F3-1-1-2 на F3-3-12-2.
12 Лет36 (F0-1-1-12 до F0-3-12-12)36 (F0-1-1-10 до F0-3-12-10, очищены после подсчета)Потомство нематод F0 на F0-1-1-10 до F0-3-12-10 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-9 до F1-3-12-9)36 (F1-1-1-7 до F1-3-12-7, очищены после подсчета)Потомство нематод F1 на F1-1-1-7 до F1-3-12-7 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F2-1-1-6 до F2-3-12-6)36 (F2-1-1-4 до F2-3-12-4, очищенпосле после подсчета)Потомство нематод F2 на F2-1-1-4 до F2-3-12-4 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-3 до F3-3-12-3)36 (F0-1-1-11 до F0-3-12-11)Потомство нематод F0 на F0-1-1-11 до F0-3-12-11 агары выросли за 1 г.
36 (F4-1-1-0 до F4-3-12-0)36 (F1-1-1-8 до F1-3-12-8)Потомство нематод F1 на F1-1-1-8 до F1-3-12-8 агары выросли за 1 г.
36 (F2-1-1-5 до F2-3-12-5)Потомство нематод F2 на F2-1-1-5 до F2-3-12-5 агары выросли за 1 г.
Нематоды на F3-1-1-2 до F3-3-12-2 агары выросли на 3 d и маркеры изменены на F3-1-1-3 на F3-3-12-3. F3 nematodes начинают размножаться сегодня, и они передаются 36 новых GAR NGM необходимы и отмечены как F4-1-1-0 на F4-3-12-0. Для исследований MGR, потомство F3 (т.е., T1') начать сегодня.
13 Год36 (F0-1-1-13 до F0-3-12-13)36 (F0-1-1-11 до F0-3-12-11, очищены после подсчета)Потомство нематод F0 на F0-1-1-11 до F0-3-12-11 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-10 до F1-3-12-10)36 (F1-1-1-8 до F1-3-12-8, очищенпосле после подсчета)Потомство нематод F1 на F1-1-1-8 до F1-3-12-8 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F2-1-1-7 до F2-3-12-9)36 (F2-1-1-5 к F2-3-12-5, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F2 на F2-1-1-5 до F2-3-12-5 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-4 до F3-3-12-4)36 (F0-1-1-12 до F0-3-12-12)Общее число нематод в F3-1-1 до F3-3-12-1, F2-1-1-4 до F2-3-12-4 агаров и F2-1-1-5 к F2-3-12-5 используются для расчета первоначального воспроизводства F2.
36 (F4-1-1-1 до F4-3-12-1)36 (F1-1-1-9 до F1-3-12-9)Потомство нематод F0 на F0-1-1-12 до F0-3-12-12 агары выросли за 1 г.
36 (F2-1-1-6 до F2-3-12-6)Потомство нематод F1 на F1-1-1-9 до F1-3-12-9 агары выросли за 1 г.
Потомство нематод F2 на F2-1-1-6 до F2-3-12-6 агары выросли за 1 г.
Потомство нематод F3 на F4-1-1-0 до F4-3-12-0 выросли на 1 г, а маркеры изменены на F4-1-1-1 на F4-3-12-1.
14 Год36 (F0-1-1-14 до F0-3-12-14)36 (F0-1-1-12 до F0-3-12-12, очищены после подсчета)Потомство нематод F0 на F0-1-1-12 до F0-3-12-12 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-11 - F1-3-12-11)36 (F1-1-1-9 до F1-3-12-9, очищенпосле после подсчета)Потомство нематод F1 на F1-1-1-9 до F1-3-12-9 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F2-1-1-8 до F2-3-12-8)36 (F2-1-1-6 к F2-3-12-6, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F2 на F2-1-1-6 до F2-3-12-6 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-5 до F3-3-12-5)36 (F4-1-1-1 к F4-3-12-1, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F3 на F4-1-1-1 к F4-3-12-1 выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод. Для исследований MGR, T1' нематод выросли на 2 d, и начнет воспроизводить T2' на следующий день (D15), и T2' начнет воспроизводить T3' на D18. Продолжительность жизни дикого типа C. elegans, например, 15 дней. Затем, окончание срока службы T3 будет на D33.
