Method Article

Мульти-локус переменный номер Тандем-повтор Анализ рыбы-патогенной бактерии Yersinia ruckeri по multiplex PCR и Капиллярэлектрорез

DOI:

10.3791/59455

⸱

June 17th, 2019

 ,  , 
1Fish Health Research Group, Norwegian Veterinary Institute, 2University of Bergen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multi-Locus переменный номер тандем-повторный анализ (MLVA) анализ представлен здесь позволяет недорогой, надежный и портативный генотипирования высокого разрешения рыбы патогенной бактерии Yersinia ruckeri. Начиная с чистых культур, в ассейном используются мультиплексп ПЦР и капиллярный электрофорез для получения десятилокий профилей MLVA для приложений ниже по течению.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yersinia ruckeri является важным патогеном выращиваемых лососевых во всем мире, но простые инструменты, пригодные для эпизоотиологических исследований (отслеживание инфекции и т.д.) этой бактерии не хватает. Таким образом, анализ тандема с переменным числом Multi-Locus (MLVA) был разработан как легкодоступный и недвусмысленный инструмент для генотипирования восстановленных изолятов с высоким разрешением. Для анализа MLVA представлено здесь, ДНК извлекается из культивированных образцов Y. ruckeri путем кипячения бактериальных клеток в воде, а затем использование супернатанта в качестве шаблона для ПЦР. Primer-пары ориентации десять переменных числа тандем-повторить (VNTR) локусов, перемежаются по всему геному Y. ruckeri, распределяются поровну между двумя пятью plex PCR реакций работает в идентичных условиях езды на велосипеде. Передние грунтовки помечены любым из трех флуоресцентных красителей. После подтверждения амплитона гелем электрофорезом продукты ПЦР разбавляются и подвергаются капиллярному электрофорезу. Из полученных профилей электроферограммы пики, представляющие каждый из локусов VNTR, называются и используются для расчета повторных отсчетов VNTR в силико. В результате десятизначные профили MLVA затем используются для создания минимального охватывающего деревьев, позволяющих эпизоотиологические оценки кластерного анализа. Высоко портативные выходные данные, в виде численных профилей MLVA, можно быстро сравнить между лабораториями и поместить в пространственно-временном контексте. Вся процедура от культивируемой колонии до эпизоотиологической оценки может быть завершена на срок до 48 Y. ruckeri изолятов в течение одного рабочего дня.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yersinia ruckeri, Грамм-отрицательная бактерия и член семьи Yersiniaceae, вызывает yersiniosis в выращиваемых лососевых рыб во всем мире1. Он легко диагностируется от инфицированных рыб путем выращивания на многих видах агар средств массовой информации, но до недавнего времени, мало было известно о структуре населения и эпизоотиологии Y. ruckeri по всему миру и в различных средах обитания (принимающих видов и т.д.). Существующие серотипные системы для Y. ruckeri несовместимы, не имеют взаимной совместимости и предлагают низкое эпидемиологическое разрешение. Некоторые молекулярные исследования на бактерии были проведены, используя методы, такие как Multilocus последовательности ввода (MLST), Пульс-поле гель электрофорез (PFGE) или последовательность всего генома (WGS) анализ2,3,4 ,5. Тем не менее, MLST не обеспечивает достаточно высокое разрешение для рутинного отслеживания инфекции, в то время как PFGE является трудом требовательных и производит результаты, которые не легко портативных через лаборатории. Хотя анализ РГС обеспечит почти окончательное решение, создание и осуществление таких анализов будет предпосылкой технических и биоинформатических возможностей, которые, тем не менее, по-прежнему ограничиваются относительно небольшим числом лабораторий.

Multi-locus переменный номер тандем-повторный анализ (MLVA) представляет собой простой и легко доступный молекулярный инструмент ввода, который предлагает генетическое разрешение в некоторых случаях почти соответствует анализу WGS6,7. Метод основан на повторном изменении числа в выбранных парадем-повторении переменного числа (VNTR), в результате чего выходные данные, которые очень переносимы, что делает сравнение профилированных изолятов по отношению к онлайновым базам данных и через лаборатории простым. Хотя MLST остается золотым стандартом для эпидемиологического ввода многих бактериальных патогенов, все большее число исследований определить значительно выше дискриминационной мощности MLVA8,9,10. Несколько протоколов были также опубликованы ориентации рыбы патогенных бактерий, таких как Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida и Renibacterium salmoninarum11,12, 13.

