Методическая статья

Высокое разрешение 3D Изображение бешенства вирусной инфекции в Solvent-очищенных мозговой ткани

DOI:

10.3791/59402

⸱

30 апреля 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Новые, иммуноспотенцом совместимые методы очистки тканей, как конечная 3D-изображения растворителя очищенных органов позволяют 3D визуализации бешенства вирус инфекции головного мозга и его сложной клеточной среды. Толстые, антитела помечены ломтиками ткани мозга сделаны оптически прозрачными для увеличения глубины изображения и для включения 3D-анализа с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация инфекционных процессов в тканях и органах с помощью иммуномаркировки является ключевым методом в современной инфекционной биологии. Способность наблюдать и изучать распределение, тропизм и обилие патогенных микроорганизмов внутри тканей органов дает ключевые данные о развитии и прогрессировании болезней. Используя обычные методы микроскопии, иммуномаркировка в основном ограничивается тонкими секциями, полученными из парафина или замороженных образцов. Однако ограниченная плоскость 2D-изображений этих тонких секций может привести к потере важной информации о сложной структуре инфицированного органа и клеточном контексте инфекции. Современные многоцветные, иммуносно-совместимые методы очистки тканей теперь обеспечивают относительно быстрый и недорогой способ изучения высокообъемных 3D-изображений стеков зараженной вирусом ткани органов. Подвергая ткани органических растворителей, она становится оптически прозрачной. Это соответствует рефракционным индексам образца и в конечном итоге приводит к значительному сокращению рассеяния света. Таким образом, в сочетании с длинными свободными целями рабочего расстояния, большие секции ткани размером до 1 мм могут быть изображены обычными конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (CLSM) с высоким разрешением. Здесь мы описываем протокол для нанесения визуализации глубоких тканей после очистки тканей для визуализации распространения вируса бешенства в инфицированных мозгах для изучения таких тем, как вирусный патогенез, распространение, тропизм и нейровторжение.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обычные методы гистологии в основном опираются на тонкие участки тканей органов, которые могут по своей сути обеспечить только 2D-понимание сложной 3D-среды. Хотя это возможно в принципе, 3D-реконструкция из серийных тонких секций требует требовательных технических трубопроводов как для нарезки, так и для последующего выравнивания силико приобретенных изображений1. Кроме того, бесшовная реконструкция z-томов после нарезки микротомов имеет решающее значение, так как механические и вычислительные артефакты могут оставаться из-за неоптимальной регистрации изображений, вызванной неоверплавлением плоскостей изображения, вариациями окрашивания и физическими разрушение тканей, например, лезвием микротома. В отличие от этого, чистая оптическая нарезка нетронутых образцов толстой ткани позволяет приобрести перекрывающиеся плоскости изображения (перевыборка) и, таким образом, облегчает 3D-реконструкцию. Это, в свою очередь, очень полезно для анализа инфекционных процессов в сложных популяциях клеток (например, нейронных сетей в контексте окружающих глиальных и иммунных клеток). Однако, присущие препятствия толстых секций ткани включают рассеяние света и ограниченное проникновение антител в ткани. В последние годы, различные методы были разработаныи оптимизированы для преодоления этих вопросов 2,3,4,5,6,8 , 9 До 9 , 10 Лет , 11 Год , 12 Лет , 13. По существу, целевые ткани становятся оптическипрозрачными при лечении либо с aqueous 2,3,4,6,7 ,8,9 или органических растворителей на основе10,11,12,13 решений. Внедрение 3DISCO (3D-изображения органов, очищенных от растворителя)11,12 и его преемника uDISCO (конечная 3D-изображение органов, очищенных от растворителя)13 обеспечило относительно быстрый, простой и недорогой инструмент с отличные возможности очистки. Основными компонентами клирингового протокола являются органические растворители терт-бутанол (TBA), бензиловый спирт (BA), бензил бензоат (BB) и дифениловый эфир (DPE). Разработка и добавление iDISCO (иммуномаркировка с поддержкой 3D-изображения органов, очищенных от растворителя)14, совместимого протокола иммуносохранения, стало еще одним преимуществом перед существующими методами и позволило провести маркировку антигенов в глубоких тканях интерес, а также длительное хранение иммунозапятнанных образцов. Таким образом, сочетание iDISCO14 и uDISCO13 позволяет с высоким разрешением изображения антител помечены белки в больших разделах тканей (до 1 мм) с использованием обычных CLSM.

