Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка риска колоректального рака и распространенности по обнаружению целостности ДНК стула

6.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59426

⸱

8 июня 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 2Diatech Pharmacogenetics srl

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Представленный диагностический комплект FL-DNA является экономичным и удобным для пользователя методом определения надежной вероятности наличия колоректального рака.

Аннотация

В настоящее время ДНК стула может быть изолирована и проанализирована несколькими методами. Длинные фрагменты ДНК в стуле могут быть обнаружены с помощью анализа qPCR, который обеспечивает надежную вероятность наличия преднеопластических или неопластических колоректальных поражений. Этот метод, называемый флуоресценции долго ДНК (FL-ДНК), является быстрой, неинвазивной процедурой, которая является улучшением на первичной системы профилактики. Этот метод основан на оценке целостности фекальной ДНК путем количественного усиления конкретных целей геномной ДНК. В частности, оценка фрагментов ДНК длиной более 200 вт позволяет выявлять пациентов с колоректальными поражениями с очень высокой специфичностью. Тем не менее, эта система и все имеющиеся в настоящее время тесты ДНК стула представляют некоторые общие проблемы, которые необходимо решить (например, частота, с которой тесты должны быть проведены и оптимальное количество образцов стула, собранных в каждый момент для каждого человека). Тем не менее, основным преимуществом FL-ДНК является возможность использовать его в связи с тестом, который в настоящее время используется в программе скрининга CRC, известной как иммунохимический фекальный оккультный анализ крови (iFOBT). Действительно, оба теста могут быть выполнены на одной и той же выборке, что снижает затраты и достигает лучшего прогнозирования возможного присутствия колоректальных поражений.

Введение

Колоректальный рак (CRC) происходит от многоступенчатого процесса, в котором здоровый эпителий медленно развивается в аденомы или полипы, которые прогрессируют в злокачественные канциномы с течениемвремени 1,2. Несмотря на высокий уровень заболеваемости КРП, за последнее десятилетие наблюдается тенденция к снижению долисмертей. Действительно, ранние диагностические инструменты, принятые в программах скрининга, привели к раннему выявлению и удалению преднеопластических аденомы или полипов4. Однако из-за различных технических ограничений ни один из этих методов не является оптимальным. Действительно, для того, чтобы улучшить чувствительность и специфичность, многие тесты ДНК стула были предложены в одиночку или в сочетании с текущей обычной диагностические тесты5,6.

Как правило, здоровая слизистая оболочка линяет в фекальный поток апоптотические колоноциты, в то время как больная слизистая оболочка отслаивается от неапоптотической колоноцитов. Фрагменты 200 bp или более в длину характеризуют неапоптотической ДНК. Эта ДНК называется длинной ДНК (L-ДНК) и стала утилизательным биомаркером для ранней диагностики CRC. L-ДНК может быть выделена из образца стула и количественно qPCR с помощью в пробирке диагностический FL-ДНК комплект7,,88,9,10,11,12.

Тест состоит из двух анализов для обнаружения фрагментов FL-ДНК в диапазоне от 138 bp до 339 bp. Каждый анализ позволяет усиление FL-ДНК (FAM), а также всплеск в ДНК (HEX). Для обеспечения оптимального усиления всех фрагментов тест был разделен на два анализа (названные "А" и "Б"). Ассай обнаруживает две области экзона 14 гена APC (NM_001127511) и фрагмент экзона 7 гена TP53 (NM_001276760). В ассе обнаруживается фрагмент экзона 14 гена APC (NM_001127511) и две области экзонов 5 и 8 гена TP53 (NM_001276760). Анализы не различают обнаруженные регионы. Пик ДНК соответствует ДНК лосося Oncorhynchus кета-лосик и позволяет проверить, что процедура была сделана должным образом и проверяет на возможное наличие ингибиторов, которые могут дать ложные отрицательные результаты. Концентрация FL-ДНК оценивается по абсолютной количественной оценке с использованием стандартного метода кривой и выражается как нг/реакция.

