Методическая статья

Технология CRISPR/Cas9 в восстановлении экспрессии дистрофинов в iPSC-производных мышечных прародителях

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59432

⸱

14 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Medical College of Georgia, Augusta University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол удаления Exon23 на основе Cas9 для восстановления экспрессии дистрофина в iPSC из фибробластов кожи, полученных из мышиDmdx, полученных от мыши, и непосредственно дифференцировать iPSCs в миогенные клетки-предродители (MPC) с помощью системы активации Tet-on MyoD.

Аннотация

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является тяжелым прогрессирующим заболеванием мышц, вызванным мутациями в гене дистрофина, что в конечном итоге приводит к истощению клеток-прародителей мышц. Кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы / CRISPR-ассоциированных 9 (CRISPR/ Cas9) редактирование генов имеет потенциал для восстановления экспрессии гена дистрофина. Автологические индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) полученных мышечных клеток-прародителей (MPC) может пополнить стволовых / прародителей клеток бассейн, ремонт повреждений, и предотвратить дальнейшие осложнения в DMD, не вызывая иммунного ответа. В этом исследовании мы представляем сочетание CRISPR/Cas9 и неинтегрированных технологий iPSC для получения мышечных прародителей с восстановленным выражением белка дистрофина. Вкратце, мы используем неинтегрируя вектор Sendai для того чтобы установить линию iPSC от дермальных fibroblasts мышейMdx Dmd. Затем мы используем стратегию удаления CRISPR/Cas9 для восстановления экспрессии дисстрофинов через негомологический конец соединения рерамбированный ген дистрофина. После проверки PCR exon23 истощения в трех колониях из 94 выбрали iPSC колоний, мы дифференцировать iPSC в MPC по доксициклин (Dox) индуцированной выражение MyoD, ключевой фактор транскрипции играет значительную роль в регулировании дифференциации мышц. Наши результаты показывают возможность использования стратегии удаления CRISPR/Cas9 для восстановления экспрессии дистрофина в IPC-производных MPC, который имеет значительный потенциал для разработки будущих методов лечения DMD.

Введение

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является одной из наиболее распространенных мышечных дистрофий и характеризуется отсутствием дистрофина, затрагивающих 1 из примерно 5000 новорожденных мальчиков во всем мире1. Потеря функции гена дистрофина приводит к структурным мышечным дефектам, приводяк к прогрессирующей дегенерации миофиберд1,2. Рекомбинантный адено-ассоциированный вирус (rAAV)-опосредованная система генной терапии была протестирована для восстановления экспрессии дистрофина и улучшения функции мышц, таких как замена генов с помощью микро-дистрофинов (з-Дис). Тем не менее, подход rAAV требует повторных инъекций для поддержания экспрессии функционального белка3,4. Поэтому нам нужна стратегия, которая может обеспечить эффективное и постоянное восстановление экспрессии генов дистрофинов у пациентов с DMD. Мышь Dmdmdx, модель мыши для DMD, имеет мутацию точки в экзоне 23 гена дистрофина, который вводит преждевременное прекращение кодона и приводит к нефункциональному усеченного белка, не имеющего C-терминального дистрогликанового связующего домена. Недавние исследования показали использование технологии CRISPR/Cas9 для восстановления экспрессии генов дистрофина путем точной коррекции генов или удаления мутантов экзона у малых и крупных животных5,6,7. Long et al.8 сообщили о методе коррекции мутации гена дистрофинов в зародыше мыши Dmdmdx с помощью гомологического ремонта (HDR) на основе редактирования генома CRISPR/Cas9. El Refaey et al.9 сообщили, что RAAV может эффективно акцизного мутанта экзона 23 у дистрофических мышей. В этих исследованиях, gRNAs были разработаны в интронах 20 и 23, чтобы вызвать двухцепочечные разрывы ДНК, которые частично восстановили экспрессию дистрофина после восстановления ДНК через негомологический конец соединения (NHEJ). Еще более захватывающим, Amoasii et al.10 недавно сообщили об эффективности и осуществимости редактирования генов rAAV CRISPR в восстановлении экспрессии дистрофина в собачьих моделях, что является важным шагом в будущем клиническом применении.