Сохранение сложной структуры органа во всех трех измерениях особенно важно для тканей мозга. Нейроны составляют очень разнородную клеточную субпопуляцию с очень разнообразными 3D морфологиями на основе их невритовых проекций (рассмотрено Masland15). Кроме того, мозг состоит из ряда отсеков и подотсеков, каждый из которых состоит из различных клеточных субпопуляций и их соотношений, включая глиальные клетки и нейроны (обзор фон Бартхолд и др.16). Как нейротропный вирус, вирус бешенства (RABV, рассмотренный Fooks et al.17)в первую очередь заражает нейроны, используя свой транспортный механизм для передвижения в ретроградном направлении вдоль аксонов от основного места инфекции до центральной нервной системы (ЦНС). Описанный здесь протокол(рисунок 1А) позволяет иммуноспотеченно-помощь обнаружения и визуализации RABV и RABV-инфицированных клеток в больших, согласованных стеков изображений, полученных из инфицированных тканей мозга. Это позволяет объективно, 3D высокого разрешения оценки инфекционной среды. Это применимо к ткани мозга из различных видов, может быть выполнена сразу после фиксации или после длительного хранения образцов в параформальдегиде (PFA), и позволяет хранения и повторного изображения окрашенных и очищенных образцов в течение нескольких месяцев.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RABV-инфицированных, PFA фиксированной архивных мозга материал был использован. Соответствующие экспериментальные исследования на животных были оценены ответственным комитетом по уходу за животными, использованию и этике Государственного управления по сельскому хозяйству, безопасности пищевых продуктов и рыболовству в Мекленбурге-Передней Померании (LALFF M-V) и получили одобрение с разрешения 7221.3-2.1-002/11 (мыши) и 7221.3-1-068/16 (хоррет). Общий уход и методы, используемые в экспериментах на животных, осуществлялись в соответствии с утвержденными руководящими принципами.

ВНИМАНИЕ: Этот протокол использует различные токсичные и / или вредные вещества, в том числе PFA, метанол (MeOH), перекись водорода (H2O2), азид натрия (NaN3), TBA, BA, BB, и DPE. MeOH и TBA легко воспламеняются. Избегайте воздействия, нося соответствующее индивидуальное защитное оборудование (лабораторное пальто, перчатки и защиту глаз) и проводя эксперименты в дымовом капюшоне. Сбор отходов отдельно в соответствующих контейнерах и утилизировать их в соответствии с местными правилами. Вирус бешенства классифицируется как уровень биобезопасности (BSL)-2 патогена и, следовательно, может, как правило, обрабатываются в условиях BSL-2. Некоторые виды деятельности, включая процедуры, которые могут генерировать аэрозоли, работать с высокой концентрацией вируса или работать с новыми лиссавирусами, могут потребовать классификации BSL-3. Предэкспозиционная профилактика рекомендуется персоналу высокого риска, в том числе зооработникам и лаборантам18,19. Обратитесь к местным органам власти.

1. Фиксация тканей головного мозга и секция

  1. Исправить образцы мозга в соответствующем объеме 4% ПФА в фосфатно-буферизированном сольнике (PBS (pS 7.4) не менее 48 ч при 4 градусов по Цельсию (с приблизительным соотношением ткани к фиксативному 1:10 .v/v).
  2. Вымойте образцы тканей 3x в PBS, по крайней мере 30 минут каждый мыть и хранить их в 0,02% NaN3/PBS при 4 C до использования.
  3. Разделите ткань на 1 мм толщиной разделов с использованием вибратом (скорость подачи лезвия: 0,3-0,5 мм/с, амплитуда: 1 мм, толщина ломтика: 1000 мкм).
  4. Чтобы сохранить правильную последовательность срезов, храните каждый раздел ткани отдельно в колодце многофункциональной пластины культуры клеток. Добавьте 0.02% NaN3/PBS и храните секции ткани при 4 градусах Цельсия до использования.

2. Пробная предварительная обработка метанолом

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубационные шаги с мягким колебанием и, если не указано в противном случае, при комнатной температуре. Защитите образцы от света. Перед лечением образца служит общая цель улучшения диффузии антител и снижения аутофлуоресценции тканей при воздействии meOH и H2O2, соответственно14.

