Новые, иммуноспотенцом совместимые методы очистки тканей, как конечная 3D-изображения растворителя очищенных органов позволяют 3D визуализации бешенства вирус инфекции головного мозга и его сложной клеточной среды. Толстые, антитела помечены ломтиками ткани мозга сделаны оптически прозрачными для увеличения глубины изображения и для включения 3D-анализа с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Высокое разрешение 3D Изображение бешенства вирусной инфекции в Solvent-очищенных мозговой ткани
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Визуализация инфекционных процессов в тканях и органах с помощью иммуномаркировки является ключевым методом в современной инфекционной биологии. Способность наблюдать и изучать распределение, тропизм и обилие патогенных микроорганизмов внутри тканей органов дает ключевые данные о развитии и прогрессировании болезней. Используя обычные методы микроскопии, иммуномаркировка в основном ограничивается тонкими секциями, полученными из парафина или замороженных образцов. Однако ограниченная плоскость 2D-изображений этих тонких секций может привести к потере важной информации о сложной структуре инфицированного органа и клеточном контексте инфекции. Современные многоцветные, иммуносно-совместимые методы очистки тканей теперь обеспечивают относительно быстрый и недорогой способ изучения высокообъемных 3D-изображений стеков зараженной вирусом ткани органов. Подвергая ткани органических растворителей, она становится оптически прозрачной. Это соответствует рефракционным индексам образца и в конечном итоге приводит к значительному сокращению рассеяния света. Таким образом, в сочетании с длинными свободными целями рабочего расстояния, большие секции ткани размером до 1 мм могут быть изображены обычными конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (CLSM) с высоким разрешением. Здесь мы описываем протокол для нанесения визуализации глубоких тканей после очистки тканей для визуализации распространения вируса бешенства в инфицированных мозгах для изучения таких тем, как вирусный патогенез, распространение, тропизм и нейровторжение.
Введение
Обычные методы гистологии в основном опираются на тонкие участки тканей органов, которые могут по своей сути обеспечить только 2D-понимание сложной 3D-среды. Хотя это возможно в принципе, 3D-реконструкция из серийных тонких секций требует требовательных технических трубопроводов как для нарезки, так и для последующего выравнивания силико приобретенных изображений1. Кроме того, бесшовная реконструкция z-томов после нарезки микротомов имеет решающее значение, так как механические и вычислительные артефакты могут оставаться из-за неоптимальной регистрации изображений, вызванной неоверплавлением плоскостей изображения, вариациями окрашивания и физи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
RABV-инфицированных, PFA фиксированной архивных мозга материал был использован. Соответствующие экспериментальные исследования на животных были оценены ответственным комитетом по уходу за животными, использованию и этике Государственного управления по сельскому хозяйству, безопасности пищевых продуктов и рыболовству в Мекленбурге-Передней Померании (LALFF M-V) и получили одобрение с разрешения 7221.3-2.1-002/11 (мыши) и 7221.3-1-068/16 (хоррет). Общий уход и методы, используемые в экспериментах на животных, осуществлялись в соответствии с утвержденными руководящими принципами.
ВНИМАНИЕ: Этот протокол использует различные токсичные и / или в....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сочетание iDISCO14 и uDISCO13 в сочетании с CLSM с высоким разрешением дает глубокое понимание пространственно-временного разрешения и пластичности rabV инфекции мозговой ткани и окружающего клеточного контекста.
