Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Opsonophagocytic убийства Assay оценить иммунологические реакции против бактериальных патогенов

13K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59400

⸱

5 апреля 2019 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Molecular Medicine and Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

В этой статье

Краткое содержание

Этот assay убийство opsonophagocytic используется для сравнения способность фагоцитирующих иммунных клеток реагировать и убивают бактерии, основанные на различных методов лечения и/или условий. Классически этот assay служит золотой стандарт для оценки эффекторные функции антител против бактерий как опсонин.

Аннотация

Ключевым аспектом иммунного ответа на бактериальной колонизации хоста является фагоцитоза. Assay убийство opsonophagocytic (OPKA) является экспериментальной процедуры, в котором фагоцитирующих клеток совместно культивируемых с бактериальной единиц. Иммунные клетки фагоцитоз и убить бактериальных культур в духе дополнение зависимых. Эффективность убийства клеток иммунной системы зависит от целого ряда факторов и может использоваться для определения различных бактериальных культур сравнения в отношении устойчивости к смерти клетки. Таким образом можно оценить эффективность потенциал на основе иммунной терапии против конкретных штаммов бактерий и/или серотипов. В этом протоколе мы описываем упрощенная OPKA, которая использует основные культуры условий и клеток подсчета для определения жизнеспособности бактериальных клеток после совместного культуры с условий лечения и иммунных клеток HL-60. Этот метод был успешно использован с рядом различных серотипов пневмококков, капсульные и acapsular штаммов и других бактериальных видов. Преимущества этого протокола OPKA являются его простота, универсальность (как этот assay не ограничивается лечения антителами как опсонины) и минимизации времени и реагенты для оценки основных экспериментальных групп.

Введение

Opsonophagocytic убийства пробирного (OPKA) является важнейшим инструментом для увязки изменения в бактериальных структуры или функции для последующих изменений в иммунной реакции и функции. Таким образом он часто используется в качестве дополнительного анализа для определения на основе иммунной эффективность лечения антителами, вакцин-кандидатов, оптимизация фермента и т.д. Хотя в естественных условиях анализы необходимы для определения эффективного разминирования или защиты в модели бактериальной инфекции, OPKA может использоваться для оценки иммунного вклад в бактериальной клетке смерти на самых основных компонентов: бактерии, иммунные клетки и экспериментальные лечение. Предыдущие исследования показали, что OPKAs могут быть модифицировать и использовать для различных бактерий и серотипов, включая Streptococcus pneumoniae1,2 золотистый стафилококк, синегнойная3. Кроме того эти оптимизированные анализов может использоваться для оценки различных экспериментальных процедур, включая фермента возможность сделать более доступными для дополнения опосредованных иммунных клеток4 и антитела лечение для улучшения бактерии опсонизацию5. Классически, OPKA пробирного успешно используется в фундаментальных и клинических исследованиях параметры как мощный индикатор для защиты индуцированных возбудителя специфические антитела6,,78,9 .

Различные типы иммунных клеток может использоваться для оценки opsonophagocytic убийства. Один из часто используемых фагоцитарной населения является линия человека лейкозных клеток HL-60. Эта линия клетки могут храниться как инактивированных promyelocytes в культуре; Однако они могут быть продифференцированы в различных активированных государства через различных наркотиков лечения10,11. Лечение HL60 с N, N-Диметилформамид дифференцирует линии клетки в активированных нейтрофилов с сильным фагоцитарной активности11. В то время как клеток HL-60 были оптимизированы и часто используются для этих анализов фагоцитоза10, других первичных полиморфноядерных лейкоцитов может использоваться как иммунные руку эксперимент12.