36 (F0-1-1-13 до F0-3-12-13)Потомство нематод F0 на F0-1-1-13 до F0-3-12-13 агары выросли за 1 г.
36 (F1-1-1-10 до F1-3-12-10)Потомство нематод F1 на F1-1-1-10 до F1-3-12-10 агары выросли за 1 г.
36 (F2-1-1-7 до F2-3-12-7)Потомство нематод F2 на F2-1-1-7 до F2-3-12-7 агары выросли за 1 г.
36 (F3-1-1-4 до F3-3-12-4)Потомство нематод F3 на F3-1-1-4 до F2-3-12-4 агары выросли за 1 г.
15 лет36 (F0-1-1-15 до F0-3-12-15)36 (F0-1-1-13 до F0-3-12-13, очищены после подсчета)Потомство нематод F0 на F0-1-1-13 до F0-3-12-13 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-12 до F1-3-12-12)36 (F1-1-1-10 до F1-3-12-10, очищены после подсчета)Потомство нематод F1 на F1-1-1-10 до F1-3-12-10 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F2-1-1-9 до F2-3-12-9)36 (F2-1-1-7 до F2-3-12-7, очищены после подсчета)Потомство нематод F2 на F2-1-1-7 до F2-3-12-7 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-6 до F3-3-12-6)36 (F3-1-1-4 до F3-3-12-4, очищены после подсчета)Потомство нематод F3 на F3-1-1-4 к F3-3-12-4 агары выросли на 2d, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F0-1-1-14 до F0-3-12-14)Потомство нематод F0 на F0-1-1-14 до F0-3-12-14 агары выросли за 1 г.
36 (F1-1-1-11 - F1-3-12-11)Потомство нематод F1 на F1-1-1-11 до F1-3-12-11 агары выросли за 1 г.
36 (F2-1-1-8 до F2-3-12-8)Потомство нематод F2 на F2-1-1-8 до F2-3-12-8 агары выросли за 1 г.
36 (F3-1-1-5 до F3-3-12-5)Потомство нематод F3 на F3-1-1-5 до F2-3-12-5 агары выросли за 1 г.
16 Год36 (F0-1-1-15 до F0-3-12-15, более)36 (F0-1-1-14 до F0-3-12-14, очищены после подсчета)Продолжительность жизни дикого типа C. elegans, например, 15 дней. Таким образом, F0 должны были все умерли до дня 16 после воздействия.
36 (F1-1-1-13 до F1-3-12-13)36 (F1-1-1-11 к F1-3-12-11, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F0 на F0-1-1-14 до F0-3-12-14 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F2-1-1-10 до F2-3-12-10)36 (F2-1-1-8 до F2-3-12-8, очищенпосле после подсчета)Потомство нематод F1 на F1-1-1-11 до F1-3-12-11 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-7 до F3-3-12-7)36 (F3-1-1-5 к F3-3-12-5, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F2 на F2-1-1-8 до F2-3-12-8 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F0-1-1-15 до F0-3-12-15)Потомство нематод F3 на F3-1-1-5 к F3-3-12-5 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-12 до F1-3-12-12)Общее число нематод в F4-1-1-1 до F4-3-12-1, F3-1-1-4 до F3-3-12-4 агаров и F3-1-1-5 к F3-3-12-5 используются для расчета первоначального воспроизводства F3.
36 (F2-1-1-9 до F2-3-12-9)Потомство нематод F0 на F0-1-1-15 до F0-3-12-15 агары выросли за 1 г.
36 (F3-1-1-6 до F3-3-12-6)Потомство нематод F1 на F1-1-1-12 до F1-3-12-12 агары выросли за 1 г.
Потомство нематод F2 на F2-1-1-9 до F2-3-12-9 агары выросли за 1 г.
Потомство нематод F3 на F3-1-1-6 до F2-3-12-6 агары выросли за 1 г.
17 Лет36 (F1-1-1-14 до F1-3-12-14)36 (F0-1-1-15 к F0-3-12-15, очищено после подсчитано, сверх)Потомство нематод F0 на F0-1-1-15 до F0-3-12-15 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод. Потомство F0 больше не будет.