DMD также вызывает нарушения стволовых клеток11. Для повреждения мышц, жилые стволовые клетки мышц пополнить умирающих мышечных клеток после дифференциации мышц. Однако последовательные циклы травм и ремонта приводят к сокращению теломер в мышечных стволовых клетках12,а преждевременное истощение пулов стволовых клеток13,14. Таким образом, сочетание аутологичной терапии стволовыми клетками с редактированием генома для восстановления экспрессии дистрофина может быть практическим подходом для лечения ДМД. Технология CRISPR/Cas9 предоставляет возможность генерации аутологичной генетически исправленной пурипотентной пурипотентной реакции (iPSC) для функциональной регенерации мышц и предотвращения дальнейших осложнений DMD, не вызывая иммунного отторжения. Тем не менее, iPSCs имеют риск образования опухоли, которые могут быть смягчены дифференциации iPSC в миогенных клеток-прародителей.

В этом протоколе мы описываем использование неинтегрирующего вируса Сендай для перепрограммирования дермальных фибробластов мышей Dmdmdx в iPSCs, а затем восстановления экспрессии дистрофина путем удаления генома CRISPR/Cas9. После проверки удаления Exon23 в iPSC путем генотипирования, мы дифференцировали геном-исправлено iPSC в миогенных прародителей (MPC) через MyoD-индуцированной миогенной дифференциации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все обработки животных и хирургические процедуры были выполнены протоколом, утвержденным Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Августы (IACUC). Мышей кормили стандартной диетой и водой ad libitum.

1. Изоляция первичных фибробластов мыши от взрослых мышей Dmdmdx

  1. Эвтаназия взрослых мышей Dmdmdx (мужчина, 2 месяца) на CO2 асфиксии и торакотомии в соответствии с IACUC утвержденных Медицинский колледж Грузии, Университет Августы. Вырежьте хвост стерильным скальпелем в стерильном состоянии под ламинарным капюшоном. Промыть хвост 70% этанола в течение 5 мин, а затем промыть стерильным фосфатным сольниковым раствором (PBS) в 6-сантиметровой тарелке.
  2. Очистите хвост кожи от резкого разреза от основания до хвоста кончик вдоль хвостовой кожи, а затем осторожно снять хвост кожи с помощью пинцета. Измельчить кожу размером 1 мм3 с помощью стерильного скальпеля и переместить измельченные ткани кожи в 6 см блюдо в dulbecco минимальной существенной среде / Хамf12 (DMEM/F12), содержащий 0,1% коллагеназы IV и 1 U /mL диспазы.
  3. Переварить ткани кожи в культуре блюдо для 2 ч при 37 КС в 5% CO2 инкубатора.
  4. Пальто 6-хорошая пластина с фибронектином и 0,2% желатина (1 мл фибронектина в 199 мл 0,2% желатина; Таблица материалов) и инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 1 ч.
  5. Отключите переваренные ткани кожи наконечником 1 мл и перенесите ткань и супернатант в стерильную 15 мл конической центрифуги. Центрифуга на 217 х г в течение 3 мин при комнатной температуре, отбросить супернатант и приостановить гранулы в 1,5 мл фибробластной среды(Таблица материалов).
  6. Культура гранулы, включая неполные переваренные ткани кожи от шага 1,5 на 6-хорошо пластины покрыты фибронектин и 0,2% желатин от шага 1,4 в 37 КС, 5% CO2 инкубатора. Замените среду 24 ч после первоначального покрытия, чтобы удалить неприкрепленные клетки, и изменить среду каждые 48 ч.

2. Перепрограммирование фибробластов кожи мыши в iPSCs

  1. За два дня до трансдукции, переварить мышь дермальных фибробластов от шага 1.6 с раствором отслоения клеток (Таблица Материалов) в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с увлажненной атмосферой 5% CO2 в течение 5 мин.
  2. Подсчитайте клетки с помощью гемакитометра и центрифуги на 217 х г в течение 3 мин.
  3. Семенные клетки при плотности 1 х 105 клеток на хорошо на 6-хорошую пластину и культуры с фибробластной среды (Таблица материалов) в инкубаторе 37 градусов с увлажненной атмосфере 5% CO2.
  4. В день трансдукции (день 0) оцените клетки и вычислите объем каждого вируса, необходимого для достижения целевого многообразия инфекции (MOI) 5, 5 и 3 (т.е. KOS MOI No 5, hc-Myc MOI No 5, hKlf4 MOI No 3) в соответствии с коммерческим руководством.

figure-protocol-1

  1. Оттепель три Сендай трубки в 37 градусов воды в течение 5'10 s и добавить рассчитанные объемы каждой из трех сендай труб 1 мл фибробласта среды (Таблица материалов).
  2. Удалите фибробластную среду со ступени 2.3 и добавьте вирусную смесь перепрограммирования в колодцы, содержащие клетки. Инкубировать клетки на ночь в инкубаторе 37 градусов с увлажненной атмосферой 5% CO2.
  3. Замените среду свежей фибробластной средой 24 ч после трансдукции. Культура клетки в течение одной недели со средним обменом через день.
  4. Урожай инфицированных фибробластов мыши на 7 день после трансдукции с 0,05% трипсин / EDTA и место на блюда, которые ранее покрыты фибронектин и 0,2% желатина.
  5. Культура инфицированных фибробластов мыши от шага 2.6 с полной мыши эмбриональной стволовых клеток (ES) среда роста(Таблица материалов) в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с увлажненной атмосферой 5% CO2 и изменить среду ежедневно.
  6. С 8-го дня, наблюдать пластины под перевернутым микроскопом через день, чтобы определить появление клеточных скоплений с морфологией мыши ES.