Кроме того эти анализы может быть упрощенной13 или мультиплексированных14 взглянуть на несколько устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий для проверки. Мультиплексированных метод был достигнут более реальным путем разработки программного обеспечения, которое может эффективно рассчитывать бактериальные колонии, образуя единиц (CFUs) за пятно на плиты агара15. Здесь мы описываем рациональный метод, используя один штамм бактерий, клеток HL-60, ребенок кролика дополнением и плиты агара крови. С помощью этого метода несколько процедур можно быстро оценить вопросы конкретных исследований на как можно модулировать врожденный иммунный ответ к бактериальной инфекции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура, дифференциация и проверки клеток HL-60

  1. Подготовьте СМИ культуры клеток HL-60 состоит из 500 мл RPMI с L-глютамина и 50 мл тепло инактивированная плода бычьим сывороточным. Не добавляйте антибиотики, как это может повлиять на дифференциацию клеток HL-60.
  2. Для распространения/обслуживание клеток HL-60 культуры 5 х 106 клеток в 10 мл средства массовой информации культуры клеток HL-60 75 см2 вентилируемые фляги при 37 ° C и 5% CO2. Проход клетки каждые 3−4 дней для поддержания оптимального клеток концентрации.
    Примечание: Клетки концентрация не должна превышать 5 x 10-6/мл.
  3. Создайте рабочие запасы клеток HL-60, aliquoting примерно 1 х 106 клеток/мл в HL60 культуре СМИ с 10% диметилсульфоксида (ДМСО) в 1 мл криогенных трубы.
    Примечание: Рабочие запасы могут храниться при температуре-80 ° C. Основной запас должен храниться при-120 ° C.
  4. Дифференцировать клеток HL-60, культивирования 1,5 x 10-7 клеток в 15 мл средства массовой информации культуры клеток HL-60 с 0,6% N, N-Диметилформамид (DMF) при 37 ° C и 5% CO2 в стерильных фильтр максимум 75 см2 фляги для 3 дней до OPKA.
  5. Проверить что клеток HL-60 успешно дифференцированной и подходят для использования в OPKA assay путем тестирования жизнеспособность и поверхностных маркеров ячейки согласно установленным потока цитометрии протоколы16,17, 18,19. После дифференциации урожай клеток HL-60 и пятна примерно 1 х 104 клетки с дневно конъюгированных антител/пятна для CD71, CD35, annexin V и пропидий йодидом.
    Примечание: Дифференцированных клеток должно быть ≥65 жизнеспособным, ≥55% CD35+и ≤20% CD71 создана+ определяется путем проверки протоколов14 (рис. 1).

2. Подготовка OPKA буферов и реагенты

  1. Подготовка 50 мл стерильного опсонизацию буфера B (OBB) путем смешивания 42,5 мл стерильного 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) с Ca2 +/Mg2 +, 5 мл сыворотки тепла инактивированная плода говядину и 2,5 мл 0,1% стерильный желатина. Хранить при 4 ° C.
  2. Получить ребенок кролика дополнением и хранить при температуре-80 ° C.
  3. Получить или подготовить бактериальной культуры (то есть, 15 x 100 мм2 5% овец крови агар Знаки номерные знаки).

3. Подготовка образцов бактериальных запасов

  1. Получите запас бактериальный strain(s) тестируемых.
    Примечание: Для этого протокола, серотипа 3 пневмококк (WU2, щедро предоставленных д-р Муна Nahm) используется.
  2. Расти бактериальный штамм в соответствующей бульон (т.е., Тодд-Хьюитт бульон + 0,5% экстракт дрожжей для этого штамма WU2) для приблизительно 2−4 ч при 37 ° C.
    Примечание: Оптическая плотность при 600 Нм (600OD) культуры должно составлять 0,6 и 0,8.
  3. Пелле бактерии центрифугированием при 6000 x g на 2 мин и Ресуспензируйте клетки в 10−30 мл 15% глицерина в соответствующие бульон. Алиготе бактериальной культуры (500 мкл на Алиготе) в стерильных 1.5 мл пробирок и хранить при температуре-80 ° C.
  4. Оттаять одного флакона бактериальных акций в ванну воды 37 ° C. Пелле бактериальные клетки и Ресуспензируйте в 500 мкл OBB в стерильных условиях.
  5. Подготовка различных разведениях бактериальной акций в «OBB» (т.е., 10 мкл неразбавленный, 10 мкл 1:10, 10 мкл масштаба 1: 100 и т.д.). Выполните OPKA пробу (разделы 4 – 6, включая HL-60/дополнением сотрудничества культуры), как описано ниже с использованием различных разведениях Необработанные бактериальных запасов. Культура пластины на ночь на 30 ° C (CO2).
    Примечание: Температура 30 ° C для WU2 предотвратить разрастание; другие штаммы/серотипы могут расти оптимально при 37 ° C.
  6. Подсчет колоний для каждого разведения Необработанные бактериальных акций совместно культивируемых клеток HL-60 и дополнения. Определите, какие разведения бактерий дает оптимальное количество countable колоний (примерно 80−120 CFUs для без лечения бактерий, совместно культивируемых клеток HL-60). Обратите внимание, это раствора для будущих OPKAs с участием этой бактериальные фондовом.