Десять-loci MLVA протокол, представленный здесь, который недавно лег в основу обширного исследования Y. ruckeri населения14, включает в себя извлечение ДНК из агар-культивируемых колоний, мультиплекс ПЦР и капиллярного электрофореза (CE), затем вниз по течению в силико приложений. Для каждого исследованного изолята два пХР мультиплекса, которые содержат пять флуоресцентно обозначенных грунтовок (6FAM, NED или VIC), каждая из которых ориентирована на отдельные регионы ВНТР, работают параллельно в одинаковых условиях. После проверки ампликонов ПЦР с помощью гелевого электрофорезиса (GE) продукты ПЦР разбавляются до анализа СЕ, а пики, представляющие соответствующие локи VNTR, называются из полученных электроферограмм. Вместе с локусовыми формулами, учитывающими незначительные, специфические последовательность расхождения в миграционных моделях CE, вызовы размера VNTR CE затем используются для расчета повторных отсчетов VNTR, которые сливаются в десятизначные профили MLVA. Они используются в качестве входных данных для эпизоотиологических оценок (например, кластерного анализа в диаграммах минимального охвата дерева (MST).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ВНИМАНИЕ: Для полноты протокола рекомендуется проводить все процедуры влажной лаборатории стерильно с помощью лабораторных шуб, одноразовых перчаток и стерильных реагентов и оборудования. Также рекомендуется готовить пЦР-реакции в отдельной комнате (до ПЦР), не используемой для усиления ПЦР и/или обработки пЦР-продуктов (пост-ПЦР). Храните все реагенты в соответствии с рекомендацией производителя. Более подробную информацию о реагентах, оборудовании и программном обеспечении можно ознакомиться в таблице материалов.

1. Бактериальное культивирование и извлечение геномной ДНК

  1. Высажяйте чистые культуры Y. ruckeri на любом подходящем типе агара (авторы использовали 5% агара крови крупного рогатого скота) и инкубируют при 22 градусах По Цельсия в течение 1-2 дней, или 15 градусов по Цельсию в течение 3-4 дней.
  2. Из каждой агаровой пластины выберите одну представительную колонию с прививочной петлей и перенесите на 1,5 мл центрифуговых труб, содержащих 50 л сверхочищенной воды. Приостановить, вихрь кратко, и инкубировать в течение 7 мин на нагревательный блок при 100 градусах Цельсия.
  3. Центрифуга при 16 000 х г в течение 3 мин и используйте пипетку, чтобы аккуратно перенести супернатант в пустую 1,5 мл центрифуги. Переходке к следующему шагу, используя супернатант в качестве шаблона ДНК или хранить при -20 градусов по Цельсию до этого времени.

2. Мультиплекс PCR установки и велоспорт условия

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая реакция мультиплекса ПЦР (два на Y. ruckeri isolate) должна содержать 12,5 л 2x Multiplex PCR Plus мастер-микс, от 0,1 до 0,2 мкм каждой соответствующей пары грунтовок(таблица 1) и 3 л шаблона ДНК, скорректированного на окончательный объем реакции 25 л добавление воды без RNase. Цель, чтобы сохранить световое воздействие флуоресцентно помечены вперед-премьеры на минимальном уровне (например, путем упаковки их трубки хранения в алюминиевой фольге).

  1. Для каждого из двух мультиплекс пЦР-анализов(таблица1), подготовить мастер смеси, как описано выше (без шаблона ДНК) в зависимости от количества образцов плюс один положительный и один отрицательный контроль. Кроме того, позволяют 10% излишков объема. Вихрь подготовленный мастер мягко смешивается на низкой скорости.
  2. Распределить 22 зл и смеси каждого мастера отдельно в отдельные скважины на полосах ПЦР или пластинах, в зависимости от количества образцов, и добавить 3 зл и шаблона к каждой скважине (для положительного и отрицательного контроля, соответственно, используйте ДНК из проверенного Y. ruckeri процеживают и ультраочищенную воду). Печать и центрифуга кратко.
  3. Запустите все образцы на теплоцикле ПЦР со следующей программой: (i) 5 мин при 95 градусах по Цельсию (ii) 30 циклов 0,5 мин при 95 градусах по Цельсию, 1,5 мин при 60 градусах По Цельсию и 1 мин при 72 градусах По Цельсию и (iii) 60 мин при 68 градусах по Цельсию, а затем охлаждение до 4 градусов по Цельсию на неопределенный срок. Программа будет завершена менее чем за 3 ч.