3. Использование щелочной фосфатазы живое пятно и цитометрия потока для количественной оценки эффективности перепрограммирования

  1. Удалите культурные носители из каждой скважины и сморите DMEM/F-12 в течение 2-3 мин.
  2. Нанесите 2 мл 1x щелочной фосфатазы (AP) живой пятно рабочий раствор (1:500 разбавления в DMEM /F-12) к клеткам адептов, и инкубировать в инкубаторе 37 градусов с увлажненной атмосферой 5% CO2 в течение 30 мин.
  3. Аспирированный AP живое пятно и мыть дважды с PBS в течение 5 минут каждый.
  4. Дайджест клетки с раствором отслоения клеток (Таблица материалов) в инкубаторе 37 градусов с увлажненной атмосферой 5% CO2 в течение 5 мин. Выполните цитометрию потока, чтобы определить эффективность перепрограммирования.

4. Выбор и сбор клеток, похожих на ES

  1. Изучите колонии со ступени 2.8 под перевернутым микроскопом.
  2. Отметьте колонии в нижней части тарелки с самочерпав аномированным маркером объекта.
  3. Нанесите смазанные кольца клонирования, чтобы покрыть отмеченные колонии клеток. Добавьте 100 кЛ 0,05% трипсин/ЭДТА к каждому клонирующему кольцу при 37 кВ в течение 5 минут, а затем перенесите переваренные клетки с 100 наконечниками пипетки на 48-ну хорошую культурную плиту, содержащую среду роста mES.
  4. Инкубировать клетки в 48-хорошо культурных пластин в инкубаторе 37 градусов с увлажненной атмосферой 5% CO2. Проход клетки к 6 см блюдо, когда они достигают 70% слияния.
  5. Повторите шаги 4.3 и 4.4 в течение нескольких раз, пока не будут получены единые клоны в форме общежития.

5. Замораживание iPSCs для криоконсервации

  1. Диссоциатив выбранных iPSCs от шага 4.5 с трипсином, стихом и цыпленком плазмы (TVP; Таблица материалов) раствор при 37 градусах Цельсия в инкубаторе CO2 5% в течение 30 мин.
  2. Соберите клетки в стерильной 15 мл конической трубки и центрифуги при 217 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
  3. Аспирировать супернатант и повторно приостановить клеточные гранулы в 2 мл мыши ES замороженных средних (Таблица материалов) для получения 1 мл на криовые.
  4. Добавьте клетки в криовиалы и заморозьте с помощью морозильной камеры, которая обеспечивает критическую, повторяющиеся скорости охлаждения ,1 кв/мин, необходимые для криоконсервации при -80 градусов по Цельсию на ночь.
  5. Перенесите замороженные флаконы в резервуар с жидким азотом.

6. Иммунофлуоресценция окрашивание маркеров стволовых клеток в iPSCs

  1. Семена iPSCs от шага 5.1 культивируется со средним mES в 8-ну хорошо камерный слайд с покрытием поли-D-лизин / ламинин (Таблица материалов) при соответствующей плотности для достижения между 1 х 2 х 104 клетки на скважину и инкубировать в 37 c инкубатор с увлажненную атмосферу 5% CO2 на 48 ч.
  2. Погрузите слайды в 4% формальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем погрузите слайды в PBS дважды в течение 5 минут каждый раз.
  3. Инкубировать секции с помощью мыши IgG-блокирующий реагент(Таблица материалов),и 5% козьей сыворотки для 1 ч при комнатной температуре.
  4. Разбавить первичные антитела в разбавителе белка (мышь-анти-SSEA1, 1:100, кролик-анти-Наног, 1:500; кролик-анти-POU класс 5 homeobox 1 "OCT4", 1:500; кролик-анти-SRY-бокс 2 "SOX2", 1:500; кролик-анти-Лин-28 гомолог A "Lin28A", 1:400) (Таблица Материалы). Нанесите антитела на клетки и инкубировать при 4 градусах Цельсия на ночь в увлажненной камере.
  5. Откажитесь от основного раствора антитела и мыть слайды 3x в PBS.
  6. Применить второй антител (Alexa488-конъюгированных коза-анти-мышь антитела и Alexa555-конъюгированный коза-анти-кролик, 1:400 каждый) в M.O.M. белка разбавитель на слайдах и инкубировать в течение 45 минут при комнатной температуре.
  7. Вымойте слайды 3x в PBS и монтаж разделов с монтажом среды, содержащей 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  8. Сфотографируйте с конфокальный микроскоп.