  1. Подготовка 20% (v/v), 40%, 60%, и 80% MeOH решений в дистиллированной воде. Например, для 20% MeOH, добавить 10 мл 100% MeOH до 40 мл дистиллированной воды в соответствующем герметичном сосуде и перемешать путем инвертирования его.
  2. Передача образцов на сосуды разумного размера (например, реакционные трубки 5 мл). Позаботьтесь об использовании материалов, химически устойчивых к реагентам, используемым в данном протоколе. Например, обратите внимание, что в то время как полипропилен подходит, полистирол не является.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спецификации громкости в этом протоколе относятся к 5 мл реакционных труб. Если используется другое судно, отрегулируйте объемы соответствующим образом.
  3. Инкубировать образцы в 4 мл каждой концентрации подготовленной серии растворов MeOH в порядке возрастания по 1 ч каждый.
  4. Инкубировать образцы 2x на 1 ч каждый в чистом (100%) MeOH.
  5. Охладите образцы до 4 градусов по Цельсию (например, в лабораторно-безопасном холодильнике).
  6. Подготовка отбеливания решение (5% H2O2 в MeOH) например, разбавления 30% H2O2 фондовый раствор на 1:6 в чистом (100%) MEOH, и охладить его при 4 градусах по Цельсию.
  7. Удалите 100% MeOH из рефрижераторных образцов и добавьте 4 мл прешилового отбеливания (5% H2O2 в MeOH). Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
  8. Обменять раствор отбеливания на 4 мл 80% MeOH и инкубировать на 1 ч. Продолжайте использовать подготовленную серию решений MeOH в порядке убывания по 1 ч каждый, пока образцы не будут инкубированы на 1 ч в 4 мл 20% MeOH.
  9. Вымойте образцы 1x на 1 ч с 4 мл PBS.

3. Иммуностогирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубационные шаги с мягким колебанием и, если не указано в противном случае, при комнатной температуре. Защитите образцы от света. Чтобы предотвратить рост микробов, добавьте NaN3 к окончательной концентрации 0,02% к растворам в этом разделе. Образцы тканей дополнительно пронизаны путем лечения неионическими моющими средствами Triton X-100 и Tween 20. Нормальная сыворотка используется для блокирования неспецифических связывания антител. Глицин и гепарин добавляются для уменьшения иммуномаркировки фон14.

  1. Вымойте образцы 2x на 1 ч каждый в 4 мл 0,2% Тритон X-100/PBS.
  2. Пермяки образцы в течение 2 дней при 37 градусах Цельсия с 4 мл 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M глицин/PBS.
  3. Блокируйте неспецифическую привязку антител путем инкубации образцов в течение 2 дней при 37 градусах Цельсия в 4 мл 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% нормальной сыворотки/PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте нормальную сыворотку от того же вида вторичное антитело было поднято в для достижения идеальных результатов блокирования.
  4. Инкубировать образцы в 2 мл первичного раствора антитела (3% нормальной сыворотки /5% DMSO/PTwH (PBS-Tween 20 с гепарином) - первичные антитела/антитела) в течение 5 дней при 37 градусах Цельсия. Освежите основной раствор антитела после 2,5 дней.
    1. Для PTwH, восстановить соль гепарина натрия в дистиллированной воде, чтобы сделать 10 мг / мл бульона раствор (храните это решение, aliquoted, при 4 градусах Цельсия). Добавьте штоковое раствор до 0,2% Tween 20/PBS до конечной концентрации 10 мкг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор правильного разбавления антител может потребовать оптимизации. Как правило, стандартные концентрации иммуногистохимии являются хорошей отправной точкой.
  5. Вымойте образцы в течение 1 дня в 4 мл PTwH, обменивая буфер стирки по крайней мере 4x-5x в течение дня и оставляя окончательное мыть на ночь.
  6. Инкубировать образцы в 2 мл вторичного раствора антитела (3% нормального раствора сыворотки/PTwH - вторичные антитела/антитела) в течение 5 дней при 37 градусах Цельсия. Освежите вторичный раствор антитела после 2,5 дней.
    1. Разбавить вторичные антитела/антитела при 1:500 во вторичном антителрастворе (т.е. 4 л в 2 мл).
  7. Вымойте образцы в течение 1 дня, как описано в шаге 3.5, оставляя окончательную стирку на ночь.

4. Ядерное окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубационные шаги с мягким колебанием и, если не указано в противном случае, при комнатной температуре. Защитите образцы от света. Если не требуется ядерное окрашивание или частота волн/эмиссионная длина/выброс TO-PRO-3 требуется для возбуждения или обнаружения другого фторофра, пропустите этот шаг.

