Оценка универсального вложенного обратного транскрипционного цепной реакции для обнаружения Лисовивирусов

Summary

Пан-лиссавирус вложенной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции была разработана для обнаружения конкретно все известные лисовивирусы. Проверка с использованием образцов мозга бешенства различных видов животных показали, что этот метод имеет чувствительность и специфичность эквивалентно золотой стандарт флуоресцентного теста на антитела и может быть использован для рутинной диагностики бешенства.

Abstract

Для обнаружения вируса бешенства и других видов членов рода Лиссавируса в пределах семейства рхабдовиридае, Пан-лиссавирус вложенного обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР) был разработан для обнаружения сохранялся регион нуклеопротеин (N) гена лисовивирусов. Метод применяет обратную транскрипцию (RT) с использованием вирусной РНК в качестве шаблона и олиго (dT)₁₅ и случайных гексамеров в качестве праймеров для синтеза вирусной комплементарной ДНК (кДНК). Затем, вирусный cDNA используется в качестве шаблона для усиления 845 BP N фрагмент гена в первом раунде ЦР с использованием внешних праймеров, после второго раунда вложенного КЦР, чтобы усилить окончательный фрагмент 371 BP с использованием внутренней праймеров. Этот метод может обнаруживать различные генетические клады вирусов бешенства (RABV). Проверка, используя 9 624 образцов головного мозга от восьми видов домашних животных за 10 лет клинических диагнозов бешенства и эпиднадзора в Китае, показала, что метод имеет чувствительность 100% и специфичность 99,97% по сравнению с прямым флуоресцентным анализ на антитела (FAT), метод золотого стандарта, рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организацией по охране здоровья животных (МЭБ). Кроме того, метод мог бы также специально усилить целевой N фрагмент гена 15 других утвержденных и двух новых видов лизсавирусов в 10-м докладе Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV), как оценивается имитирующих обнаружение синтезированных N генных плазмид всех лизовивирусов. Метод обеспечивает удобную альтернативу FAT для диагностики бешенства и был одобрен как Национальный стандарт (GB/T36789-2018) Китая.

Introduction

Бешенство-это Всемирная зоонозная болезнь, вызываная вирусами в роду Lyssavirus¹. Лисавирусы (Family рхабдовиридае)-ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ РНК-вирусы с приблизительно 12 КБ генома, который кодирует пять белков: N, Фосфоровирус (P), матричный белок (M), гликопротеин (G), и большой белок или полимеразы (L). На основе нуклеотидных последовательностей гена N, генетического расстояния и антигенных паттернов, лиссавирусами были разделены на 16 видов, включая классический вирус бешенства (rabv) и вирусы, связанные с бешенством (RRV): Лагос-летучая мышь (LBV), вирус duvenhage (дувв ), Вирус мокола (МОКВ), Европейская летучая мышь (EBLV-1), Европейская летучая мышь-лиссавирус 2 Австралийский летучая мышь (АБК), вирус Аравана (АРАВ), вирус Икама (иков), Бокело Бат-лиссавирус (BBLV), Ганнорува Бат лиссавирус (ГБЛВ), вирус Иркут (ИРКВ), Худжанский вирус (ХУВ), вирус Западно-кавказской летучей мыши (WCBV), вирус Симони bat (SHIBV) и Ллеида Бат-лиссарус (ллеб)². Недавно были выявлены два дополнительных лисовируса: Kotalahti летучая мышь (KBLV), изолированная от летучей мыши Брандт (Myotis brandtii) в финляндии в 2017³ и Тайваньская летучая мышь ЛИССАВИРУС (twblv), изолированный от японского пистрелле ( Пьпипиреллус абрамы) на Тайване, Китай в 2016 – 2017⁴.

Все млекопитающие подвержены бешенству; Однако, никакие грубые патогномонические поражения или специфические клинические знаки не разрешают свою идентификацию, и диагноз можно только сделать в лаборатории⁵. Наиболее широко используемым методом диагностики бешенства является жир, который считается золотым стандартом как для ВОЗ, так и для МЭБ^5,6. Тем не менее, жир может производить ненадежные результаты на деградированных/аутолzed образцов мозговой ткани. Кроме того, он не может быть использован для анализа биологических образцов жидкости, таких как спинномозговой жидкости (ЛИКВОРА), слюны и мочи, тем самым в значительной степени исключая его занятости в антеморной диагностики⁷. Альтернативные обычных диагностических тестов, таких, как бешенство ткани культуры инфекции тест (РЦКМЭ) и тест инокуляции мыши (MIT), требуют несколько дней⁶, основным недостатком, когда быстрый диагноз имеет важное значение.