7. Исследование плюрипотентности iPSCs in vivo

  1. Диссоциатив iPSCs от шага 5.1 к одиночным клеткам используя разрешение TVP в инкубаторе 37 c с увлажненной атмосферой 5% CO2 на 30 минут.
  2. Подсчитайте клетки с помощью гемакитометра и центрифуги на 217 х г в течение 3 мин.
  3. Аспирируйте супернатант и приостанавливаете гранулы со средой mES в стерильной центрифуге мощностью 1,5 мл в концентрации 5 х 105 клеток/30 Л для пересадки клеток.
  4. Удалить волосы от обеих задних конечностей иммунодефицитных мышей с помощью клиперов.
  5. Анестезируйте мышей кетамин (100 мг/кг) и очищайте место инъекции 75% алкоголя.
  6. Введите 30 зЛ суспензии iPSC от шага 7.3 внутримышечно в gastrocnemii, используя иглу 31 G.
  7. Через две недели после инъекции, урожай мыши gastrocnemii и вставлять в оптимальной температуры резки (OCT) соединения, оснастки заморозить и нарезать 5 мкмразделы 15,16.
  8. Исправить разделы в 4% формальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем мыть слайды дважды в PBS в течение 5 минут каждый раз.
  9. Блок клетки с 5% козьей сыворотки белка разлитель для 1 ч при комнатной температуре.
  10. Добавьте разбавленное первичное антитело (rabbit anti-AFP, 1:50; rabbit anti-SMA, 1:50; rabbit anti-TH, 1:50) к горок и инкубировать при 4 кс ночь в увлажненной камере.
  11. Откажитесь от первичного раствора антитела, промойте клетки 3x (5 мин/мыть) в PBS, добавьте 1:400 разбавленного Alexa555-конъюгированного козла-анти-кролика антитела к слайдам, и инкубировать в течение 45 минут при комнатной температуре.
  12. Вымойте слайды 3x (5 мин/мыть) в PBS, и смонтировать разделы с монтажной средой, содержащей DAPI.

8. Строительство CRISPR/Cas9 лентивирусного вектора, направленного на интроны, фланговые дистрофин экзон 23

  1. Дизайн две пары gRNA олигос ориентации интрон-фланговых дистрофин экзон 23 через http://crispor.tefor.net/crispor.py.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разработанные пары являются следующими:
    i22sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAATCAA- 3'
    i22anti-sense: 5'-AAACTTGATTTACCTAAGCTTA AC-3'
    i23sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATCATTCT- 3'
    i23anti-sense: 5'-AAACAGAAGGTATGACACATACTC-3').
  2. Дайджест и дефосфорилат 5 мкг лентивирной плазмы CRISPR (lenti-CRISPRv2-blast (подарок от Мохан Бабу) и ленти-гид-Гигро-iRFP670 (подарок от Кристен Бреннан) (Таблица материалов)с BsmB1/Esp3I на 30 мин при 37 градусов по Цельсию. Для 5 мкг плазмидов добавьте 3 зЛ фермента BmB1, 3 злитровых фосфатазы, 6 л 10-х ферментов, дайджест овеков и 0,6 л 100 мм DTT в 60 йл реакции).
  3. Загрузите реакции на 0,8% агарозный гель. Выполнить гель при 100 х 150 В в течение 30 минут.
  4. Очистите переваренный плазмид в гель с помощью комплекта извлечения геля(Таблица материалов)и elute в 20 Л Л H2O.
  5. Фосфорилат и анналь каждая пара олигонуклеотидов гРНК, содержащих 1 зл и каждый олигонуклеотид при 100 мкм, 1 йЛ 10x буфера перевязки T4, 0,5 л полинуклеотидной киназы T4 (PNK), 6,5 л ddH2O при 37 C в течение 30 мин, а затем 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин, а затем пандус d владеть до 25 градусов по Цельсию при 5 градусах/мин.
  6. Ligate 1:200 разбавления annealed gRNA олигонуклеотидов в изобилии V2-Blast или plentiGuide-Hygro-iRFP670. Смешайте 50 нг BsmB1/Esp3I переваренных векторов с 1 зл разбавленного дуплекса олиго и 5 Л 2x буфера лигазе плюс 1 Л лигазе в 11 л реакционной системы и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
  7. Выполните преобразование с 3 зл авязивания продукта в 50 l компетентных клеток(Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
  8. Распространение преобразованных компетентных клеток в агар пластины с 100 мкг /мл карбенициллин и инкубировать при 31,5 градуса х на 18 ч.
  9. Выберите колонии с 10 sL стерильных пипетки советы и культуры в 5 мл потрясающий бульон (Таблица материалов), содержащий 100 мкг /мл карбенициллин при 31,5 c, 185 об/мин в шейкер инкубатор для 21 ч.
  10. Очистите плазмидДНК ДНК с помощью мини-подготовки и миди-подготовки комплектов (Таблица материалов).
  11. Проверить мини-подготовки плазмиды путем ограничения пищеварения. Для реакционной системы 20 л добавьте 1 мкг плазмидной ДНК, 2 л буфера реакции пищеварения(Таблица Материалов)и 1 л ферментной смеси (0,5 л КПНИ-ГФ и 0,5 л для Agei-HF для plentiCRISPR V2-Blast-i22; 0,5 л ограничения ферментной смеси (0,5 л Из КПНИ-HF и 0,5 л для Agei-HF для plentiCRISPR V2-Blast-i22; 0,5 л plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). Инкубировать систему реакции на 1 ч при 37 градусах Цельсия.
  12. Загрузите реакции на 0,8% агарозный гель. Выполнить гель при 100 х 150 В в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильные полосы для plentiCRISPR V2-Blast-i22 должны быть 622 bp и 12.2 kb, а правильные полосы для plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23 должны быть 2.6 kb и 7.1 kb.

