Method Article

Одномолекулярная слежение за микроскопией - инструмент для определения диффузивных состояний цитосолильных молекул

DOI:

10.3791/59387

⸱

September 5th, 2019

 , 
1Department of Chemistry, University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics, University of Virginia School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D одномолекулярная микроскопия локализации используется для зондирования пространственных положений и траекторий движения флуоресцентно обозначенных белков в живых бактериальных клетках. Экспериментальный протокол анализа данных, описанный в данном документе, определяет распространенное диффузное поведение цитосолильных белков на основе объединенных одномолекулярных траекторий.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одномолекулярная локализационная микроскопия зондирует положение и движения отдельных молекул в живых клетках с десятками нанометров пространственного и миллисекундного височного разрешения. Эти возможности делают одномолекулярную микроскопию локализации идеально подходящей для изучения биологических функций молекулярного уровня в физиологически значимых средах. Здесь мы демонстрируем интегрированный протокол для приобретения и обработки/анализа данных отслеживания одной молекулы для извлечения различных диффузивных состояний, которые может проявлять сявряющий белок. Эта информация может быть использована для количественной оценки формирования молекулярного комплекса в живых клетках. Мы предоставляем подробное описание эксперимента по локализации на основе 3D-молекулы на основе камеры, а также последующих шагов по обработке данных, которые дают траектории отдельных молекул. Эти траектории затем анализируются с помощью численного анализа для извлечения распространенных диффузивных состояний флуоресцентно обозначенных молекул и относительного изобилия этих состояний. Основа анализа основана на стохастической моделировании внутриклеточных броуновских диффузионных траекторий, которые пространственно ограничены произвольной геометрией клеток. На основе смоделированных траекторий, сырые одномолекулярные изображения генерируются и анализируются так же, как экспериментальные изображения. Таким образом, экспериментальные ограничения точности и точности, которые трудно откалибровать экспериментально, явно включены в аналитический рабочий процесс. Коэффициент диффузии и относительные фракции населения в преобладающих диффузионных состояниях определяются путем установки распределения экспериментальных значений с использованием линейных комбинаций смоделированных распределений. Мы демонстрируем полезность нашего протокола путем разрешения диффузивных состояний белка, который проявляет различные диффузионные состояния при формировании гомо- и гетеро-олигомерных комплексов в цитозоле бактериального патогена.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение диффузивного поведения биомолекул дает представление об их биологических функциях. Методы, основанные на флуоресценции, стали ценными инструментами для наблюдения за биомолекулами в их родной клеточной среде. Восстановление флуоресценции после фотоотрубения (FRAP) и флуоресцентной корреляции спектроскопии (FCS)1 обеспечивают ансамбль-средний диффузивного поведения. И наоборот, одномолекулярная локализация микроскопии позволяет наблюдать за отдельными флуоресцентно отмеченными молекулами с высоким пространственным и временным разрешением2,3,4. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Двухсексовая точечная калибровка

ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, описанные в этом и следующих разделах приобретаются с помощью специально голой перевернутой флуоресценции микроскоп, как описано в Rocha и др.23. Та же процедура применима к различным реализациям микроскопа, предназначенным для одномолекулярной локализации и отслеживания микроскопии2,3,4. Все программное обеспечение для получения изображений и обработки данных, описанное в этой статье, доступно (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-Tracking-Analysis.git....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В описанных здесь экспериментальных условиях (20 000 кадров, длина траектории минимум 4 локализации) и в зависимости от уровня экспрессии флуоресцентно обозначенных термоядерных белков, приблизительно 200-3000 локализаций дают 10-150 траектории могут быть сгенерированы на ячейку(рисунок 2a, b). Большое количество траекторий необходимо для получения хорошо отобранного распределения коэффициентов видимой диффузии. Размер FOV, собранных здесь, с.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критическим фактором для успешного применения представленного протокола является обеспечение того, чтобы одномолекулярные сигналы были хорошо отделены друг от друга (т.е. они должны быть редкими в пространстве и во времени(Дополнительный Mov. 1)). Если в клетке одновременно находится более одной флуоресценционной молекулы, то локализация может быть неправильно назначена на траекторию других молекул. Это называется проблемой связывания30. Экспериментальные условия, такие как уровни.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Алеся Ахимович и Тингя Нан за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим Эда Холла (Ed Hall), старшего научного сотрудника группы Advanced Research Computing Services в Университете Вирджинии, за помощь в настройке процедур оптимизации, используемых в этой работе. Финансирование этой работы было предоставлено Университетом Вирджинии.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,6-диаминопимеловая кислотаChem Impex International5411Необходима для роста используемых клеток Y. enterocolitica.
4f объективыThorlabsAC508-080-Af = 80 мм, лазер 2"
514 нмCoherentGenesis MX514 MTMИспользование для возбуждения флуоресценции
агарозыInivtrogen16520100Используется для изготовления гелевых подушечек для крепления жидкого бактериального образца на микроскоп.
хлорид аммонияSigma AldrichA9434M2G ингредиент.
полосовой фильтрChromaET510/bpПуть возбуждения.
Мозговая инфузия сердцаSigma Aldrich53286Питательная среда для Y. enterocolitica.
хлорид кальцияSigma Aldrich223506ингредиент M2G.
ФотоаппаратImaging SourceDMK 23UP031Фотоаппарат для фазово-контрастной визуализации.
диэлектрическая фазовая маскаDouble Helix, LLCN/AПроизводит сигнал DHPSF.
динатрийфосфатSigma Aldrich795410M2G ингредиент.
этилендиаминтетрауксусная кислотаFisher ScientificS311-100хелаты Ca2+. Индуцирует секрецию в T3SS.
откидное зеркалоNewport8892-KПозволяет переключаться между флуоресцентным и фазово-контрастным путями.
флуосферыInvitrogenF8792Флуоресцентные бусины. 540/560 длины волн возбуждения и излучения. Диаметр 40 нм.
стеклянная крышкаVWR16004-302#1.5, 22ммx22мм
глюкозаChem Impex International811M2G ингредиент.
Погружное маслоOlympusZ-81025Устанавливается на линзу объектива.
сульфат железа (II)Sigma AldrichF0518M2G ингредиент.
фильтр длинных проходовSemrockLP02-514RU-25Эмиссия тракта.
сульфат магнияFisher ScientificS25414Aингредиент M2G.
Платформа для микроскоповMad City LabsПользовательскаяплатформа для инвертированного микроскопа.
используемые клетки налидиксовой кислотыSigma AldrichN4382Y. enterocolitica устойчивы к налидиксовой кислоте.
объективобъектив Olympus1-U2B99160X, 1.4 NA
Озоновый очистительNovascanPSD-UV4Используется для устранения фона флуоресценции на стеклах покровных стекол.
фосфат калияSigma Aldrich795488ингредиент M2G.
Красный светодиодThorlabsM625L3Подсвечивает образец для фазово-контрастной визуализации. 625 нм.
sCMOS камераHamamatsuORCA-Flash 4.0 V2Камера для флуоресцентной визуализации.
короткочастотный фильтрChromaET700SP-2P8Эмиссия тракта.
Тубусная линзаThorlabsAC508-180-Af=180 мм, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasdN/AN/AStrain AD4442, eYFP-YscQ
четвертьволновая пластина нулевого порядкаThorlabsWPQ05M-514Путь возбуждения.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule Tracking3D Localization MicroscopyDiffusive States AnalysisFluorescent Bead FiducialDouble Helix Point Spread FunctionMATLAB Data ProcessingApparent Diffusion CoefficientStochastic Simulation FrameworkCytosolic Protein ComplexesBacterial Pathogen Imaging

Related Articles