36 (F2-1-1-11 до F2-3-12-11)36 (F1-1-1-12 до F1-3-12-12, очищены после подсчета)Потомство нематод F1 на F1-1-1-12 к F1-3-12-12 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-8 до F3-3-12-8)36 (F2-1-1-9 до F2-3-12-9, очищенпосле после подсчета)Потомство нематод F2 на F2-1-1-9 до F2-3-12-9 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-6 к F3-3-12-6, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F3 на F3-1-1-6 к F3-3-12-6 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-13 до F1-3-12-13)Потомство нематод F1 на F1-1-1-13 до F1-3-12-13 агары выросли за 1 г.
36 (F2-1-1-10 до F2-3-12-10)Потомство нематод F2 на F2-1-1-10 до F2-3-12-10 агары выросли за 1 г.
36 (F3-1-1-7 до F3-3-12-7)Потомство нематод F3 на F3-1-1-7 до F2-3-12-7 агары выросли за 1 г.
18 лет36 (F1-1-1-15 до F1-3-12-15)36 (F1-1-1-13 к F1-3-12-13, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F1 на F1-1-1-13 до F1-3-12-13 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F2-1-1-12 до F2-3-12-12)36 (F2-1-1-10 к F2-3-12-10, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F2 на F2-1-1-10 до F2-3-12-10 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-9 до F3-3-12-9)36 (F3-1-1-7 до F3-3-12-7, очищены после подсчета)Потомство нематод F3 на F3-1-1-7 f3-3-12-7 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-14 до F1-3-12-14)Потомство нематод F1 на F1-1-1-14 до F1-3-12-14 агары выросли за 1 г.
36 (F2-1-1-11 до F2-3-12-11)Потомство нематод F2 на F2-1-1-11 до F2-3-12-11 агары выросли за 1 г.
36 (F3-1-1-8 до F3-3-12-8)Потомство нематод F3 на F3-1-1-8 до F2-3-12-8 агары выросли за 1 г.
В исследованиях MGR, T2' начнет воспроизводить T3' сегодня. Продолжительность жизни дикого типа C. elegans, например, 15 дней. Затем, окончание срока службы T3 будет на D33.
19 лет36 (F1-1-1-15 до F1-3-12-15, более)36 (F1-1-1-14 до F1-3-12-14, очищены после подсчета)Потомство нематод F1 на F1-1-1-14 до F1-3-12-14 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F2-1-1-13 до F2-3-12-13)36 (F2-1-1-11 к F2-3-12-11, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F2 на F2-1-1-11 до F2-3-12-11 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-10 до F3-3-12-10)36 (F3-1-1-8 до F3-3-12-8, очищены после подсчета)Потомство нематод F3 на F3-1-1-8 к F3-3-12-8 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F1-1-1-15 до F1-3-12-15)Потомство нематод F1 на F1-1-1-15 до F1-3-12-15 агары выросли за 1 г.
36 (F2-1-1-12 до F2-3-12-12)Потомство нематод F2 на F2-1-1-12 до F2-3-12-12 агары выросли за 1 г.
36 (F3-1-1-9 до F3-3-12-9)Потомство нематод F3 на F3-1-1-9 до F2-3-12-9 агары выросли за 1 г.
2036 (F2-1-1-14 до F2-3-12-14)36 (F1-1-1-15 к F1-3-12-15, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F1 на F1-1-1-14 до F1-3-12-14 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод. Там не будет больше потомства F1.
36 (F3-1-1-11 до F3-3-12-11)36 (F2-1-1-12 к F2-3-12-12, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F2 на F2-1-1-12 к F2-3-12-12 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-9 до F3-3-12-9, очищены после подсчета)Потомство нематод F3 на F3-1-1-9 к F3-3-12-9 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F2-1-1-13 до F2-3-12-13)Потомство нематод F2 на F2-1-1-13 до F2-3-12-13 агары выросли за 1 г.
36 (F3-1-1-10 до F3-3-12-10)Потомство нематод F3 на F3-1-1-10 до F2-3-12-10 агары выросли за 1 г.
21 год36 (F2-1-1-15 до F2-3-12-15)36 (F2-1-1-13 к F2-3-12-13, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F2 на F2-1-1-13 к F2-3-12-13 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-12 до F3-3-12-12)36 (F3-1-1-10 к F3-3-12-10, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F3 на F3-1-1-10 до F3-3-12-10 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F2-1-1-14 до F2-3-12-14)Потомство нематод F2 на F2-1-1-14 до F2-3-12-14 агары выросли за 1 г.