9. Лентивирная векторная упаковка

  1. Культура 7 х 105 293FT клеток в 5 мл DMEM средств, содержащих 10% сыворотки крупного рогатого скота плода в 6 см блюдо на ночь при 37 КС, 5% CO2.
  2. Подготовка коктейль (1 мкг plentiCRISPR V2-Blast-i22 или обильныйГид-Hygro-iRFP670-i23, 750 нг psPAX2 упаковки плазмид, 250 нг pMD2.G конверт плазмид, и 5 мл трансфекционного реагента A
  3. Приготовьте смесь из 5 злицита реагента B(Таблица материалов)в 100 злител юрте уменьшенных сывороточных медиа MEM.
  4. Добавьте 100 л трансфекционного реагента B в плазмидную смесь со ступени 9.2 и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
  5. Добавьте ДНК-липидный комплекс (от шага 9.4) dropwise к 293FT клеткам. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
  6. Добавить усилитель производства вируса (500x) (Таблица материалов) к каждому блюду на следующий день и инкубировать на 24 ч при 37 КС, 5% CO2.
  7. Соберите среду из клеток с помощью пипетков в ближайшие два дня и фильтруйте среду через фильтр 0,45 мкм для удаления клеток.

10. Концентрация и очищение ллентивирных векторов

  1. Осадок лентивирный вектор в среде шага 9.7 ночь на 4 КС с 5x полиэтиленгликоль 4000 (PEG4000, 8,5% конечной концентрации) и 4 M NaCl (0,4 М конечной концентрации).
  2. Centrifuge вирусных носителей, содержащих решение PEG4000 на 2095 х г и 4 кв кв в течение 30 минут, удалить и отказаться от супернатанта.
  3. Приостановить гранулы с 500 л сыворотки снижение MEM средств (лентивирус титр: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1,56 х 108, lenti-iRFP6 70-gRNAi23: 1.3 x 108, lenti-CRISPR V2-контроль: 3.13 x 107,lenti-iRFP670-контроль: 5.9 x 107 ). Хранить при -80 градусах по Цельсию до использования.

11. Удаление экзона 23 в мышиных iPSCs с двумя направляющими РНК (gRNAs) в сочетании с Cas9

