Методическая статья

Исследование изменений в Caecum микробиоты после травматического повреждения головного мозга у мышей

DOI:

10.3791/59410

⸱

19 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Emergency and Trauma Center, The International Medical Center, The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлено здесь протокол, чтобы вызвать диффузную черепно-мозговую травму с помощью боковой жидкости ударные устройства следуют сбор содержания caecum для анализа кишечного микробиома.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все больше данных свидетельствует о том, что микробиота-кишка-мозг оси играет важную роль в патогенезе заболеваний головного мозга. Несколько исследований также показывают, что черепно-мозговые травмы вызывают изменения в микрофлоре кишечника. Однако механизмы, лежащие в основе двунаправленной регуляции оси мозга и кишечника, остаются неизвестными. В настоящее время существует несколько моделей для изучения изменений в микрофлоре кишечника после черепно-мозговой травмы. Таким образом, представленное исследование сочетает в себе протоколы для индуцирования черепно-мозговой травмы с помощью боковой жидкости ударные устройства и анализа образцов caecum после травмы для исследования изменений в микрофлоре кишечника. Изменения состава микрофлоры кишечника после черепно-мозговой травмы определяются с помощью секвенирования 16S-rDNA. Этот протокол является эффективным методом изучения взаимосвязи между энтерическими микроорганизмами и черепно-мозговой травмой.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Травматическая черепно-мозговая травма (TBI) является глобальной проблемой общественного здравоохранения и основной причиной смерти и инвалидности у молодых людей1,2. TBI вызывает много смертей каждый год, и выжившие испытывают различные физические, психиатрические, эмоциональные и когнитивные нарушения. Таким образом, ТБИ является тяжелым бременем для семьи пациента и социальных ресурсов. TBI включает в себя как первичную черепно-мозговую травму, которая происходит во время травмы и любые вторичные травмы головного мозга, которые развиваются часов до нескольких месяцев после первоначальной травмы. Вторичная травма головного мозга опосредована несколькими биохимическими каскадами, которые не только вредны для мозга, но и оказывают значительное негативное воздействие на различные системы органов, в ключая желудочно-кишечную систему3.

В настоящее время существует три модели, чтобы вызвать TBI в экспериментах на животных: травма жидкости ударных, контроль коркового воздействия (CCI), и ускорение падения веса. Боковая травма перкуссия жидкости (LFPI) является наиболее часто используемой моделью для установления диффузной черепно-мозговой травмы (DAI)4. Устройство производит черепно-мозговую травму через краниэктомию, применяя краткое давление жидкости импульс анетицирует сяртам. Этот пульс создается ударом маятника. LFPI является воспроизводимым и управляемым методом моделирования для исследования TBI.

Микробиом определяется как коллективные геномы всех микроорганизмов, которые находятся в организме человека. Кишечные микробы, в частности, не только играют важную роль в кишечной гомеостаза и функции, но и регулировать многие аспекты физиологии хозяина и функционирования других органов5. В последние годы, есть все больше доказательств того, что указывает на то, что кишечная микробиота регулировать развитие мозга и функции через мозг кишки осей6. Нарушение микрофлоры кишечника было связано с несколькими расстройствами функции мозга, включая болезнь Паркинсона, расстройства настроения, и аутизм7. В последнее время доклинические исследования также сообщили, что острая черепно-мозговая травма может вызвать изменения в микрофлоре кишечника8,9.

Исследование Treangen et al.10 выявило значительное уменьшение трех видов микробов и увеличение двух видов микробов после ТБИ, индуцированного ТБИ. Эти данные свидетельствуют о том, что модуляция кишечной микробиоты может быть терапевтическим методом в управлении TBI. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе черепно-мозговой травмы вызванных кишечника изменения микрофлоры остаются неизвестными. По этой причине требуется относительно простая и эффективная модель изучения изменений в микрофлоре кишечника после TBI. Таким образом, настоящее исследование представляет собой протокол для изучения изменений в микрофлоре кишечника после TBI у мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все выполненные процедуры были одобрены Экспериментальным комитетом по этике животных Университета Чжэцзяна. Все инструменты и материалы, используемые в хирургии, являются стерильными. TBI proceudre занимает около 20 минут.

1. Уход за животными

  1. Используйте в этом эксперименте мышей C57BL/6J (20-25 г веса) от 5 до 6 недель.
  2. Поддерживайте мышей на свет/темном цикле 12 ч/12 ч и убедитесь, что они получают пищу и воду ad libitum. Обеспечить одинаковое количество пищи и воды как для фиктивных, так и для групп ТБИ на протяжении всего исследования.
  3. Приложить все усилия, чтобы свести к минимуму боль и дискомфорт животных.

