Анализ развития сердечной камеры во время эмбриогенеза мыши с помощью эпифлуоресцентного вся гора

Summary

Мы представляем протоколы для изучения развития сердца мыши, с помощью микроскопии всю гору epifluorescent эмбрионов мыши, расчлененный от желудочков конкретных док 2v-tdTomato репортер забивные мышей. Этот метод позволяет нам непосредственно визуализировать каждый этап формирования желудочка во время разработки сердца мыши без трудоемкого гистохимические методы.

Abstract

Цель настоящего Протокола заключается в описания метода для визуализации желудочков палат эмбриона мыши во время разработки сердца с помощью желудочков конкретных флуоресцентные репортер стук в мышах (док 2v-tdTomato мышей) и dissection зародышей мыши. Сердце развития включает в себя формирование трубки линейной сердце, сердце трубки циклов и четыре камеры septation. Эти сложные процессы сохраняются весьма всех позвоночных. Сердце эмбриона мыши широко используется для развития исследований сердца. Однако из-за их крайне небольшой размер, рассекает мыши эмбриональные сердца технически сложным. Кроме того визуализация сердечной камеры формирования часто нуждается в гибридизации situ, бета галактозидазы окрашивание с помощью LacZ репортер мышей, или иммуноокрашивания секционного эмбриональных сердец. Здесь мы опишем, как вскрыть мыши эмбриональные сердца и непосредственно визуализировать желудочков камеры формирования док 2v-tdTomato мышей, используя всю гору epifluorescent микроскопии. С помощью этого метода возможность непосредственно изучить сердце трубки формирования и циклов и четыре камеры формирования без дальнейших экспериментальных манипуляций зародышей мыши. Хотя линия стук в мыши репортер док 2v-tdTomato используется в этот протокол в качестве примера, этот протокол может применяться на другие линии сердца конкретных флуоресцентные репортер трансгенные мыши.

Introduction

Камеры формирования во время разработки сердца является сложным процессом перехода через несколько морфологически различные эмбриональных стадий^1,2. Форме полумесяца сердечной прогениторных клеток населения образует трубу линейной сердца и затем подвергается удлинение и циклы в форму спирали развивающихся сердца. После его septation процесса развивающегося сердце превращается в четырех-сердце. Перерыва какого-либо из этих процессов в результате пороков развития сердца. Таким образом важно понять молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования палаты во время разработки сердца. Несмотря на многочисленные предыдущие исследования по развитию сердца наше понимание этого сложного процесса, остается ограниченным.

Гибридизации in situ, иммуногистохимия и бета галактозидазы окрашивание с помощью LacZ репортер мышей широко использовался для изучения формирования палаты во время разработки сердца мыши, снабдив сердечной конкретных или камеры конкретных структурных генов или белки (например, НПЛН, переворот-TFII, Irx4, док 2a и док 2v)^{3,4,5,6,,78,9,10}. Однако, эти эксперименты с использованием эмбрионов мыши требуется значительное время и опыт, потому что несколько различных экспериментальных шаги должны быть выполнены последовательно¹¹. Здесь мы описываем метод простой всю гору epifluorescent микроскопии визуализировать развивающихся желудочков с использованием эмбрионов, расчлененный от док 2v-tdTomato репортер мышей стук в¹². Преимущество этого метода по сравнению с ранее использовавшихся методов, чтобы избежать сложных экспериментальные шаги, которые часто может создать экспериментальные варианты. Основной целью настоящего Протокола является описать как вскрыть зародышей мыши и развивающихся сердца и изучить каждый этап развития сердечной камеры мыши без утомительного гистохимические экспериментов. Этот метод легко может применяться для оценки развития сердца, с использованием различных других трансгенные мыши линии маркировки ранней сердечной маркеров (например, Mesp1Cre: Rosa26EYFP¹³, Isl1Cre: Rosa26EYFP¹³, Hcn4H2BGFP¹⁴, Hcn4Cre: Роза mT /MG¹⁴, Nkx2-5Cre: Роза mT/мг¹⁴, Hcn4-eGFP¹⁵, Isl1Cre: Роза mT/мг¹⁴, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato¹⁵и TgMef2c-AHF-GFP¹⁶ мышей).

Protocol

Все животные процедуры выполнялись с одобрения Вандербильта университета медицинский центр институциональных животное уход и использование Комитета.