  1. Плита мыши iPSCs от шага 4.5 в 24-колодец пластины покрыты фибронектин и желатин.
  2. После того, как клетки достигают 50% слияния, переключитесь на среду свежей культуры (полибрен роста эмбриональной стволовой клетки мыши), содержащий 8 мкг/мл полибрена).
  3. Добавьте 100 зЛ раствора лентивирных частиц от шага 10.3, включая lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 и контроль (пустой вектор: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) к мыши ным. Инкубировать клетки в течение 3 дней при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
  4. Выберите завистливо инфицированные клетки со средствами, содержащими 2,5 мкг/мл бласцидина и 100 мкг/мл гигромицицина В, определив минимальную концентрацию бласцидина и гигромицина В, необходимых для уничтожения неинфицированной клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неинфицированные клетки будут убиты бласцидином и гигромицином В.
  5. Дайджест выбранной мыши iPSCs с 0,5 мл раствора TVP каждый хорошо (24-хорошая пластина) и инкубировать клетки в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.
  6. Диссоциатив iPSCs в одиночные клетки путем pipetting, рассчитывать клетки с камерой учета клетки, а затем разбавить около 150 переваренных одиночных ячеек со средним mES в 10 см блюдо для культуры на 37 C с 5% CO2.
  7. Примерно через 10 дней, выбрать отдельных колоний под перевернутым микроскопом, используя 10 л стерильных пипетки советы (96 колоний должны быть выбраны).
  8. Перенесите собранные колонии в 50 л раствора TVP каждый хорошо (96-ну колодец, по одной колонии каждый колодец), переварить при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, а затем сеять переваренные клетки в две 96-ну хорошо культурные плиты, чтобы сохранить культуру (один для генотипирования).
  9. Инкубировать в инкубаторCO2 при 37 градусах По Цельсию до 70% сплава.

12. Идентификация колоний iPSC с удалением exon23

  1. Удалите среду в 96-хорошо пластины, когда клетки колоний достичь 70% слияния.
  2. Добавьте 25 зл и реагента лиза(Таблица материалов),содержащего раствор протеиназы K (1 мл протеиназы K в 100 мл лисисового реагента) к каждой скважине, и перенесите лизат на 96-хорошую ПЦР пластину.
  3. Печать пЦР пластины и инкубировать пластины при 55 градусов по Цельсию в течение 30 мин, а затем при 95 градусов по Цельсию в течение 45 минут, чтобы линзировать клетки и денатурировать протеиназа K.
  4. Проведите ПЦР реакцию с 2 Л лизата со ступени 12.3. Для реакции ПЦР, 20 Л ПЦР, добавьте 2 Зл ализировать, 10 зл 2x ДНК полимеразы премикс(Таблица материалов), 7 Зл воды без DNase, и 1 Зл DMD экзон 23 грунтовки (Таблица 1).
  5. Используйте следующие параметры для реакции ПЦР: 98 градусов по Цельсию в течение 1 мин, 35 циклов 98 градусов по Цельсию на 10 с, 60 градусов по Цельсию для 15 с, 72 градуса по Цельсию на 30 с и окончательное расширение при 72 c в течение 1 мин.
  6. Загрузите реакцию ПЦР на 2% агарозный гель. Выполнить гель при 100 х 150 В в течение 30 минут.
  7. Осмотрите гель под ультрафиолетовым светом (эффективность нокаута 3/94).

13. Использование системы активации Tet-on MyoD для непосредственного дифференцирования iPSC в миогенные клетки-предродители (MPC)

  1. Пакет LV-TRE-VP64-мышь MyoD-T2A-dsRedExpress2 и LV-TRE-VP16 мышь MyoD-T2A-dsRedExpress2 (подарок от Шарля Герсбаха) (Таблица материалов), как ранее описано для lenti-CRISPRv2-blast и lenti-gRNA-iRFP670 векторов в разделах 9 и 10.
  2. Заразить мышь iPSC лентивирусом-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 или lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2, как ранее описано для lenti-CRISPRv2-blast и lenti-gRNA-iRFP670 векторов в шагах 11.1.11.3.
  3. Выберите клетки с 1 мг/мл пуромицин после трех дней инфекции, чтобы получить чистую трансиндуцированную популяцию клеток.
  4. Добавьте 3 мкг/мл доксициклина в культурные носители (10% FBS DMEM) к дифференциации MPC. Замените свежую среду, дополненную доксициклиным каждые два дня.

14. Количественная обратная транскрипция ПЦР для оценки динамической дифференциации мышц и экспрессии DMD exon 22-24

  1. Извлекайте клеточную РНК через 0, 3, 6 и 10 дней после лечения доксициклином с использованием реагента изоляции РНК, перебрасывайте РНК в кДНК с помощью первого набора синтеза кДНК (Таблица Материалов).
  2. Для 20 qPCR реакционной системы, добавить 1 л кДНК, 10 л пЦР реакционный буфер(Таблица материалов), 8 л ДНК H2O, и 1 л смеси вперед и обратной грунтовки (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы »GAPDH», скелетные мышцы »ACTA1 », OCT4 и DMD exon22, DMD exon23 и DMD exon24, см. Таблицу 1).
  3. Используйте следующие параметры для реакции ПЦР: 50 градусов по Цельсию в течение 2 мин, 95 градусов по Цельсию в течение 2 мин, 40 циклов по 95 градусов по Цельсию на 15 с, 60 градусов по Цельсию в течение 1 мин, плавильной кривой 65,0 кВ до 95,0 градусов по Цельсию, приращение 0,5 градусов.