4. бактериальных лечения и культура

  1. Разморозить один трубки бактериальной акций, подготовленную на этапе 3.3. Пелле бактерий (6000 x g на 2 мин) и Ресуспензируйте Пелле клеток в OBB на оптимальное разведение, определенных на шаге 3.6.
  2. Пипетка 10 мкл ресуспензированы бактериальной разрежения в колодец в раунд нижнюю ячейку 96-луночных культуры пластине.
  3. 20 мкл соответствующего лечения антителами или наркотиков, для каждой экспериментальной скважины в двух экземплярах.
    Примечание: В этом протоколе серотип специфические антитела, сгенерирована мышей добавляется в качестве лечения X и гликозид гидролазы фермента, известного деградировать серотипа 3 полисахаридной капсулы добавляется в качестве лечения Y (рис. 2)4,20. Для контроля скважин используйте 1 x PBS или OBB, в зависимости от буфер, используемый для лечения скважин.
  4. Встряхните образца пластины на приблизительно 90 об/мин за 1 ч при комнатной температуре. Настройте эти условия в зависимости от оптимальной температуры или встряхивания условий лечения проходит испытания.

5. HL-60 Бактериальная культура сотрудничества

  1. Подготовьте клеток HL-60, уборки HL-60 дифференцированной клетки, которые обращаются с ДМФ три дня до (см. шаг 1.4) в 15 мл конические трубы. Пелле клетки (500 x g, 3 мин), удалить супернатант и мыть с по крайней мере 10 мл ПБС.
  2. Пелле вымыть клетки (500 x g, 3 мин), удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в OBB (начать с 1 мл OBB и настроить для окончательного концентрации 1 x 10-7/мл после подсчета клеток).
  3. Добавьте дополнение кролик baby (стерильные, неразбавленное baby кролик сыворотки, возраст 3−4 недель) на окончательный объем 1:5.
    Примечание: Конечная концентрация HL-60-дополнения смесь должна быть 1 x 10-7/мл. Если тестирование дополнения зависимостей, второй раствор, содержащий активных клеток HL-60 с тепло инактивированная дополнением может использоваться (дополнением может инактивированная по инкубации в водяной бане при > 55 ° C для по крайней мере 30 минут).
  4. После того, как 1 h бактериальной культуры является полным (шаг 4.4), разделите дублировать скважин для двух групп (например, использование только 20 мкл самобытной культуры 30 мкл совместного учета для дозирования ошибка) каждый образец (т.е., 10 мкл каждого 30 мкл пример хорошо в две новые скважины) : один набор будет совместно культивируемых с HL-60-дополнение и один будет включать в себя только бактерии. Добавьте 50 мкл HL-60-дополнения смесь (из шага 5.3) для каждого экспериментального набора скважин (делегированных + HL-60); Добавьте 50 мкл OBB только скважин бактерий только (делегированных -HL-60).
    Примечание: Для этого примера примерно 800 бактериальный CFUs используются для первоначального совместного культуры клеток HL-60 мкл5/50 5 x 10. Если это многообразие инфекции является слишком высокой или слишком низкой, как указано в заключительном колонии числами, скорректировать первоначальный бактериальных разрежения в отличие от числа клеток HL-60.
  5. Встряхните 96-луночных пластины при 37 ° C в течение 1 ч (CO2).