Использование иммуностоинга фосфопротеина RABV (P), сложные слои инфицированных нейрональных клеток могут быть визуализированы в толстых участках мозга мыши(рисунок 3). Впоследствии можно реконструировать бе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Возрождение и дальнейшее развитие методов очистки тканей в последние годы2,3,4,5,6,7, 9 До 9 , 10 Лет , 11 Год , 12 Лет , 1.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы благодарят Томаса Меттенлейтера и Верену те Камп за критические прочтения рукописи. Эта работа была поддержана Федеральной инициативой передового опыта Мекленбурга Западной Померании и Европейским социальным фондом (ESF) Грантом Коинфектом (ESF/14-BM-A55-0002/16) и интрамуральным грантом на совместные исследования лиссавирусов на Институт Фридриха-Леффлера (Ri-0372).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Реагенты | |||
| Бензиловый спирт | Альфа Аэсар | 41218 | Очищающий реагент |
| Бензилбензоат | Сигма-Олдрич | BB6630-500ML | Очищающий реагент |
| Диметилсульфоксид | Карл Рот | 4720.2 | Различные буферы |
| Дифениловый эфир | Сигма-Олдрич | 240834-100Г | Очищающий реактив |
| DL-α-токоферол | Альфа Аэсар Aesar | A17039 | |
| Сыворотка осляка | Bio-Rad | C06SBZ | Блокирующий реактив |
| Глицин | Карл Рот | 3908.2 | Снижение фона |
| Козья сыворотка | Merck S26-100ML | Блокирующий реагент | |
| Гепарин натриевая соль | Карл Рот | 7692.1 | Актуальность Восстановление |
| Раствор перекиси водорода (30 %) | Карл Рот | 8070.2 | Отбеливающий образец |
| Метанол | Карл Рот | 4627.4 | Предварительная обработка образца |
| Параформальдегид | Карл Рот | 0335.3 | Кристаллический порошок для получения фиксирующего раствора |
| азид натрия | Карл Рот | K305.1 | Профилактика роста микроорганизмов в исходных растворах |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Дегидратация образца для очищения тканей |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Окрашивание нуклеиновых кислот |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Моющее средство |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Моющее |
| средство<сильное>Разное | |||
| 5 мл реакция пробирки | Eppendorf | 0030119401 | Пробирки для образцов |
| Coverslip, круглая (диаметр: 22 мм) | Marienfeld | 0111620 | Часть камеры для визуализации |
| Coverslip, круглая (диаметр: 30 мм) | Marienfeld | 0111700 | Часть камеры для визуализации |
| Игла для подкожных инъекций (27 G x ¾ ” [0,40 мм x 20 мм]) | Б. Браун | 4657705 | Заполнение камеры визуализации очищающим раствором |
| RTV-1 силиконовой резиной | Wacker | Elastosil E43 | Клей для сборки камеры визуализации |
| Ultimaker CPE 2,85 мм прозрачным | Ultimaker | 8718836374869 | Сополиэфирная нить для 3D-принтера для печати частей камеры визуализации |
| <прочное>техническое оборудование и программное обеспечение | |||
| 3D-принтер | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Печать камеры для визуализации |
| Автоматизированная система погружения в воду | Leica | 15640019 | Программно-управляемый водяной |
| насос Настольный орбитальный шейкер | Elmi | DOS-20M | Инкубация образцов при комнатной температуре (~150 об/мин) |
| Настольный орбитальный шейкер с подогревом | New Brunswick Scientific | G24 Экологический шейкер | Инкубация образца при 37 °°; C (~ 150 об/мин) |
| Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Инвертированный конфокальный микроскоп для визуализации образцов |
| Fiji | NIH (ImageJ) | программное обеспечение с открытым исходным кодом (v1.52h) | Пакет обработки изображений на основе ImageJ |
| Long Distance Водно-иммерсионный объектив | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 Вт motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Пример нарезки |
| Рабочая станция | Dell | Precision 7920 | Процессор: Intel Xeon Gold 5118 Графический процессор: Nvidia Quadro P5000 Оперативная память: 128 ГБ 2666 МГц DDR4 SSD: 2 ТБ< |
| сильные>первичные антитела | |||
| козы анти-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Моноспецифическая поликлональная сыворотка против RABV N, полученная в результате иммунизации коз нуклеопротеином N RABV, экспрессируемым бакуловирусом и очищенным от His-tag, Разведение: 1:400 | |
| Кролик против GFAP | Dako | Z0334 | Поликлональное антитело (RRID:AB_10013382) Разведение: 1:100 |
| Кролик против MAP2 | Abcam | ab32454 | Поликлональное антитело (RRID:AB_776174) Разведение: 1:250 |
| Кролик против RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Моноспецифическая поликлональная сыворотка кроликов против RABV P, полученная в результате иммунизации кроликов фосфопротеином RABV P (см. ссылку 23: Orbanz et al., 2010) Разведение: 1:1,000 | |
| Secondary антитела | |||
| Donkey anti-goat | IgG Thermo Fisher Scientific | в зависимости от конъюгированного флуорофор | Высокопоглощенный Разведение: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | в зависимости от конъюгированного флуорофора | Сильно перекрестно поглощенный Разведение: 1:500 |
| Donkey antirabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | в зависимости от конъюгированного флуорофора | Сильно перекрестно поглощенный Разведение: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Научный | в зависимости от конъюгированного флуорофора | Высокоперекрестно абсорбированный Разведение: 1:500 |
| Козий антикролиацкий IgG | Thermo Fisher Научный | в зависимости от конъюгированного флуорофора | Сильно перекрестно абсорбированный Разведение: 1:500 |
Ссылки
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
