Методическая статья

Анализ развития сердечной камеры во время эмбриогенеза мыши с помощью эпифлуоресцентного вся гора

DOI:

10.3791/59413

⸱

17 апреля 2019 г.

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протоколы для изучения развития сердца мыши, с помощью микроскопии всю гору epifluorescent эмбрионов мыши, расчлененный от желудочков конкретных док 2v-tdTomato репортер забивные мышей. Этот метод позволяет нам непосредственно визуализировать каждый этап формирования желудочка во время разработки сердца мыши без трудоемкого гистохимические методы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель настоящего Протокола заключается в описания метода для визуализации желудочков палат эмбриона мыши во время разработки сердца с помощью желудочков конкретных флуоресцентные репортер стук в мышах (док 2v-tdTomato мышей) и dissection зародышей мыши. Сердце развития включает в себя формирование трубки линейной сердце, сердце трубки циклов и четыре камеры septation. Эти сложные процессы сохраняются весьма всех позвоночных. Сердце эмбриона мыши широко используется для развития исследований сердца. Однако из-за их крайне небольшой размер, рассекает мыши эмбриональные сердца технически сложным. Кроме того визуализация сердечной камеры формирования часто нуждается в гибридизации situ, бета галактозидазы окрашивание с помощью LacZ репортер мышей, или иммуноокрашивания секционного эмбриональных сердец. Здесь мы опишем, как вскрыть мыши эмбриональные сердца и непосредственно визуализировать желудочков камеры формирования док 2v-tdTomato мышей, используя всю гору epifluorescent микроскопии. С помощью этого метода возможность непосредственно изучить сердце трубки формирования и циклов и четыре камеры формирования без дальнейших экспериментальных манипуляций зародышей мыши. Хотя линия стук в мыши репортер док 2v-tdTomato используется в этот протокол в качестве примера, этот протокол может применяться на другие линии сердца конкретных флуоресцентные репортер трансгенные мыши.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Камеры формирования во время разработки сердца является сложным процессом перехода через несколько морфологически различные эмбриональных стадий1,2. Форме полумесяца сердечной прогениторных клеток населения образует трубу линейной сердца и затем подвергается удлинение и циклы в форму спирали развивающихся сердца. После его septation процесса развивающегося сердце превращается в четырех-сердце. Перерыва какого-либо из этих процессов в результате пороков развития сердца. Таким образом важно понять молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования палаты во время разработки сердца. Несмотря на многочисленные предыдущие исследования по развитию сердца наше понимание этого сложного процесса, остается ограниченным.

Гибридизации in situ, иммуногистохимия и бета галактозидазы окрашивание с помощью LacZ репортер мышей широко использовался для изучения формирования палаты во время разработки сердца мыши, снабдив сердечной конкретных или камеры конкретных структурных генов или белки (например, НПЛН, переворот-TFII, Irx4, док 2a и док 2v)3,4,5,6,,78,9,10. Однако, эти эксперименты с использованием эмбрионов мыши требуется значительное время и опыт, потому что несколько различных экспериментальных шаги должны быть выполнены последовательно11. Здесь мы описываем метод простой всю гору epifluorescent микроскопии визуализировать развивающихся желудочков с использованием эмбрионов, расчлененный от док 2v-tdTomato репортер мышей стук в12. Преимущество этого метода по сравнению с ранее использовавшихся методов, чтобы избежать сложных экспериментальные шаги, которые часто может создать экспериментальные варианты. Основной целью настоящего Протокола является описать как вскрыть зародышей мыши и развивающихся сердца и изучить каждый этап развития сердечной камеры мыши без утомительного гистохимические экспериментов. Этот метод легко может применяться для оценки развития сердца, с использованием различных других трансгенные мыши линии маркировки ранней сердечной маркеров (например, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Роза mT /MG14, Nkx2-5Cre: Роза mT/мг14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Роза mT/мг14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15и TgMef2c-AHF-GFP16 мышей).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все животные процедуры выполнялись с одобрения Вандербильта университета медицинский центр институциональных животное уход и использование Комитета.