Различные молекулярные диагностические тесты (например, обнаружение вирусной РНК с помощью RT-ЦР, терапия с иммуноферментной инфекцией (ЦР-ИФА), гибридизация на месте и в режиме реального времени (СР), используются в качестве быстрых и чувствительных методов диагностики бешенства⁸. В настоящее время "RT-ЦР" рекомендуется МЭБ для рутинного диагностирования бешенства, а в руководстве по диагностическим испытаниям и вакцинам для наземных животных МЭБ описано описание всех лисивирусов⁵. Здесь мы описываем "Пан-лиссавирус", вложенный в-ЦР, что позволяет специфическое и чувствительное обнаружение всех 18 видов лиссавирусов, сопоставимых или превышающих полученные жиром. Принцип метода является RT целевой РНК (сохраняется область лизисавируса N гена) в кДНК, а затем усиление кДНК двумя раундами ЦР. CDNA подвергается в первом раунде КЦР с внешними праймеров, чтобы усилить фрагмент 845 BP; Затем, второй раунд ЦР использует в первом раунде продукта ЦР в качестве шаблона для усиления 371 BP фрагмент с внутренним праймеров. Два раунда ЦР значительно увеличивают чувствительность анализа.

Protocol

Использование мышей в этом протоколе был одобрен Административным комитетом по охране животных института военной ветеринарной медицины, Академия военно-медицинских наук, Китай (Лаборатория по уходу за животными и Комитета использования разрешения, разрешение номер JSY-DW-2010-02). Были соблюдены все институциональные и национальные руководящие принципы по уходу за лабораторными животными и их использованию.

1. РНК экстракция

1. Экстракт РНК от бешенства подозреваемой ткани головного мозга, биопсия кожи, слюна, или ЛИКВОРА или от RABV-инфицированных клеток культуры, с использованием guanidиния изоцианата-фенола-хлороформ основе методов извлечения или коммерчески доступных наборов вирусной РНК экстракции. Используйте подготовленную РНК немедленно или храните ее при температуре-80 ° c, пока не требуется.

2. Обратная транскрипция вирусной РНК

1. Удалите реагенты RT, перечисленные в таблице 1 , из морозильной камеры, держите их на льду и оттепели и вихря перед использованием.
2. Подготовьте 12 мкКл в реакционной смеси RT в 0,2 мл трубки с реагентами, перечисленными в таблице 1. Разрешить для пипетин вариации путем подготовки объема мастер смеси по крайней мере один размер реакции больше, чем требуется.
3. Добавьте 8 мкл образца, положительную управляю РНК или отрицательный контроль на реакцию RT в рамках рабочей станции ЦР в комнате шаблона. Положительный контроль RT — РНК, извлеченная из клеточной культуры, инфицированной фиксированным штаммом RABV CV-11 (стандарт вируса-11) и хранится при температуре-80 ° c. Отрицательный элемент управления содержит Нrase-Free ddH₂O.
4. Смешайте содержимое труб RT с помощью vortexing; то, центрифуга кратко.
5. Загрузите реакционную трубу в Термоциклер. Настройка программы синтеза cDNA со следующими условиями: 42 ° c для 90 мин, 95 ° c в течение 5 минут и 4 °C на удержание. Установите громкость реакции до 20 мкл. Запустите RT Run.

3. Первый раунд ЦР

1. Храните реагенты ЦР, перечисленные в таблице 2 , на льду в чистом помещении до использования; Затем, оттепель и вихрь их.
2. Подготовьте в первом раунде ЦР-смесь в 0,2 мл трубки с реагентами, перечисленными в таблице 2.
3. Добавьте 2 мкл образца кДНК или плазмида в первую круглую смесь ЦР в пределах рабочей станции ЦР в шаблоне комнаты. Положительный контроль КЦР-это CV-11 cDNA, подготовленный как упомянуто в шаге 2,3 для вышеуказанного метода RT. Отрицательный контроль ЦР ddH₂O.
4. Перенесите запечатанные трубы на тепловизионный Циклер и цикл, используя параметры, перечисленные в таблице 3.

4. Второй раунд ЦР

1. Подготовьте второй раунд-смесь ЦР в 0,2 mL-трубке с использованием реагентов, перечисленных в таблице 4.
2. Добавьте 2 мкл первого раунда продукта для ЦР в второй раунд. Кроме того, включите ddH₂O как отрицательный контроль второго раунда ЦР.
3. Выполните ЦР-тепловой Велоспорт, используя те же параметры, которые приведены в шаге 3,4.

5. анализ продукции ЦР электрофорез на гелях агарозы

1. Подготовить 1,5% агарозы гель, добавив 1,5 g агарозы до 100 mL из трис-ацетат-ЭДТА (ТЭ) и растворять его тщательно, нагрев его в микроволновой печи.
2. Добавить этидий бромид (EB) (при конечной концентрации 0,01%) или другого коммерческого EB замещения. Налейте гель в форму и оставить его закрепить при температуре окружающей среды, по крайней мере 30 мин.
3. Подготовьте образцы погрузки, смешивая 5 мкл каждого продукта ЦР с 1 мкл 6X загрузочного буфера.
4. Загрузите образцы и подходящий маркер ДНК отдельно в скважины и запустить гель для примерно 30-45 мин на 120 V, пока линия красителя составляет около 75%-80% вниз гель.
5. Выключите питание, отключите электроды от источника питания, а затем осторожно удалите гель из коробки геля.
6. Используйте УФ гель документирования устройство для визуализации и фотографии фрагментов ДНК.