  1. Разбавить нуклеиловую кислоту пятно TO-PRO-3 на 1:1,000 в PTwH и инкубировать образцы в 4 мл ядерного раствора окрашивания для 5 ч.
  2. Вымойте образцы в течение 1 дня, как описано в шаге 3.5, оставляя окончательную стирку на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После смок, образцы могут храниться в PBS при 4 градусах Цельсия до оптической очистки.

5. Очистка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубационные шаги с мягким колебанием и, если не указано в противном случае, при комнатной температуре. Защитите образцы от света. Образцы тканей обезвоживаются в градуированных рядах решений TBA. Как иммунопятнанирование требует вакавных решений, все процедуры окрашивания должны быть закончены до очистки тканей. Оптический клиренс и рефракционный индекс соответствия достигаются путем лечения со смесью BA, BB и DPE. Клиринговое решение дополняется DL-я-токоферолом в качестве антиоксиданта13.

  1. Подготовьте 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% и 96% TBA растворов в дистиллированной воде. Например, для 30% TBA, добавить 15 мл 100% TBA до 35 мл дистиллированной воды в соответствующем герметичном сосуде и перемешать путем инвертирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: TBA имеет точку плавления 25-26 градусов по Цельсию; таким образом, он имеет тенденцию быть твердым при комнатной температуре. Для того, чтобы подготовить решения TBA, нагрейте хорошо запечатанную бутылку при температуре 37 градусов по Цельсию в инкубаторе или водяной бане.
  2. Обезвоживать образцы с 4 мл каждой концентрации подготовленной серии растворов TBA в порядке возрастания по 2 ч каждый. Оставьте 96% TBA на ночь.
  3. Обезвоживать образцы дальше в чистом (100%) TBA на 2 ч.
  4. Подготовьте клиринговое решение BABB-D15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: BABB-D15 представляет собой комбинацию BA и BB (BABB), которая смешивается с DPE в соотношении x:1, где x указан в названии решения, в данном случае 15.
    1. Для BABB, смешать одну часть BA с двумя частями BB.
    2. Смешайте BABB и DPE в соотношении 15:1.
    3. Добавьте 0,4 vol% DL-я-токофероль (витамин Е).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для 20 мл BABB-D15, смешать 6,25 мл BA с 12,5 мл BB. Добавьте 1,25 мл DPE и дополните его 0,08 мл DL-я-токоферола.
  5. Очистите образцы в клиринговом растворе до оптических прозрачных (2–6 ч).
  6. Образцы могут храниться при 4 градусах Цельсия в BABB-D15, защищены от света, до монтажа и изображения.

6. Выборка монтажа

  1. С помощью 3D-принтера распечатайте камеру изображения и крышку (материал: кополистер ,CPE, сопло: 0,25 мм, высота слоя: 0,06 мм, толщина стен: 0,88 мм, количество стен: 4, заполнение: 100%, нет опорной структуры; соответствующая . Файл STL можно найти в дополнительных материалах этого протокола).
  2. Соберите камеру изображения(рисунок 2).
    1. Установите круглую крышку (диаметр: 30 мм) на камеру изображения с RTV-1 (однокомпонентная комнатно-температурно-вулканизирующая) силиконовая резина. Удалите избыток силиконовой резины с водой смоченной ватным тампоном и вылечить на ночь.
    2. Установите круглую крышку (диаметр: 22 мм) на крышку с силиконовой резиной РТВ-1. Удалите избыток силиконовой резины с водой смоченной ватным тампоном и вылечить на ночь.
  3. Поместите образец в камеру изображения, добавьте небольшой объем BABB-D15 и вставьте крышку. Заполните камеру с BABB-D15 через впуск, используя подкожную иглу (27 G х 3/4 дюйма (0,40 мм х 20 мм).
  4. Подключите входе и запечатать камеру изображения с RTV-1 силиконовой резины. Лечить ночь в темноте.