FL-DNA метод неинвазивный и недорогой тест ДНК стула, который, в сочетании с иммунохимическим на основе фекальных оккультных анализ крови (iFOBT), в настоящее время используется в программах скрининга CRC и позволяет лучше прогнозы CRC и / или высокого риска аденомы поражений12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Пациенты были набраны в Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) из Meldola (FC, Италия) в период с 2013 по 2015 год. Зачисленные пациенты были в протокол IRSTB002, утвержденный Комитетом по этике IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). Все методы осуществлялись в соответствии с соответствующими руководящими принципами и положениями. Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов.

1. Извлечение ДНК из стула

  1. Используйте комплект для подготовки образцов стула (см. Таблица материалов). Выберите и обработайте фекальный материал, выполняя экстракции в соответствии с инструкциями производителя. Усиль очищенную ДНК непосредственно или хранить при -20 градусов по Цельсию для последующего анализа.

2. Подготовка положительного контроля, стандартов, шипов в ДНК и клинических образцов

  1. Подготовка стандартов и образцов
    1. Чтобы подготовить положительный контроль, стандарты, всплеск ДНК, и все клинические образцы, центрифуги аликот положительного контроля, стандартов и шип-в ДНК, а затем resuspend каждый реагент, добавив правильное количество предоставленной воды (см. ниже). Затем тщательно вихрем положительный контроль, стандарт, и шип в ДНК, то центрифуга на 10 с. Для полной перезагрузки сухих реагентов храните жидкие реагенты при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут перед использованием.
      1. Положительным контролем является ДНК человека в сухом формате. Отрежь каждый aliquot с 750 л воды.
      2. Пик омисаение ДНК лосося (Oncorhynchus keta) ДНК, которая используется в качестве экзогенного внутреннего контроля для проверки возможного присутствия ингибиторов в образцах ДНК, извлеченных из стула. Отрежь каждый aliquot с 100 л воды.
    2. Чтобы подготовить стандартную кривую, произвеможно четыре разбавления 1:5, начиная с биржевого раствора. Стандартные точки должны быть 10 нг/реакция, 2 нг/реакция, 0.4 нг/реакция, и 0.08 ng/reaction.
  2. Приготовление 1x шип-в ДНК
    1. Подготовьте контроль ДНК непосредственно перед использованием.
    2. Подготовьте 1x спик-в контроле ДНК путем смешивания 5 зл FL-DNa шип с 20 зл стерильной воды. Количество 1x шип-в ДНК-контроль образцов будет подготовлен в соответствии с числом образцов для анализа, а также положительный контроль.
  3. Подготовка образцов
    1. Смешайте 75 л образцов (клинические образцы или положительный контроль) с 25 зл 1x шип-в ДНК, что дает общий объем 100 Зл.

3. Усиление и определение значения FL-ДНК с помощью qPCR Easy PGX

ПРИМЕЧАНИЕ: Полное усиление смеси, содержащие конкретные грунтовки и зонды ориентации человеческой ДНК и внутреннего контроля предоставляются в лиофилизированном формате в 8 хорошо полосы для FL-DNA Mix A и FL-DNA Mix B. Стандарты, положительные и отрицательные контроля, и образцы должны быть усилены как лиофилизированных смесей. Клинические образцы только должны быть усилены только в дубликате с обефилизированными смесями.