6. образец покрытия и ночь инкубации

  1. Разбавьте каждый хорошо 1:5 с «OBB», так что каждый образец имеет объем по крайней мере 50 мкл.
  2. Пипетка 50 мкл каждого образца непосредственно на заданном районе бактериальной культуры пластины, обеспечивая достаточное расстояние между образцами. 15 x 100 мм2 раунд плиты агара, накапайте приблизительно 4 образцы на одну пластину.
  3. Накрыть и образцы сохнуть в течение приблизительно 15 минут при комнатной температуре.
  4. Инвертируйте пластины и культуры на ночь на 30 ° C (CO2). Кроме того культура пластины в анаэробных баночки для проверки ли бескислородные условия влияют на рост бактерий или управления для морфологии.
  5. После ночи культуры счетчик колоний в каждой области указанного образца. Анализ данных, сравнивая количество живых клеток в каждом наборе для соответствующего элемента управления и/или образцы, которые не получают совместно культуры клеток HL-60 (ориентировочный выживания клетки 100%, 0% клеток убийство).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Проверка HL-60 дифференциации должны выполняться перед началом OPKA. Это может быть достигнуто с помощью проточной цитометрии для определения внеклеточного выражение CD11b, CD35, CD71 и annexin V (рис. 1). Пропидий йодидом может также использоваться в качестве маркера жизнеспособности. После 3 дней лечения с ДМФ, должна быть увеличена выражение CD35 (≥55% от всех клеток) и выражение CD71 должна быть уменьшена (≤20% от всех клеток). Процент annexin V + и пропидий йодидом (PI +) клетки вместе ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

OPKAs служат существенно важную роль в оценке антител при посредничестве иммунных реакций, вызванных прививки6,8. Основной смысл этой упрощенной OPKA является адаптируемость в условиях для проверки (то есть, антитела, фермента лечения и т.д.). В этом смысле в то время как этот assay может использоваться для тестирования участие опсонины (то есть, антитела) в фагоцитоза, она может также использоваться для оценки путей преодоления Факторы вирулентности (т.е., капсу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим д-р Муна Nahm (Университет штата Алабама Бирмингем) за его неоценимую помощь в создании OPKA анализы в нашей лаборатории. Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грант 1R01AI123383-01A1 для FYA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аннексин V (конъюгированный с АПК)BioLegend640919
анти-CD35, человеческий (конъюгированный с ПЭ)BioLegend333405
анти-CD71, человеческий (конъюгированный с ПЭ)BioLegend334105
штамм бактерий (т.е. Streptococcus pneumoniae, WU2)Бактериальная респираторная референс-лаборатория (д-р Мун Нам) 
агаровые пластины для кровиHardy DiagnosticA10
Фетальный клон сывороткиHyCloneSH30080,03
глицеринSigmaG9012-1L
HL-60 клеткиATCCCCL-240
IgG Контроль изотипа (PE конъюгированный)BioLegend400907
N,N-диметилформамид (DMF)Fisher ХимическийUN2265
пропидия йодидSigmaP4864
RPMI среда с L-глутаминомCorning10-040-CV
используемый

Ссылки

  1. Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
  2. Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
  3. Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
  4. Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
  5. Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
  6. Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
  7. Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
  8. Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
  9. Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
  10. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  11. Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
  12. Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
  13. Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
  14. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
  15. Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
  16. Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).
  17. Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).
  18. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).
  19. Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
  20. Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Дифференцировка клеток HL60фагоцитоз бактерийанализ методом проточной цитометрииStreptococcus pneumoniaeкомплемент-зависимое уничтожениеколониеобразующие единицыкокультивирование иммунных клетокэффекты лекарственной терапииоценка клиренса бактерий
Opsonophagocytic убийства Assay оценить иммунологические реакции против бактериальных патогенов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.