7. Визуализация и обработка изображений

  1. Настройка приобретения изображения, выбрав соответствующие лазерные линии в соответствии с фторфорами, используемыми. Отрегулируйте диапазоны обнаружения каждого детектора, чтобы предотвратить перекрытие сигнала между каналами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцовые диапазоны обнаружения для Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 и TO-PRO-3 500-550 нм, 590-620 нм и 645-700 нм соответственно.
  2. Выберите параметры приобретения, определите верхнюю и нижнюю границу z-стека и приобретите стек изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцовые параметры приобретения являются последовательным сканированием с размером пикселя 60-90 нм, размером с 0,5 мкм, средней линией 1, скоростью сканирования 400 Гц и размером пинхола 1 единицы Airy.
  3. Обработайте стек изображения с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений (например, Фиджи) для создания 3D-проекций или проведения углубленного анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за большого размера приобретенных файлов изображений, использование рабочей станции, как правило, необходимо.
    1. Откройте файл приобретения или изображения (ы) на Фиджи(Файл Открыто (ru) Выберите файлы).
      1. При использовании, например, . Файлы LIF, выберите или отбрасывайте нужные параметры в окне диалога Bio-Formats. Просмотр стека с Hyperstack. Помимо этого, никаких конкретных выделений или клещей не требуется. Пресс OK.
      2. Если файл содержит несколько стеков изображений, выберите те, которые должны быть проанализированы и подтверждены нажатием OK.
    2. Выполните коррекцию отбеливателя путем разделения объединенного изображения на отдельные каналы (Изображение Цветовая гамма Каналы Инструмент, а затем выберите Подробнее Сплит каналы). Для каждого канала выберите коррекцию отбеливателя (изображение Отрегулируйте (англ.) Коррекция отбеливателя) и выбрать простое соотношение (интенсивность фона: 0,0).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях, например, когда нет линейного распада сигнала или сигнал слишком слаб в целом, простое соотношение может потерпеть неудачу. Кроме того, попробуйте Экспоненциальный Fit или пропустить коррекции отбеливателя.
    3. Отрегулируйте яркость и контрастность для каждого канала с помощью ползунок (изображение Отрегулируйте (англ.) Яркость Контраст).
    4. Слияние каналов(Изображение Цветовая гамма Слияние каналов), сделать композитный (Изображение Цветовая гамма Каналы Инструмент, а затем выберите Подробнее СделатьКомпозитный ), и преобразовать его в форматЕ RGB(Изображение Цветовая гамма Каналы Инструмент, а затем выберите Подробнее Преобразование в RGB).
    5. При необходимости избавь сяризуйте стек изображения, чтобы уменьшить время вычисления и размер файла (изображение ) Отрегулируйте (англ.) Размер,оба варианта галочкой плюс билинейнерной интерполяции).
    6. Создание 3D-проекции (Изображение) Стеки 3D проект). Выберите Brightest Point в качестве метода проекции и установите интервал среза в соответствии с размером z-шага приобретенного стека изображений. Для максимального качества установите приращение угла вращения до 1 и включите интерполяцию. Изменение общей ротации, порогов прозрачности и непрозрачности по мере необходимости.
    7. При необходимости отспособьте контрастность и яркость, преобразовав 3D-проекцию обратно в 8-битный формат (изображение Тип (тип) 8-битный). Используйте соответствующие ползунки (изображение) Отрегулируйте (англ.) Яркость Контрастность) и переформатировать стек изображения в формат RGB, описанный в шаге 7.3.4.
    8. Сохранить 3D-проекцию как . Файл TIF (формат файла изображения) и . Файл AVI (формат видеофайла).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сочетание iDISCO14 и uDISCO13 в сочетании с CLSM с высоким разрешением дает глубокое понимание пространственно-временного разрешения и пластичности rabV инфекции мозговой ткани и окружающего клеточного контекста.