  1. Ознакомьтесь с таблицей материалов для инструмента qPCR и операционного программного обеспечения.
    1. Откройте операционное программное обеспечение и настроили пластину и тепловой профиль:
      1. Настройка пластины, как показано в таблице 1.
        1. Установите тип скважины для всех восьми позиций в столбце 1 в качестве стандарта.
        2. Установите тип скважины для скважин A2 и B2 в качестве NTC.
        3. Установите тип скважины для C2 и D2 (положительные элементы управления) как Неизвестный.
        4. Установите тип скважины для всех других позиций как Неизвестный.
        5. Выберите все 96 позиций и добавьте Dyes FAM и HEX. Нажмите синхронизация плиты.
      2. Установите тепловой профиль в соответствии с таблицей 2.
    2. Centrifuge необходимое количество полосок для 10 с, чтобы довести содержимое на дно трубки.
    3. Аккуратно удалите уплотнения с полосок, уделяя при этом внимание, чтобы сохранить содержимое, и добавить к соответствующим полос: отрицательный контроль: 20 л воды; образец: 20 л ДНК; стандартная кривая: 20 qL стандартных 1, 2, 3 или 4; положительный контроль: 20 л положительного контроля.
    4. Тщательно закройте все полосы, используя 8 полос плоские оптические колпачки и вихрь в течение нескольких секунд.
    5. Centrifuge полосы на 10 с и загрузить их в инструмент. Тогда запустите бег.

4. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ данных может быть выполнен автоматически или вручную в зависимости от программного обеспечения (см. Таблицу Материалов).

  1. В конце запуска выберите столбцы A, C, E, G для"FAM: FL-DNA-A" и"HEX: IC"и столбцы B, D, F, H для"FAM: FL-DNA-B" и"HEX: IC".
  2. Установите следующее для стандартного количества Начальная сумма: 10 нг/реакция для скважин A1 и B1, 2 нг/реакция для C1 и D1, 0.4 ng/reaction для E1 и F1, и 0.08 ng/reaction для G1 и H1.
  3. Установите значения пороговой флуоресценции до 150 для каналов FAM (FL-DNA A и FL-DNA B) и HEX (IC).
  4. В поле Результат Таблица, нажмите Параметры столбца (ru) Выберите все Хорошо, чтобы получить результаты в обоих каналах с их соответствующими значениями Cq (ЗР) и qR последние.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения поставляются в режиме реального времени PCR инструмент программного обеспечения. Последний раз ЗР соответствует значению флуоресценции, нормализованному до последнего цикла усиления.
  5. В таблице результатов в поле нажмите на стол, чтобы открыть контекстное меню и нажмите «Отправить в Excel», чтобы экспортировать исходные данные.
  6. Проверьте значения стандартов, чтобы проверить пригодность стандартной кривой.
  7. Для каждой смеси FL-DNA проверьте колонку R2 «R2 »R»» и эффективность «Эффективность (%)» значения столбца. Если они находятся в приемлемом диапазоне, можно приступить к анализу соответственно инструкциям производителя(таблица 3).
  8. Если результаты канала FAM не находятся в ожидаемом диапазоне, опустите одну точку стандартной кривой и повторно проанализируйте пробег.
  9. Определите значения отрицательного и положительного элементов управления со следующей формулой, считая значения "No Cq" нулевыми:
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
  10. Сравните полученные значения с значениями, о которых сообщается в таблице 4.
  11. Если элементы управления реакцией находятся в диапазоне ожидаемых значений, приступай к анализу образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что полученные значения Cq генерируются из реальной реакции усиления (кривая сигмоидальной флуоресценции), а не из артефакта (кривая линейной флуоресценции).
  12. Чтобы проанализировать пригодность образца для каждой смеси FL-DNA, сравните значения Cq канала HEX. Если значение составляет 16 фунтов, продолжайте анализ образцов. Если значение составляет 16 фунтов; или нет Cq, это, вероятно, из-за дозирования ошибка FL-ДНК Спайк. Таким образом, невозможно проанализировать образцы.
  13. Рассчитайте среднее значение Cq в канале "HEX" положительного контроля с помощью следующей формулы:
    figure-protocol-3
  14. Рассчитайте среднее значение Cq в канале "HEX" репликации образца с помощью следующей формулы:
    figure-protocol-4
  15. Рассчитайте значения CqHEX по следующей формуле:
    figure-protocol-5
  16. Сравните значения образцов CqHEX с значениями, представленными в таблице 5.
  17. Для каждого микса (Mix A и Mix B) сравните значения Cq канала FAM с значениями, представленными в таблице 6.
  18. Чтобы определить значение FL-ДНК каждого подходящего образца, используйте следующую формулу, рассматривая значения "No Cq" как ноль:
    figure-protocol-6
    figure-protocol-7
    ПРИМЕЧАНИЕ: Риск и распространенность колоректального рака является функцией iFOBT и FL-ДНК оценки в соответствии с fagan nomogram результаты, полученные Rengucci и др.12 (Таблица 7).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рабочий процесс этого протокола показан на рисунке 1. Рабочий процесс предоставляет два шага управления и различные действия в соответствии с результатами этих шагов. Во-первых, если образец представляет неподходящие элементы управления, усиление должно быть повторено. Во-вторых, если усиление тормозится, образец должен быть переработан с самого начала или классифицирован как неценный.