3. ПЦР Амплитон Подтверждение Гель Электрофорез

  1. Согласно рекомендациям производителя, подготовьте объем 1,5% (w/v) агарозного геля в буфере 1x tris-borate-EDTA (TBE), подходящий для количества протестированных реакций ПЦР. Перед литьем добавьте 5 л флуоресцентных нуклеиновой кислоты красителя на 50 л гель-раствора и перемешайте. Используйте лотки и гребни по мере необходимости для литья, оставляя соответствующее количество колодцев свободными для ДНК эталонных лестниц.
  2. После установки погрузите гель в 1x TBE-буфер в системе GE. Смешайте 5 Зл ПЦР продукта вместе с 2 зл и красителя и перенесите в гелевые колодцы. Добавьте 5 зЛ ДНК-лестницы в пустые скважины для справки.
  3. Запустите гель на 110 V на 15 см в течение примерно 1 ч и используйте УФ-систему визуализации/визуализации геля для проверки наличия нескольких (до пяти) полос, представляющих ампликоны ПЦР (см. пример нарисунке 1). Отбросьте гель. Переходим к следующему шагу или храните оставшиеся продукты ПЦР при 4 градусах Цельсия до дальнейшей обработки.

4. Капиллярная электрофорасиза Настройка и условия выполнения

  1. После подтверждения ампронов ПЦР разбавляют продукты ПЦР 1:10 (v/v) в очищенной воде. Печать, смесь и центрифуга кратко.
  2. Работая в шкафу дыма, подготовить объем мастер смеси, состоящий из 9 зл формамида и 0,5 л стандарта размера на продукт ПЦР (позволяют 10% излишков объема). Vortex кратко и распределить 9,5 л в скважины на пластине, подходящей для доступной системы CE, прежде чем добавить 0,5 л разбавленного продукта ПЦР. Печать, смесь и центрифуга кратко.
    ПРЕДЕКТО: Ручка с осторожностью. Смешивание формамида с водой генерирует форму, которая является токсичной.
  3. Используя тепловой цикл ПЦР, денатурировать образцы при 95 градусах по Цельсию в течение 3 минут до охлаждения до 4 градусов по Цельсию на неопределенный срок. Centrifuge кратко и загрузить пластину на калиброванный CE системы в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Выполнить анализ фрагментов CE с использованием реагентов в соответствии с подходящими для аппарата выбора и следующих настроек: 60 градусов по Цельсию; 5 с инъекций при 1,6 кВ (32 В на см); 32 мин время бега при 15 кВ (300 В на см). Анализ фрагментов CE 24 скважин на 24-капиллярном (50 см) обычно занимает около 50 мин.

5. VNTR Размер вызова, Повторный расчет графа и MLVA Профилирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 5.1 описывает Y. ruckeri VNTR CE размер вызова из электроферограммы файлов, используя конкретное программное обеспечение, перечисленные в таблице материалов. Проконсультируйтесь с руководством по программному обеспечению для получения дополнительных деталей и устранения неполадок. Для использования другого программного обеспечения проконсультируйтесь с соответствующими руководствами.

  1. Файлы результатов импорта CE (два на y. ruckeri изолировать). Установите метод анализа на Microsatellite Default и выберите подходящий выбор продукта в соответствии со стандартом размера, прежде чем нажать кнопку «Анализ». Проверьте правильное определение стандартных фрагментов размера через редактор матча размера и исправьте любые явно ошибочные выделения.
    1. Выбрав образец (ы) для чтения, нажмите кнопку Display Plots и нажмите ctrl-A, чтобы можно было просматривать таблицу размеров. В то время как в верхней панели, удерживайте Ctrl при нажатии на пять пиков, представляющих усилители VNTR (использовать зуминг инструмент по мере необходимости).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого из продуктов мультиплексп ПЦР, электроферограмма покажет пять пиков, распределенных между тремя используемыми красителями (см. 5' маркировку красителей форвардных праймеров в таблице 1 и двух примерах на рисунке 2).
    2. Нажмите ctrl'G, чтобы отфильтровать таблицу размеров,показывая только характеристики пяти выделенных пиков, и записывайте вызовы размера CE для каждого локуса VNTR (со ссылкой на таблицу1) для применения ниже по течению.
  2. Для того, чтобы учитывать предвзятые модели мобильности ампликонов во время CE, вычислить точные vNTR повторных подсчетов в соответствии с формулой, приведенной ниже, используя VNTR CE размер звонки вместе с локус-специфических переменных (см. Таблица 1). Для повышения эффективности рекомендуется автоматизировать этот процесс (например, с помощью шаблона электронной таблицы).
    figure-protocol-1
  3. Круглый расчетный повтор VNTR отсчитываетдо до ближайшего рядового и конкретируется в десятизначные строки, каждый из которых представляет профиль MLVA одного изолята Y. ruckeri.