15. Иммунофлуоресценция окрашивание миозина тяжелой цепи 2 (MYH2) и экспрессии белка дистрофана

  1. Плита доксициклин индуцированных, lenti-TRE-MyoD модифицированных клеток от шага 13,4 на 8-коловидной культуры слайдов.
  2. Исправить клетки в 4% формальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем мыть слайды дважды в PBS в течение 5 минут каждый раз.
  3. Блок клетки с 5% козьей сыворотки белка разлитель для 1 ч при комнатной температуре.
  4. Добавьте к слайдам антидистрофиновые антитела кролика-анти-дистрофина (1:300) и антитела мыши-анти-MYH2 (1:100), инкубируют при 4 градусах Цельсия на ночь в увлажненной камере.
  5. Откажитесь от первичного раствора антитела, мыть клетки 3x (5 мин/ мыть) в PBS, добавить 1:400 разбавленных Alexa488-конъюгированных коза-анти-кроличьи антитела и Alexa555-конъюгированных коза-анти-мышь антитела к слайдам, и инкубировать в течение 45 минут при комнатной температуре.
  6. Вымойте слайды 3x (5 мин/мыть) в PBS, и смонтировать разделы с монтажной средой, содержащей DAPI.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Создание фибробластов кожи Dmdmdx, полученных iPSC. Мы продемонстрировали эффективность генерации мыши iPSCs от мышей Dmdmdx, полученных фибробластом кожи, используя безинтеграционные векторы перепрограммирования. Рисунок 1A показал, что появление эмбриональных стволовых клеток (ESC)-подобных колоний в течение трех недель после заражения. Мы оцениваем эффективность индукции iPSC живым щелочным фосфатазным пятном (AP); На р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является разрушительным и в конечном итоге смертельным наследственным заболеванием, характеризующимся отсутствием дистрофии, что приводит к прогрессирующей атрофии мышц1,2. Наши результаты демонстрируют восстановленную экспрессию генов дистрофина в клетках миогенного прародителя Dmdmdx iPSC с помощью удаления CRISPR/Cas9 exon23. Этот подход имеет три преимущества.