36 (F3-1-1-11 до F3-3-12-11)Потомство нематод F3 на F3-1-1-11 до F2-3-12-11 агары выросли за 1 г.
22 Г.36 (F2-1-1-15 до F2-3-12-15, более)36 (F2-1-1-14 к F2-3-12-14, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F2 на F2-1-1-14 до F2-3-12-14 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-13 до F3-3-12-13)36 (F3-1-1-11 к F3-3-12-11, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F3 на F3-1-1-11 к F3-3-12-11 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-12 до F3-3-12-12)Потомство нематод F3 на F3-1-1-12 до F2-3-12-12 агары выросли за 1 г.
2336 (F3-1-1-14 до F3-3-12-14)36 (F2-1-1-15 к F2-3-12-15, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F2 на F2-1-1-15 до F2-3-12-15 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод. Потомство F2 больше не будет.
36 (F3-1-1-12 к F3-3-12-12, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F3 на F3-1-1-12 к F3-3-12-12 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-13 до F3-3-12-13)Потомство нематод F3 на F3-1-1-13 до F2-3-12-13 агары выросли за 1 г.
2436 (F3-1-1-15 до F3-3-12-15)36 (F3-1-1-13 к F3-3-12-13, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F3 на F3-1-1-13 к F3-3-12-13 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-14 до F3-3-12-14)Потомство нематод F3 на F3-1-1-14 до F2-3-12-14 агары выросли за 1 г.
2536 (F3-1-1-15 до F3-3-12-15, более)36 (F3-1-1-14 к F3-3-12-14, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F3 на F3-1-1-14 к F3-3-12-14 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
36 (F3-1-1-15 до F3-3-12-15)Потомство нематод F3 на F3-1-1-15 до F2-3-12-15 агары выросли за 1 г.
2636 (F3-1-1-15 к F3-3-12-15, очищено после подсчитанного)Потомство нематод F3 на F3-1-1-15 к F3-3-12-15 агары выросли на 2 г, и агары очищаются после подсчета нематод.
Примечательно, что в исследованиях MGR, первое неразоблаченное потомство F3 (т.е., T3') будет рождаться на D18. Продолжительность жизни дикого типа C. elegans, например, 15 дней. Затем, окончание срока службы T3 будет на D33.
Оба MGE и MGR исследования будут охватывать больше дней, когда срок службы нематод больше.

Таблица 1: Список маркеров и их определения.

  1. Измерьте размножение и продолжительность жизни в исследованиях эффекта MGE.
    1. На D0 повторите шаг 5.6. Отметьте агары (3 группы с 10 репликациями в каждой), как Fx-a-b-c, где x относится к номеру поколения, a относится к группе номер (1 для контроля, 2 для низкой концентрации и 3 для высокой концентрации ); b относится к репликации от 1 до 10; и c относится к продолжительности экспозиции (0 указывает на начало). Для D0, отмечает агары, как F0-1-1-0 к F0-3-10-0. Читатели могут обратиться к таблице 1 для получения подробной информации.
    2. На D1, проверить рост нематод на агары, и изменить маркеры с F0-1-1-0 на F0-3-10-0 f0-1-1-1 до F0-3-10-1.
    3. На D2, проверить рост нематод на агары, и изменить маркеры F0-1-1-2 на F0-3-10-2.
    4. На D3, выбрать 24 F0 нематод из каждой группы на 12 новых агаров NGM с двумя NGM агар от шага 5.4. Отметьте агары как F0-1-1-3 до F0-3-12-3.
    5. На D4, передача двух родителей нематод от F0-1-1-3 на F0-3-12-3, выбирая на новые агары NGM от шага 5.4. Отметьте новые агары NGM как F0-1-1-4 до F0-3-12-4. Измените маркеры F0-1-1-3 на F0-3-12-3 на F1-1-1-1 на F1-3-12-1, чтобы представить потомство F0 (т.е. F1) в течение первого дня с начала воспроизведения F0.
    6. На D5, используйте расчленяющий микроскоп для подсчета нематод на F1-1-1-1 до F1-3-12-1 агары, где нематоды выросли 2 дней. Разрешить F1-1-1-1 f1-3-12-1 агары воспроизвести F2 для последующих поколений.