1. мышь эмбриона коллекции и рассечение

1. Мате женского док 2v-tdTomato 8-10 неделя^{+ /} мышей с 8-10 недельных док 2v-tdTomato^{+ /} мышей-самцов для получения док 2v-tdTomato^{+/ +}, док 2v-tdTomato^{+ /} и док 2v-tdTomato^{- / -} эмбрионов.
2. Проверьте плотин для вагинальных свечей каждое утро. Полдень в день обнаружения Вагинальные вилка рассматривается как E0.5.
   Примечание: Вагинальный осмотр для выявления Вагинальные вилка должна быть выполнена в первой половине дня (в течение 8-24 ч после сексуальной активности), так как Вагинальные вилка может быть потеряно в течение дня.
3. Усыпить беременных плотин в разные дни поста coitum (например, E8.5, E10.5 и E12.5) с использованием CO₂ ингаляции следуют шейки матки дислокации.
4. Положите лежачем мышей и спрей 70% этанол на брюшке мышей, чтобы избежать загрязнения волос мыши во время вскрытия.
5. Откройте брюшной полости, разрез кожи и брюшной стенки, используя острые ножницы хирургические и forcep.
6. Найдите двусторонних маточные рожки в спинной части брюшной полости.
7. Отделить всю матку, тщательно резки выше яйцеводов с обеих сторон, используя острые ножницы хирургические и forcep.
8. Поместите всю расчлененных матки в 10см Петри с ледяной PBS и осторожно отделить каждый Амниотический мешок вдоль рога матки, используя острые ножницы хирургические и forcep.
9. Перевод каждого эмбриона на отдельных скважин 6 хорошо пластины, наполненный ледяной PBS с помощью пипетки передачи.
10. Под микроскопом рассечения открыть Амниотический мешок и подвергать каждого эмбриона, отрезав пуповины, используя острые ножницы хирургические и forcep в отдельных хорошо 6 хорошо плиты с ледяной PBS.
11. Отделка из экстра эмбриональных тканей как можно больше не повреждая зародыша, используя острые ножницы хирургические и forcep.
    Примечание: Вся гора epifluorescent томографии всего мыши эмбриона обычно выполняется перед рассекает развивающихся сердце, как описано ниже.
12. Вырежьте голову эмбриона, используя острые ножницы хирургические и forcep и передачи в 1,5 мл трубку с 100 мкл буфера A (25 мм NaOH и 0,2 мм ЭДТА) для генотипирования коррелируют с результатами epifluorescent изображений.
13. Открыть сундук эмбриона с помощью тонкой щипцы, удалить сердце от легких и сосудистую, используя острые ножницы хирургические и щипцы и передача расчлененных сердце эмбриона в колодец 12 хорошо плиты с PBS с помощью пипетки передачи. Все рассечение процедуры завершаются под микроскопом рассечения волоконно-оптического микроскопа осветитель.
    Примечание: Технически трудно анализировать из эмбриональных сердца мыши на E8.0 или E8.5, из-за их чрезвычайно малые размеры и хрупкой структуры. Ранних эмбриональных сердца (то есть, E8.0 и E8.5) может быть рассмотрен в рамках всей горе эмбриона без вскрытия.

2. всего гора эпифлуоресцентного изображений

1. Поместите 12 хорошо пластину с мыши эмбриональные сердца под epifluorescent, рассекает микроскопом.
2. Под epifluorescent, пройдя микроскопа с помощью тонкой щипцы позиция эмбриональных сердце что развивающиеся желудочки расположены недалеко от экзаменатора.
3. Настройка фокусировки изображения, используя цель 0,63 x (диапазон масштабирования между 3,15 x и 18,9 x) в режиме светлые области.
4. Возьмите светлые области воздействия и захватить несколько изображений. Обычно изображения были получены путем одной секунды воздействия. Однако время экспозиции может варьироваться в зависимости от освещения и specificationss камеры и должны быть оптимизированы для каждой установки.
5. Выключить волоконно оптический микроскоп осветитель и установите фильтр для красной флуоресценцией (Ex545 Нм/Em 605 Нм) для визуализации tdTomato выражение.
6. Перенастраивать фокусировки изображения, если необходимо.
7. Отрегулируйте яркость и контрастность, взять красный флуоресцентные воздействия и захватить несколько изображений.
   Примечание: Обычно используются следующие настройки изображения: 1 s воздействия раз, 2 x прибыль, 1.0 насыщенность и 1.0 гамма-коррекции. Оптимальные настройки должна быть оптимизирована для каждого эксперимента. После того, как определяется оптимальная установка, те же настройки необходимо использовать для всего эксперимента.

3. генотипирования

1. Сварить образцы из шага 1.12 1 ч при 100 ° C.
2. Центрифуга для 2 мин на 11,360 x g, передачи 20 мкл супернатант в новой 1,5 мл трубку с 20 мкл буфера B (40 мм Tris-HCl, pH 5.5) и смешивать их.
3. Взять 4.5 мкл смешанных супернатант из шага 3.2 как шаблон ДНК, объединить его с 0.5 мкл каждого из конкретных вперед и обратного грунтовки (10 мкм), 10 мкл предварительно смешанные полимеразы и реакция буфера (2 x) (см. Таблицу материалы), а затем добавить воды в целом v olume 20 мкл. грунтовка последовательностей являются как указано ниже.
   F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
   R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
   F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
   R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3'
4. Запуск полимеразной цепной реакции (ПЦР) с программой следующим ПЦР (Таблица 1 и Таблица 2).
5. Запуск ПЦР образцов и лестница ДНК на геле агарозы 1% на 140 V в 1 x TAE (Tris ацетат ЭДТА) буфера (40 мм трис ацетат и 1 мм ЭДТА) 25 мин использовать 100 лестница ДНК bp для оценки размера диапазоны PCR.
6. Поместите гель ДНК на УФ transilluminator для выявления ДНК полос и включите УФ света.

Results

В ходе развития сердца док 2v считается ранних маркер для желудочковой палата спецификации¹⁷. Как показано на рисунке 1, мы разобрал весь зародышей мыши и эмбриональных сердца от док 2v-tdTomato репортер забивные мышей и изучены док 2v-tdTomato репортер выражение во время разработки сердца. В док 2v-tdTomato репортер стук в мышей, учредительного tdTomato выражение в самом развивающемся визуализируется помощью эпифлуоресцентного всю гор...

Discussion

Метод, описанный здесь является относительно простым для изучения развития желудочковой камеры, без выполнения трудоемких эксперименты на этикетке желудочка или сердечной конкретных структурных генов и белков. Таким образом этот метод минимизирует технические изменчивости, которые часто были найдены в immunostained сердце секций.

Есть два критических шагов для успешного выполнения этого метода, включая точную оценку эмбриональных возраста мышей и рассечение эмбриональных сердец. Мы оцениваем п...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
препарирующий микроскоп	Leica	MZ125
ДНК-лестница (100.н)		G2101
эпифлуоресцентный препарирующий Leica		M165 FC
GoTaq Green master Mix	Promega	M712
ПЦР машина (мастер-циклер)	Eppendorf	6336000023