На рисунке 2 показаны кривые флуоресценции, производимые положительными и о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Предыдущие исследования показали, что анализ целостности ДНК стула, извлеченный с помощью ручных и полуавтоматических подходов, может представлять собой альтернативный инструмент для раннего выявления колоректальных поражений7,,88,9,,10,,11,12. Молекулярные, неинвазивные скрининг-тесты были разработаны на протяжении многих ле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Мора Менги является штатным сотрудником Diatech Pharmacogenetics srl.

Благодарности

Авторы не имеют подтверждений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Полипропиленовые пробирки с поворотным замком объемом 1,5 мл и 2 мл (без ингибиторов ДНКазы, РНКазы, ДНК-, ПЦР)необходимые для экстракции ДНК и ПЦР в реальном времени
Абсолютный этанол (качество аналитической степени)Реагент, необходимый для экстракции ДНК
Настольная центрифуга Максимальная скорость 20000 x g. Необходимый инструмент для извлечения ДНК
Программное обеспечение для анализа EasyPGX версии 2.0.0Программное обеспечение для анализа Diatech PharmacogeneticsRT800-SW 
Центрифуга/вихревые полоски EasyPGX 8-луночные полоскиDiatech PharmacogeneticsRT803Инструмент рекомендован для анализа ПЦР в реальном времени
EasyPGX qPCR прибор 96 Diatech PharmacogeneticsRT800-96Прибор рекомендован для проведения ПЦР-анализа в реальном времени
EasyPGX ready FL-DNADiatech PharmacogeneticsKit RT029Требуется для проведения ПЦР-анализа в реальном времени
Микропипетки (объемы от 1 до 1.000 &; L)Расходные материалы, необходимые для экстракции ДНК и ПЦР в реальном времени
Неопудренные одноразовые перчаткиРасходные материалы, необходимые для экстракции ДНК и ПЦР в реальном времени
QIAamp Fast DNA StoolQiagen51604Набор рекомендуется для экстракции и очистки ДНК из кала
Стерильные фильтрующие наконечники без ДНКазы, РНКазы (объемы от 1 до 1.000 L)Расходные материалы, необходимые для экстракции ДНК и термоблока ПЦР в реальном времени
, например, сухой блок EasyPGX,Diatech PharmacogeneticsRT801инструмент, необходимый для экстракции ДНК
Vortex, например, центрифуга/вортекс EasyPGX 1,5 мл Diatech PharmacogeneticsRT802Требуется инструмент для экстракции ДНК
Расходные материалы, , ,

Ссылки

  1. Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
  2. Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
  3. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2019).
  4. Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
  5. Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
  6. Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
  7. Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
  8. Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
  9. Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
  10. Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
  11. De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
  12. Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 9/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.

The first affiliation was updated from:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)

to:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

Теги

Оценка риска колоректального рака и распространенности по обнаружению целостности ДНК стула
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.