2. Индукция черепно-мозговой травмы

  1. Вводят кетамин (80-100 мг/кг)/ксилазин (10 мг/кг) IP для анестезии. Проверьте глубину анестезии с помощью глазного рефлекса или болевого рефлекса. Используйте искусственные слезы или мазь для глаз, чтобы держать глаза от высыхания.
  2. После анестезии, положить мышь в лежачем положении. Используйте температурную грелку для поддержания температуры на уровне 37 градусов по Цельсию во время операции и в течение 30 минут после TBI.
  3. Бритье волос области разреза.
  4. Дезинфицировать кожу головы с 70% этанола с помощью трех чередующихся скрабы, а затем инициировать кожу головы в сагиттальной плоскости.
  5. Используйте щипцы, чтобы утянуть разрез с обеих сторон и немного отделить периостеум.
  6. Используйте маркер, чтобы нарисовать круг (3 мм в диаметре) на правой теменной области черепа, 2 мм от средней линии.
  7. Просверлите череп с помощью электрической дрель. Убедитесь, что этот шаг работает осторожно, чтобы защитить dura от повреждения.
  8. Снимите костной лоскут и разоблачите небольшое костное окно (3 мм в диаметре).
  9. Поместите пластиковую канюлу (внутренний диаметр 2,5 мм, длина 8 мм) над краниотомией и цемента канюли к черепу с помощью зубного акрила.
  10. Заполните канюлю стерильным 0,9% NaCl (нормальный солен) с помощью шприца (5 мл), чтобы убедиться, что в канюле нет пузырьков.
  11. Включите осциллоскоп и усилитель и убедитесь, что трубка высокого давления боковой жидкости ударных травмы (LFPI) устройство не имеет пузырьков воздуха. Проверьте устройство, доставив около 10 импульсов, пока оно не даст устойчивый сигнал. Отрегулируйте угол исходного положения маятника, чтобы достичь интенсивности пульса около 2,0 атм.
  12. Подключите канюль травмы к устройству LFPI. Побудить черепно-мозговую травму, нажав на курок и выпустив маятник. Затем получить пульс и передать его в дюру через всю закрытую заполненную жидкостью трубную систему.
  13. Оперируйте мышей в фиктивной группе с той же хирургической процедурой. Не выполняйте LFPI.

3. Послеоперационное лечение

  1. После индуцирования черепно-мозговой травмы, удалить пластиковые канюли и шов разреза. Во время операции вводят бупренорфин (2 мг/кг) СЗ или ИС, а затем каждые 6-12 ч в течение трех дней.
  2. Положите мышь на грелку, пока она не будет амбулаторной. Установите температуру грелки до 37 градусов по Цельсию для ускорения анестезии реанимации.
  3. Положите мышь обратно в клетку и управлять пищей и водой объявление libitum.

4. Лапаротомия и коллекция образцов из caecum

  1. Эвтаназия мышей CO2 с последующим вывихом шейки матки в соответствующие временные моменты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, выбранные точки времени были 1 ч, 6 ч, 1 d, 3 d, и 7 d посттравматическая черепно-мозговая травма для анализа динамической эволюции кишечной микробиоты.
  2. Удалите волосы с поверхности живота. Дезинфекция брюшной полости с 70% этанола.
  3. Поместите стерильную драпировку над мышью. Сделайте разрез из нижней части живота средней линии, чуть выше prepuce у мышей мужского пола.
  4. После того, как кишечник подвергается, найти cecum и аккуратно отделил его от других кишечных путей. Избегайте схватив cecum с зубчатыми или острыми щипками. Используйте травматические щипцы, такие как щипцы Adson с serrations.
  5. Вырезать caecum с острыми ножницами.
  6. Извлеките содержимое caecum вручную на стерильную повязку и храните содержимое в микроцентрифуговых трубках 1,5 мл.
  7. Храните содержимое caecum при -80 градусах По Цельсию до анализа микробиома.