6. Минимальный кластерный анализ mlVA

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 6 описывает создание диаграмм MST из данных Y. ruckeri MLVA, используя конкретное программное обеспечение, перечисленное в таблицематериалов. Проконсультируйтесь с руководством по программному обеспечению для получения дополнительных деталей и устранения неполадок. Для использования другого программного обеспечения проконсультируйтесь с соответствующими руководствами.

  1. Создайте новую базу данных и выберите для активации плагина MLVA.
  2. Импорт Y. ruckeri MLVA профилей и метаданных, выбрав тип символов данных следуют импортные поля и символы (дальнейший подотбор в зависимости от формата хранения). При запросе укажите правила импорта в соответствии с содержанием файла импорта: В столбце типа destination классифицируйте повтор VNTR как значение персонажа: VNTR, и различные метаданные как информация о входе: Поле информации о вступлении .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения и контекста можно также импортировать весь опубликованный набор данных (открытый доступ) вместе с исходным документом с использованием настоящего протокола MLVA14. ПРОФИЛи MLVA и метаданные о разнообразной коллекции изолятов Y. ruckeri (n No 484) в этом исследовании можно получить из его дополнительного материала (Таблицы S1 и S2) по следующей ссылке: https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files
  3. В панели типа Эксперимента откройте вход VNTR и установите минимальные и максимальные значения для каждого локуса VNTR до 0 и 100,соответственно. В общих настройкахустановите число десятичных цифр до 0 и выберите числа под типом данных. Проверьте, чтобы считать отсутствующие значения нулевыми.
  4. Выберите импортируемые образцы, предназначенные для кластерного анализа MST, и нажмите кнопку «Создать новое сравнение» (в панели сравнения).
    1. При желании для визуального представления MST выделите образцы цветным группам (например, в соответствии с определенной чертой метаданных), используя различные варианты, доступные в панели групп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Группы также могут быть созданы/изменены ретроспективно, после следующих шагов.
    2. Выберите Расширенный кластерный анализ... и MST для категориальных данных для создания диаграммы MST на основе выбранных образцов.
    3. Дальнейшее изменение визуального представления MST в качестве предпочтительного (например, путем добавления параметров раздела, маркировки узлов/ветвей, перекрестных ссылок, легенд и т.д.). Смотрите пример на рисунке 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кластер (клональный комплекс) порог раздела 4/10 неидентичных loci VNTR, в дополнение к сокрытию ветвей соединений, представляющих неидентичные loci VNTR, ранее использовался для кластерного анализа MST на основе данных MLVA, генерируемых с помощью этого протокола14. При условии импорта вышеупомянутого набора данных из 484 профилей Y. ruckeri MLVA эти образцы также могут быть включены в кластерный анализ MST (как описано выше) для обеспечения глобального и исторического контекста. Это, например, облегчит идентификацию любых образцов, связанных с ранее описанными клональными комплексами, а также образцов, представляющих еще не описанные линии. В зависимости от имеющихся метаданных полученная диаграмма MST может быть тщательно изучена различными способами, например, для обнаружения возможных шаблонов кластеризации, связанных с определенными чертами (география, хост, время и т.д.).
    4. При необходимости экспортировать завершенный MST в желаемом формате с помощью выбора изображений Экспорта.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После мультиплекса PCR, как описано здесь, типичное изображение GE, проверяющее наличие нескольких амплеконов от каждой реакции ПЦР показано на рисунке 1. Анализ фрагментов CE вниз по течению, выполненный на проверенных продуктах ПЦР, для каждого изолировать Y. ruckeri, в результате чего будут два электроферограммы файлов, используемых для вызова размера соответствующего Loci VNTR(рисунок 2). Из анализа 484 разнообразных изолятов Y. ruckeri, не было совпадений в диапазоне размеров ампликона не наблюдалось между локусом VNTR, помеченными тем же красителем в той же реакции мультиплекса (Таблица 1)14. Поэтому каждый из электрофоретических пиков можно однозначно определить по цвету.