    7. Передача двух родителей нематод от F0-1-1-4 на F0-3-12-4 агары, выбирая на новые агары NGM от шага 5.4. Марк NGM агары, как F0-1-1-5 f0-3-12-5. Измените отметки F0-1-1-4 на F0-3-12-4 на F1-1-1-2 на F1-3-12-2, чтобы представить потомство F0 (т.е. F1) в течение второго дня с начала воспроизведения F0.
    8. На D6, рассчитывать нематод на F1-1-1-2 f1-3-12-2 агары. Перенесите родительские нематоды с F0-1-1-5 на F0-3-12-5 агары на F0-1-1-6 на F0-3-12-6. Измените маркеры F0-1-1-5 на F0-3-12-5 на F1-1-1-3 на F1-3-12-3, чтобы представить потомство F0 (т.е. F1) в течение третьего дня с начала воспроизведения F0.
    9. Нематоды на F1-1-1-1 до F1-3-12-1 агары выросли в течение 3 дней. Используйте их для воспроизведения F2 в последующих исследованиях эффекта MGE. Таким же образом, используйте F2 нематод для воспроизведения F3, чтобы продолжить исследования эффекта MGE.
    10. Таким же образом, передача двух родителей nematodes ежедневно и рассчитывать потомство нематоды на следующий день, пока родитель нематоды в 6 NGM агаров (т.е., половина от общего числа агаров в каждой группе) остановить размножение.
    11. Рассчитайте общее число потомства в течение всей продолжительности воспроизводства в качестве общего размера выводка. Используйте номер потомства в течение первых 3 дней, чтобы представить первоначальное воспроизведение родителей.
    12. Используйте день, когда родительский репродукция нематод останавливается в 6 агарах NGM, чтобы оценить продолжительность репродукции. Используйте те дни, когда каждый родитель выжил в качестве своей продолжительности жизни.
    13. Получить начальное воспроизведение, продолжительность воспроизведения, общий размер выводка и срок службы F1 так же, как это делается для F0. Аналогичным образом, повторяя вышеупомянутую процедуру, можно получить информацию о воспроизводстве и продолжительности жизни F2 (to Fn).
  2. Измерьте размножение и продолжительность жизни в исследованиях эффекта MGR.
    1. Выполните шаг 7.2.4 с агарами NGM от шага 5.4 измененного к тем от шага 2.13.
  3. Измерение биохимических индексов.
    1. Промыть нематод от ангаров NGM с стерильной водой и собрать их в центрифуговых труб. Установить нематод в течение 30 минут и отказаться от супернатантов. Используйте нематод в гранулах для измерения эффекта.
    2. Добавьте 1 мл ледяного фосфата буферизированного солья (PBS, pH 7.0) в нематод (гранулы) в 1,5 мл центрифуговых труб для мытья нематод.
    3. Центрифуга при 10 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах по Цельсию, и осторожно отбрасывайте супернацианты с помощью пипетки.
    4. Прикрепите замораживание гранул жидким азотом или в морозильной камере -80 градусов.
    5. Гомогенизировать гранулы с помощью пестиков в ледяной ванне. Используйте 200 л ледяных PBS для мытья остаточных жидкостей на пестик в центрифуге трубки, прежде чем вывезти пестик.
    6. Центрифуга на 10000 х г в течение 5 минут при 4 кв с раз, и использовать супернационты для определения деятельности или количества биохимических веществ с коммерческими комплектами (см. Таблица материалов для деталей).
    7. Измерьте количество общего белка (TP) в образцах и используйте результаты в качестве знаменателя в представлении других биохимических показателей, так что разница между числами нематод среди образцов может быть устранена.
  4. Измерьте экспрессию генов.
    1. Повторите шаги от 7.4.1 до 7.4.4. Изолировать общую РНК из образцов нематод с помощью коммерческого комплекта извлечения РНК (см. Таблицу Материалов для деталей) в соответствии с инструкциями производителя21.
    2. Используйте РНК для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя21.
    3. Проанализируйте образец кДНК в цепочке полимеразы в режиме реального времени (RT-PCR) с использованием комплектов SYBR Green RT-PCR в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблица материалов)21.