Во-первых, мы генерировали i...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Тан и Вайнтрауб были частично поддержаны NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хирургические инструменты
31 калибр иглыVarious 
Острый разрезразличный 
Стерильные скальпелиразные 
Пинцетразличный 
Фибробластная среда (на 100 мл готовой среды)Номер в каталогекомпанииОбъем
2-меркаптоэтанол (55 мМ)Gibco21-985-0230,1 мл
антибиотика антимикотического раствора 100xCORNINGMT30004CI1 мл
модифицированной иглы Dulbecco's Modified Eagle's Medium - высокий уровень глюкозыSIGMAD642987 мл
Фетальный Бычья сыворотка характеризуетсяHyCloneSH30396.0310 мл
раствора L-глютаминаSIGMAG75131 мл
MEM раствор заменимых аминокислот (100x) Gibco111400761 мл
раствора TVP (на 500 мл полного раствора)Номер в каталогекомпании Объем
Куриная сывороткаGibco16110-0825 мл
ЭДТАSigma-AldrichE6758186 мг
фосфат-буферного растворадо 500 мл
трипсина (2,5%)Thermo150900465 мл
Питательная среда mES (для 500 мл полного раствора)Номер в каталогекомпанииОбъем
2-Меркаптоэтанол (55 мМ)Gibco21-985-0230,5 мл
Антибиотик Антимикотический Slution 100xCORNINGMT30004CI5 мл
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - с высоким содержанием глюкозыSIGMAD6429408,5 мл
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота ХарактеристикаHyCloneSH30396.0375 мл
раствора L-глютаминаSIGMAG75135 мл
мышиного рекомбинантного фактора ингибирования лейкоза (LIF), 0,5 x 106 ед/млEMD Millipore CorpCS210511500 мкм;
Добавка ингибитора L MEK/GS3EMD Millipore CorpCS210510-500UL500 μ L
MEM раствор заменимых аминокислот (100x) Gibco111400765 мл
Среды для ES-клеток не следует хранить более 4 недель, а с ингибиторами – не более 2 недель.
mES замороженная среда (для 50 мл готового раствора)CompanyКаталожный номерVolume
Dimethylsulfoxide (DMSO)SIGMAD26505 мл
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - высокий уровень глюкозыSIGMAD642924,9 мл
Фетальная бычья сыворотка с характеристикамиHyCloneSH30396.0325 мл
мышиного рекомбинантного фактора ингибирования лейкоза (LIF), 0,5 x 106 ед/млEMD Millipore CorpCS21051150 мкм; L
Наименование материала/оборудованияНомер вкаталогекомпании RRID
0,05% Трипсин/0,53 mM EDTACORNING25-052-CI
4% ПараформальдегидThermo scientificJ19943-k2
Раствор аккутазыSIGMAA6964Раствор для отслойки клеток
AgeI-HFNEBR3552L
Alexa488-конъюгированное козье антитело против мышиInvitrogenA32723AB_2633275
Alexa488-конъюгированное козье антитело против кроликаInvitrogenA32731AB_2633280
Alexa555-конъюгированное козье антитело против кроликаInvitrogenA32732AB_2633281
анти-AFPThermo scientificRB-365-A1AB_59574
анти-α-Smooth Мышечный актин (D4K9N)XP CST19245SAB_2734735
антидистрофинThermoPA5-32388AB_2549858
анти-LIN28A (D1A1A) XP     CST8641SAB_10997528
anti-MYH2DSHBmAb2F7AB_1157865
anti-Nanog-XPCST8822SAB_11217637
anti-Oct-4A (D6C8T)CST83932SAB_2721046
anti-Sox2abcamab97959AB_2341193
anti-SSEA1(MC480) CST4744sAB_1264258
анти-TH (H-196)САНТА-КРУЗ sc-14007AB_671397
Щелочная фосфатаза Живое окрашивание (500x)ThermoA14353
Бластицидин SСигма-Олдрич203350
BSMBI/Esp3INEBR0580L/R0734L
Карбенициллинмиллипоры205805-250MG
коллагеназа IV Worthington Biochemical CorporationLS004189
компетентные клеткиTakaRa636763
CutSmart NEBB7204S
CytoTune-iPS 2.0 Набор для перепрограммированияSendai ThermoA16517
Реагент для лизиса DirectPCR (клетка)VIAGEN BIOTECH302-C
Dispase (1 Ед/мл)STEMCELL Technologies7923
Доксициклина гидрохлоридФишер БиореагентыBP26535
EcoRI-HFNEBR3101L
Фибронектин бычьей плазмыSIGMAF1141
 
QIAEX II Набор для экстракции геля (500)		QIAGEN20051
Желатин из свиной кожи, тип ASIGMAG1890
HardSet Antifade Монтажная среда с DAPIVectorH-1500
Гигромицин B (50 мг/мл)Инвитроген10687010
кетамин гидрохлорид для инъекцийHENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH45822
KpnI-HFNEBR3142L
lenti-CRISPRv2-blastAddgene83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670Addgene99377
Lipofectamin 3000 Transfection KitInvitrogenL3000015
LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2   Addgene60625
LV-TRE-VP16 мышь MyoD-T2A-dsRedExpress2Addgene60626
мышь на мыши (M.O.M.) Базовый наборVectorBMK-2202
NotI-HFNEBR3189L
Opti-MEM I Пониженная сывороткаThermoFisher31985070
полиэтиленгликоль 4,000Alfa AesarAAA161510B
полибреномSIGMATR1003
Corning  БиоКоат Поли-Д-Лизин/Ламинин Культуральное СлайдCORNINGCB354688
PowerUp SYBR Зеленый Мастер МиксThermoFisherA25742
PrimeSTAR Max ПремиксTakaRaR045
Протеиназа KVIAGEN BIOTECH507-PKP
Пуромицин ДигидрохлоридMP BiomedicalsICN19453980
qPCR Лентивирус Набор для титрованияabmLV900
Набор для быстрой лигированияNEBM2200S
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)QIAGEN12945
RevertAid RT Набор для обратной транскрипцииThermo ScientificK1691
RNAzol RTMolecular Research Center, INCRN 190
T4 ДНК-лигаза реакционный буферNEBB0202S
T4 полинуклеотидкиназаNEBM0201S
потрясающий бульон модифицированныебиореагентыФишера BP9729-600
ViralBoost реагент (500x)ALSTEMVB100

Ссылки

  1. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  2. Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
  3. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  4. Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
  5. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
  6. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
  7. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
  8. Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
  9. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
  10. Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
  11. Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
  12. Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
  13. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  14. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
  15. Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  16. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
  17. Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244(2015).
  18. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  19. Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPR Cas923MyoDSendia

Похожие статьи