Использование иммуностоинга фосфопротеина RABV (P), сложные слои инфицированных нейрональных клеток могут быть визуализированы в толстых участках мозга мыши(рисунок 3). Впоследствии можно реконструировать бе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возрождение и дальнейшее развитие методов очистки тканей в последние годы2,3,4,5,6,7, 9 До 9 , 10 Лет , 11 Год , 12 Лет , 1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Томаса Меттенлейтера и Верену те Камп за критические прочтения рукописи. Эта работа была поддержана Федеральной инициативой передового опыта Мекленбурга Западной Померании и Европейским социальным фондом (ESF) Грантом Коинфектом (ESF/14-BM-A55-0002/16) и интрамуральным грантом на совместные исследования лиссавирусов на Институт Фридриха-Леффлера (Ri-0372).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагенты
Бензиловый спиртАльфа Аэсар41218Очищающий реагент
БензилбензоатСигма-ОлдричBB6630-500MLОчищающий реагент
ДиметилсульфоксидКарл Рот4720.2Различные буферы
Дифениловый эфирСигма-Олдрич240834-100ГОчищающий реактив
DL-α-токоферолАльфа Аэсар AesarA17039
Сыворотка ослякаBio-RadC06SBZБлокирующий реактив
ГлицинКарл Рот3908.2Снижение фона
Козья сывороткаMerck S26-100MLБлокирующий реагент
Гепарин натриевая сольКарл Рот7692.1Актуальность Восстановление
Раствор перекиси водорода (30 %)Карл Рот8070.2Отбеливающий образец
МетанолКарл Рот4627.4Предварительная обработка образца
ПараформальдегидКарл Рот0335.3Кристаллический порошок для получения фиксирующего раствора
азид натрияКарл РотK305.1Профилактика роста микроорганизмов в исходных растворах
tert-ButanolAlfa Aesar33278Дегидратация образца для очищения тканей
TO-PRO-3Thermo FisherT3605Окрашивание нуклеиновых кислот
Triton X-100Carl Roth3051.2Моющее средство
Tween 20AppliChemA4974,0500Моющее
средство<сильное>Разное
5 мл реакция пробиркиEppendorf0030119401Пробирки для образцов
Coverslip, круглая (диаметр: 22 мм)Marienfeld0111620Часть камеры для визуализации
Coverslip, круглая (диаметр: 30 мм)Marienfeld0111700Часть камеры для визуализации
Игла для подкожных инъекций (27 G x ¾ ” [0,40 мм x 20 мм])Б. Браун4657705Заполнение камеры визуализации очищающим раствором
RTV-1 силиконовой резинойWackerElastosil E43Клей для сборки камеры визуализации
Ultimaker CPE 2,85 мм прозрачнымUltimaker8718836374869Сополиэфирная нить для 3D-принтера для печати частей камеры визуализации
<прочное>техническое оборудование и программное обеспечение
3D-принтерUltimakerUltimaker 2+Печать камеры для визуализации
Автоматизированная система погружения в водуLeica15640019Программно-управляемый водяной
насос Настольный орбитальный шейкерElmiDOS-20MИнкубация образцов при комнатной температуре (~150 об/мин)
Настольный орбитальный шейкер с подогревомNew Brunswick ScientificG24 Экологический шейкерИнкубация образца при 37 °°; C (~ 150 об/мин)
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопLeicaDMI 6000 TCS SP5Инвертированный конфокальный микроскоп для визуализации образцов
FijiNIH (ImageJ)программное обеспечение с открытым исходным кодом (v1.52h)Пакет обработки изображений на основе ImageJ
Long Distance Водно-иммерсионный объективLeica15506360HC PL APO 40x/1.10 Вт motCORR CS2
VibratomeLeicaVT1200SПример нарезки
Рабочая станцияDellPrecision 7920Процессор: Intel Xeon Gold 5118
Графический процессор: Nvidia Quadro P5000
Оперативная память: 128 ГБ 2666 МГц DDR4
SSD: 2 ТБ<
сильные>первичные антитела
козы анти-RABV NFriedrich-Loeffler-InstitutМоноспецифическая поликлональная сыворотка против RABV N, полученная в результате иммунизации коз нуклеопротеином N
RABV, экспрессируемым бакуловирусом и очищенным от His-tag, Разведение: 1:400
Кролик против GFAPDakoZ0334Поликлональное антитело (RRID:AB_10013382)
Разведение: 1:100
Кролик против MAP2Abcamab32454Поликлональное антитело (RRID:AB_776174)
Разведение: 1:250
Кролик против RABV P 160-5Friedrich-Loeffler-InstitutМоноспецифическая поликлональная сыворотка кроликов против RABV P, полученная в результате иммунизации кроликов фосфопротеином RABV P (см. ссылку 23: Orbanz et al., 2010)
Разведение: 1:1,000
Secondary антитела
Donkey anti-goatIgG Thermo Fisher Scientificв зависимости от конъюгированного флуорофорВысокопоглощенный
Разведение: 1:500
Donkey anti-mouse IgGThermo Fisher Scientificв зависимости от конъюгированного флуорофораСильно перекрестно поглощенный
Разведение: 1:500
Donkey antirabbit IgGThermo Fisher Scientificв зависимости от конъюгированного флуорофораСильно перекрестно поглощенный
Разведение: 1:500
Goat anti-mouse IgGThermo Fisher Научныйв зависимости от конъюгированного флуорофораВысокоперекрестно абсорбированный
Разведение: 1:500
Козий антикролиацкий IgGThermo Fisher Научныйв зависимости от конъюгированного флуорофораСильно перекрестно абсорбированный
Разведение: 1:500
Антиоксидант

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  3. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  4. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  5. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  6. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  8. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  9. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
  10. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  11. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
  12. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  13. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
  16. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  17. Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091(2017).
  18. WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).
  19. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
  20. Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
  21. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  22. Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
  23. Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3DBABB D15

Похожие статьи