5. Извлечение ДНК и секвенирование и анализ данных 16S-rDNA

  1. Изоляция ДНК от кала
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступный набор изоляции ДНК (Таблица материалов) был использован для этого эксперимента.
    1. Используйте скальпель, чтобы очистить 300 мг кала в 2 мл микроцентрифуговой трубки и поместите трубку на лед.
    2. Добавьте 1 мл подавляемого буфера к каждому образцу. Vortex непрерывно в течение 1 мин или до тех пор, пока кала образец тщательно гомогенизированы.
    3. Centrifuge образец на максимальной скорости в течение 1 мин, чтобы гранулы частиц кала.
    4. Пипетка 2 л протеиназа K в новую микроцентрифугную трубку 2 мл. Пипет каст 600 л супернатанта от шага 5.1.3 в микроцентрифугную трубку 2 мл, содержащую протеиназа K. Затем добавьте 600 л буфера 1 и вихрь на 15 с.
    5. Инкубировать образец при 70 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
    6. Добавьте 600 л 100% этанола в лизат (коэффициент 1:1) и смешайте путем вихря. Центрифуги на максимальной скорости кратко удалить капли из внутренней крышки трубки.
    7. Нанесите 600 л lysate на колонку спина. Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 мин. Отбросьте поток через. Повторите этот шаг еще раз. Затем перенесите колонку в новую трубку для сбора 2 мл.
    8. Откройте колонку спина и добавьте 500 зл. Центрифуга на максимальной скорости в течение 1 мин. Снимите колонку и поместите ее в новую трубку для сбора 2 мл.
    9. Добавьте в колонку 500 кл.л. буфера 3. Центрифуга на максимальной скорости в течение 3 мин. Отбросьте поток через. Повторите процесс центрифугации один раз, чтобы обеспечить буфер 3 полностью eluted.
    10. Поместите вращательную колонку в новую трубку 2 мл трубки сбора и пипетка 200 Л. буфера 4 непосредственно на мембрану. Инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре (RT), затем центрифуги на максимальной скорости в течение 1 мин, чтобы elute ДНК.
  2. 16S-rDNA секвенирования и анализа данных
    1. Используйте 20-30 нг ДНК для генерации ампиконов.
    2. Используйте коммерчески доступные грунтовки, предназначенные для относительно сохранимых регионов, граничащих с гиперпеременными регионами V3 и V4 бактерий 16S rDNA. В настоящем исследовании были использованы форвардные праймеры, содержащие последовательность "CCTACGGRRCASCASCAGKVRVGAAT" и реверсивные грунтовки, содержащие последовательность "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC".
    3. Сделайте смесь реакций ПЦР, добавив 2,5 л буфера 1, 2 зл и dNTPs, 1 зл и l каждой грунтовки, 0,5 л ДНК-полимеразы и 20 нг шаблонДНК в трубке. Используйте ddH2O, чтобы настроить систему реакции до 25 Л.
    4. Установите параметры реакции ПЦР следующим образом: выполните предденатурацию при 94 градусах по Цельсию в течение 3 мин один раз. Выполните денатурацию при 94 градусах по Цельсию на 5 с, аннеал при 57 градусах по Цельсию на 90 с, расширяйте при 72 градусах по 10 с и повторяйте это 24x.
    5. Выполните секвенирование PE250/300 в паре в соответствии с инструкцией производителя и используйте пакет анализа данных для анализа данных 16S rRNA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте секвенирование ДНК и анализ данных были в первую очередь выполнены профессиональной компанией по секвенированию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Создание TBI показано на рисунке 1. После анестезии и дезинфекции, кожа головы была разрезана sagittally(рисунок 1A). Краниотомия (3 мм в диаметре) была трефина в череп над правой теменной коры с электрической дрелью, dura была сохранена в целости и сохранности(Рисунок 1B, C). Пластиковая канюля травмы была помещена над окном кости и зацементирована к черепу с помощью зубного акрила<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен простой и эффективный протокол для определения изменений в микрофлоре цекалы после TBI у мышей. Индукция черепно-мозговой травмы и сбор образцов содержания цекума являются важнейшими частями протокола.

Несмотря на исследователи изучили изменения кишечной микробиоты после TBI, черепно-мозговая травма, используемая в этих исследованиях были CCI-8 и падение веса / воздействие индуцированных моделей9. Тем не менее, модель CCI в основном р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы искренне благодарят Baohong Wang за ее техническое руководство.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для выделения ДНК QIAGEN51604Для быстрого очищения геномной ДНК из образцов кала
Сервис анализа геновGENEWIZСервис анализа генов
ГрелкаShanghai SAFE Biotech Co.грелкиTR-200
Первая аффилированная больница, Школа медицины, УниверситетИнжектор
Устройство LFPIВирджиния
Университет Содружества		FP302Устройство LFPI
Микро дрель для черепаRWD Life Science78061Микро дрель для черепа
Повидон ЙодПервая аффилированная больница, Школа медицины, Чжэцзянский университетПовидон-йод
Инжектор для Чжэцзян

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332(2017).
  2. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
  3. Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S. Systemic manifestations of traumatic brain injury. Handbook of Clinical Neurology. 127, 205-218 (2015).
  4. Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
  5. Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
  6. Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
  7. Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
  8. Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
  9. Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
  10. Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757(2018).
  11. Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  12. Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
  13. Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

16S

Похожие статьи