1. мышь эмбриона коллекции и рассечение

  1. Мате женского док 2v-tdTomato 8-10 неделя+ / мышей с 8-10 недельных док 2v-tdTomato+ / мышей-самцов для получения док 2v-tdTomato+/ +, док 2v-tdTomato+ / и док 2v-tdTomato- / - эмбрионов.
  2. Проверьте плотин для вагинальных свечей каждое утро. Полдень в день обнаружения Вагинальные вилка рассматривается как E0.5.
    Примечание: Вагинальный осмотр для выявления Вагинальные вилка должна быть выполнена в первой половине дня (в течение 8-24 ч после сексуальной активности), так как Вагинальные вилка может быть потеряно в течение дня.
  3. Усыпить беременных плотин в разные дни поста coitum (например, E8.5, E10.5 и E12.5) с использованием CO2 ингаляции следуют шейки матки дислокации.
  4. Положите лежачем мышей и спрей 70% этанол на брюшке мышей, чтобы избежать загрязнения волос мыши во время вскрытия.
  5. Откройте брюшной полости, разрез кожи и брюшной стенки, используя острые ножницы хирургические и forcep.
  6. Найдите двусторонних маточные рожки в спинной части брюшной полости.
  7. Отделить всю матку, тщательно резки выше яйцеводов с обеих сторон, используя острые ножницы хирургические и forcep.
  8. Поместите всю расчлененных матки в 10см Петри с ледяной PBS и осторожно отделить каждый Амниотический мешок вдоль рога матки, используя острые ножницы хирургические и forcep.
  9. Перевод каждого эмбриона на отдельных скважин 6 хорошо пластины, наполненный ледяной PBS с помощью пипетки передачи.
  10. Под микроскопом рассечения открыть Амниотический мешок и подвергать каждого эмбриона, отрезав пуповины, используя острые ножницы хирургические и forcep в отдельных хорошо 6 хорошо плиты с ледяной PBS.
  11. Отделка из экстра эмбриональных тканей как можно больше не повреждая зародыша, используя острые ножницы хирургические и forcep.
    Примечание: Вся гора epifluorescent томографии всего мыши эмбриона обычно выполняется перед рассекает развивающихся сердце, как описано ниже.
  12. Вырежьте голову эмбриона, используя острые ножницы хирургические и forcep и передачи в 1,5 мл трубку с 100 мкл буфера A (25 мм NaOH и 0,2 мм ЭДТА) для генотипирования коррелируют с результатами epifluorescent изображений.
  13. Открыть сундук эмбриона с помощью тонкой щипцы, удалить сердце от легких и сосудистую, используя острые ножницы хирургические и щипцы и передача расчлененных сердце эмбриона в колодец 12 хорошо плиты с PBS с помощью пипетки передачи. Все рассечение процедуры завершаются под микроскопом рассечения волоконно-оптического микроскопа осветитель.
    Примечание: Технически трудно анализировать из эмбриональных сердца мыши на E8.0 или E8.5, из-за их чрезвычайно малые размеры и хрупкой структуры. Ранних эмбриональных сердца (то есть, E8.0 и E8.5) может быть рассмотрен в рамках всей горе эмбриона без вскрытия.