    4. Количественно относительные уровни экспрессии выбранных генов методом 2-ЗКТ 22и рассматривать уровни экспрессии gdp-2 (или другого эталонного гена) в качестве отрицательной ссылки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протоколы для изучения воздействия химических веществ на протяжении поколений с использованием C. elegans в транс-поколения (TG), многопоколенческих воздействия (MGE) и нескольких поколений остаточного (MGR) эффект исследований. В качестве примеров приводятся результаты наших собственных исследований. Одно исследование представляет TG эффекты тяжелых металлов на поведение передвижения3. Два других исследования представляют MGE и MGR эффе...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для успешного выполнения описанного протокола следует принять во внимание следующие предложения. Выполняйте общие экспериментальные операции в стерильной среде. Неправильная эксплуатация может привести к загрязнению штаммов кишечной палочки, например, грибков и клещев может препятствовать нормальному росту C. elegans и, следовательно, повлиять на экспериментальные результаты. В разделе, описывающем культивирование C. elegans, наблюдайте за шкалой роста C. elegans на агарах NGM невооруж...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарны за финансовую поддержку со стороны Национального научно-технического проекта по борьбе с загрязнением и очисткой воды (2017-X07201004) и Международной программы научно-технического сотрудничества Китая (No 2016YFE0123700).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Агаровый порошокOXOID, Thermo Fisher Scientific, Великобритания9002-18-0
79nnHT Быстрая система ПЦР в реальном времени  Прикладные биосистемы 
96-луночный стерильный микропланшетCostar? Corning? Американский
автоклавный стерилизаторTomy, Tomy Digital Biology, Япония
кабинет биобезопасностиLongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, Китай
хлорид кальцияSinopharm chemical reagent company Ltd, Китайцентрифуга 10043-52-4
  5417REppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Германия
Центрифужные пробиркиAxygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, Америка
холестеринSinopharm химический реагент компания Ltd, Китай57-88-5
ДиметилсульфоксидVETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, Америка67-68-5
динатрия гидрофосфатSinopharm химический реагент компания Ltd, Китай7558-79-4
этанолSinopharm chemical reagent company Ltd, Китай64-17-5
ФильтрThermo, Thermo Fisher Scientific, Америка
инкубаторYiHeng17, Шанхай yiheng scientific instrument co. Ltd, Китай
контур
инокуляцииK2HPO4• 3H2OSinopharm chemical reagent company Ltd, Китай16788-57-1
крафт-бумага
Mcroplate ReaderBoitek, Boten apparatus co. Ltd, Америка
MgSO4• 7H2OSinopharm chemical reagent company Ltd, Китай10034-99-8
Микроскопы XTL-BM-9TDBM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, Китай 
Чашки
ПипеткаEppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Германия
Хлористый калийSinopharm химический реагент компания Ltd, Китай7447-40-7
дигидрофосфат калияSinopharm химический реагент компания Ltd, Китай7778-77-0
Qiagen RNeasy наборыQiagen Inc., Валенсия, Калифорния, США
QuantiTect SYBR Green RT-PCR наборыQiagen Inc., Валенсия, Калифорния, США
RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit Thermo Scientific, Уилмингтон, DE, США
хлорид натрияSinopharm chemical reagent company Ltd, Китай7647-14-5
гидроксиднатрияSinopharm chemical reagent company Ltd, Китай1310-73-2
раствор гипохлорита натрияAladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, Китай7681-52-9
триптонOXOID, Thermo Fisher Scientific, Великобритания73049-73-7
дрожжевой экстрактOXOID, Thermo Fisher Scientific, Великобритания119-44-8
Петри

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
  2. Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
  3. Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
  4. Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
  5. Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
  6. Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
  7. Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966(2017).
  8. Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
  9. Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295(2016).
  10. Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
  11. Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
  12. Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
  13. Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320(2017).
  14. Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
  15. Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
  16. Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
  17. Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
  20. Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
  21. Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426(2018).
  22. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  23. Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
  24. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
  25. Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caenorhabditis elegansTrans Generational EffectsMulti Generational EffectsAge SynchronizationSodium Hypochlorite SolutionNGM Agar CultureLocomotion Behavior AnalysisReproduction Lifespan MeasurementBiochemical Gene ExpressionEpigenetic Signals

Related Articles