6. характеристика вложенного РТ-СР

1. 6,1. специфичность и чувствительность к обнаружению 18 лиссавирусами плазмид
   1. Закажите 18 коммерческих плазмид, содержащих полный ген N каждого лиссавируса (16 видов ICTV и два новых вида) для КЦР.
   2. Вычислите номер копии плазмида, используя номер Avogadro (N_A) и следующую формулу.
      [(g/мкл плазмид ДНК)/(плазмида длина в BP x 660)] х 6,022 х 10²³ = количество молекул/мкл
   3. Подготовьте фондовые решения (2,24 x 10⁹ молекул/мкл) всех 18 плазмид в DDH₂O.
   4. Выполните 9 10-кратный серийный разведений всех 18 плазмид в ddH₂o. развести 10 мкл каждого плазмиды с 90 мкл DDH₂o. вихрь и центрифуга кратко.
   5. Выполните ЦР-усиление, как описано в разделах 3-5.
   6. Проанализируйте специфичность и чувствительность вложенного ЦР, обнаруживая ряд плазмид лизсавирусов.
2. Определение d Подключение л имит
   1. Отрегулируйте титр вируса бешенства штамм-11 клеточной культуры до 10^5,5 tcid₅₀/ml (вирус титр определяется в соответствии с руководством МЭБ)⁵.
   2. Выполните 5 10-кратный серийный разведений CV-11 (фондовый решение 10^5,5 tcid₅₀/ml) как описано в шаге 6.1.4.
   3. Выполните РНК экстракции и вложенные процедуры амплификации RT-ЦР всех вирусных разведения, как описано в разделах 1-5.
3. Compar Исон из в этом ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР с "золотым стандартом" жира
   1. Проверьте все клинические образцы по вложенным RT-ЦР, а затем, подтвердите результаты с жиром⁵ и N гена секвенирование⁹.
   2. Использование нормализованных данных для статистического анализа с помощью SAS 9,1. Используйте тест Каппа и тест хи-квадрат макнемара для статистического сравнения диагностических тестов (команда SAS: прокнутых FREQ; таблица/согласен). Расчет доверительный интервал при аберномиальном распределении.
4. Оценка эффективности при тестировании ухудшенного образца
   1. Разоблачить два подтвержденных клинических образцов мозговой ткани бешеных собак при температуре 37 ° c.
   2. Анализ двух образцов на каждый день воздействия на 37 ° c на вложенный RT-СР, жир, и MIT⁵.

Results

Результаты вложенного РТ-СР для обнаружения 18 видов лиссавирусов показаны на рисунке 1. Все положительные элементы контроля показали ожидаемый 845 BP в первом-и 371 BP во втором раунде амплификации без группы в отрицательном контроле. Все 18 лизовивирусы производили Ожидаемые диапазоны 845 и/или 371 BP, что указывает на то, что вложенная RT-ЦР обнаружила все 18 лизовивирусов. Шестнадцать лизсавирусов плазмид было эффективное усиление в двух раундах ЦР, но два, а именно АРАВ и Иков, было уси...

Discussion

В настоящее время, RABV является одним из основных лизсавирусов, ответственных за почти всех людей и животных, бешенства в Китае, а также в других странах. Кроме того, вариант ИРКВ был впервые идентифицирован с м.урина лойкогстер бат в провинции Цзилинь в северо-восточном Китае в 2012¹⁰, и, как сообщается, причиной смерти собаки в провинции Ляонин в 2017¹¹. Совсем недавно, Роман lyssavirus, TWBLV, также был идентифицирован из японских летучих мышей в Тайва...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 раз &; TAE	Различные	Различные
6 & раз; загрузочный буфер	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright® Inc	A-2015-100g
ddH2O	Различные	различные
DL 2,000 маркеры	Takara	3427A
dNTPs (10 мМ)	TakaRa	4019
dNTPs (2,5 мМ)	TakaRa	4030
Система электрофореза	Tanon	EPS300
ex-Taq (5 U/μ L)	TakaRa	RR001
Система визуализации геля	UVITEC	Fire Reader
Микроцентифуге	Различные
различные M-MLV обратная транскриптаза (200 МЕ/&м; L)	TakaRa	2641A
Спектрофотометр NanoDrop 1000	Термонаука	ND1000
Олиго (dT)15	TakaRa	3805
ПЦР-машина	BIO-RAD	T100
ПЦР-пробирки
различные фьюзионные высокоточные ДНК-полимеаразы	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Дозаторы	различных
случайных праймеров	TakaRa	3801
ингибитор РНКазы (40 МЕ/&м; L)	TakaRa	2313A
РНКаза-свободный ddH2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10×)	TakaRa	9152A Наконечники
	Различные	Разные Вихревые
смесители	Разные	Разные