2. всего гора эпифлуоресцентного изображений

  1. Поместите 12 хорошо пластину с мыши эмбриональные сердца под epifluorescent, рассекает микроскопом.
  2. Под epifluorescent, пройдя микроскопа с помощью тонкой щипцы позиция эмбриональных сердце что развивающиеся желудочки расположены недалеко от экзаменатора.
  3. Настройка фокусировки изображения, используя цель 0,63 x (диапазон масштабирования между 3,15 x и 18,9 x) в режиме светлые области.
  4. Возьмите светлые области воздействия и захватить несколько изображений. Обычно изображения были получены путем одной секунды воздействия. Однако время экспозиции может варьироваться в зависимости от освещения и specificationss камеры и должны быть оптимизированы для каждой установки.
  5. Выключить волоконно оптический микроскоп осветитель и установите фильтр для красной флуоресценцией (Ex545 Нм/Em 605 Нм) для визуализации tdTomato выражение.
  6. Перенастраивать фокусировки изображения, если необходимо.
  7. Отрегулируйте яркость и контрастность, взять красный флуоресцентные воздействия и захватить несколько изображений.
    Примечание: Обычно используются следующие настройки изображения: 1 s воздействия раз, 2 x прибыль, 1.0 насыщенность и 1.0 гамма-коррекции. Оптимальные настройки должна быть оптимизирована для каждого эксперимента. После того, как определяется оптимальная установка, те же настройки необходимо использовать для всего эксперимента.

3. генотипирования

  1. Сварить образцы из шага 1.12 1 ч при 100 ° C.
  2. Центрифуга для 2 мин на 11,360 x g, передачи 20 мкл супернатант в новой 1,5 мл трубку с 20 мкл буфера B (40 мм Tris-HCl, pH 5.5) и смешивать их.
  3. Взять 4.5 мкл смешанных супернатант из шага 3.2 как шаблон ДНК, объединить его с 0.5 мкл каждого из конкретных вперед и обратного грунтовки (10 мкм), 10 мкл предварительно смешанные полимеразы и реакция буфера (2 x) (см. Таблицу материалы), а затем добавить воды в целом v olume 20 мкл. грунтовка последовательностей являются как указано ниже.
    F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
    R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
    F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
    R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3'
  4. Запуск полимеразной цепной реакции (ПЦР) с программой следующим ПЦР (Таблица 1 и Таблица 2).
  5. Запуск ПЦР образцов и лестница ДНК на геле агарозы 1% на 140 V в 1 x TAE (Tris ацетат ЭДТА) буфера (40 мм трис ацетат и 1 мм ЭДТА) 25 мин использовать 100 лестница ДНК bp для оценки размера диапазоны PCR.
  6. Поместите гель ДНК на УФ transilluminator для выявления ДНК полос и включите УФ света.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ходе развития сердца док 2v считается ранних маркер для желудочковой палата спецификации17. Как показано на рисунке 1, мы разобрал весь зародышей мыши и эмбриональных сердца от док 2v-tdTomato репортер забивные мышей и изучены док 2v-tdTomato репортер выражение во время разработки сердца. В док 2v-tdTomato репортер стук в мышей, учредительного tdTomato выражение в самом развивающемся визуализируется помощью эпифлуоресцентного всю гор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод, описанный здесь является относительно простым для изучения развития желудочковой камеры, без выполнения трудоемких эксперименты на этикетке желудочка или сердечной конкретных структурных генов и белков. Таким образом этот метод минимизирует технические изменчивости, которые часто были найдены в immunostained сердце секций.

Есть два критических шагов для успешного выполнения этого метода, включая точную оценку эмбриональных возраста мышей и рассечение эмбриональных сердец. Мы оцениваем п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIH R03 HL140264 (ю.-Дж. N) и Галааде наук исследования ученый программа (ю.-Дж. N).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
препарирующий микроскопLeicaMZ125
ДНК-лестница (100.н)G2101
эпифлуоресцентный препарирующий LeicaM165 FC
GoTaq Green master MixPromegaM712
ПЦР машина (мастер-циклер)Eppendorf6336000023
Эпифлуоресцентный микроскоп Promega

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
  2. Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
  3. Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
  4. Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
  5. Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
  6. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  7. Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
  8. Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
  9. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
  10. Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
  11. Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
  12. Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
  13. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  14. Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
  15. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  16. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
  17. O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MLC 2v tdTomato

Похожие статьи