После импорта профилей MLVA и соответствующих метаданных в предпочтительное программное обеспечение, диаграммы MST могут быть построены, как описано для изучения любых эпидемиологических моделей, представляющих интерес к материалу. Проконсультируйтесь с соответствующими руководствами для получения дополнительных опций, доступных в соответствующем программном обеспечении. В качестве примера на рисунке 3 показано сравнение MST профилей MLVA для изолятов Y. ruckeri, извлеченных из рыбы, связанной с пятью различными лососевыми фермами в Норвегии.

Последовательные размеры повторения десяти локутов VNTR, а также их in vitro и in vivo stability, ранее были проверены в первоначальном исследовании, основанном на этом протоколе14. Кратко, это было сделано с использованием секвенирования Sanger (повторный размер), и MLVA набрав несколько изолятов после серийных проходов (в пробирке) и в рамках отдельных вспышек болезни (in vivo). Кроме того, экологическая стабильность локусов с течением времени была изучена путем ввода нескольких изолятов "домашнего штамма", извлеченных в течение нескольких лет из постоянно зараженных мест производства пресной воды для атлантического лосося.

figure-results-1
Рисунок 1 : Гель электрофорез, проверяющий наличие нескольких продуктов ПЦР. Изображение подтверждает наличие нескольких амплетонов ПЦР во всех 12 полосах, содержащих образцы, при этом первая полоса представляет собой лестницу ДНК. Были указаны размеры отдельных фрагментов лестницы, а также пЦР-тест и деформация (см. таблицу S1 в Gulla et al. 201814)принадлежность каждой полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2 : Электроферограммы, показывающие пики, соответствующие ампликонсам VNTR. Названия различных loci VNTR указаны, с красителя этикетки (VIC и зеленый; NED - черный; 6FAM и синий) в скобках. Две электроферограммы (PcR-асссс 1 верхняя часть; ПЦР-ассса 2 дна) происходит от ввода одного изолята Y. ruckeri. Оранжевые пики (краситель ЛИЗ) представляют собой стандарт размера используется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3 : Пример Минимального охвата дерева для эпидемиологической оценки. Диаграмма основана на профилях MLVA из изолятов Y. ruckeri, извлеченных из атлантического лосося на пяти различных норвежских фермах (1-5; см. легенду) с периодическими вспышками йерисниоза. Можно наблюдать четкую тенденцию кластеризации, связанную с происхождением фермы. Кроссссылки показывают все возможные соединения, связанные с неидентичными loci VNTR (см. легенду). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4 : Электроферограмма визуализации заикания и раскол пиков. В этом случае, оба происходят одновременно, что не всегда так. Более длинный и высокий пик, представляющий locus YR1070 VNTR, можно легко выделить. Дисплей увеличен и показывает только пики синих красителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-5
Таблица 1: Характеристики локуса VNTR. Соответствующие характеристики десяти регионов Y. ruckeri VNTR были поставлены в настоящее время протоколом MLVA.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оба мультиплекса PCRs представлены здесь оказались относительно надежными в условиях плохого качества ДНК шаблона, но отсутствие усиления ПЦР, тем не менее, иногда наблюдалось при использовании шаблонов с чрезвычайно высокой концентрацией ДНК. Эти проблемы были легко решены путем разбавления шаблонов до ПЦР. Другие методы извлечения ДНК, чем те, которые используются здесь, также могут быть использованы (например, коммерческие наборы).

Хотя от каждой реакции ПЦР ожидается пять ампликонов, от GE не всегда следует ожидать пяти эффектных диапазонов, так как некоторые (по-разному обозначенные) локи VNTR в пределах одной реакции имеют перекрывающиеся диапазоны размеров. Окончательное время расширения ПЦР на 60 мин может быть сокращено при необходимости, но, скорее всего, приведет к увеличению возникновения сплит пиков в последующих электроферограммах CE (см. ниже). Примечательно, что, поскольку цель шага GE заключается исключительно в качественной проверке ампликонов ПЦР, время выполнения, напряжение и/или рецепт геля могут быть скорректированы в качестве предпочтительного. Если GE наблюдает особенно слабые полосы, то может быть целесообразным уменьшить коэффициент разбавления этих образцов до CE.

В то время как описанный здесь протокол CE был запущен на конкретном коммерческом аппарате электрофореза капилляров (см. Таблицаматериалов), различные системы CE могут иметь различные требования к выборке, что, в свою очередь, может вызвать некоторые изменения в протоколе . Для анализа фрагментов в руководстве соответствующего производителя системы CE можно усмотреть руководство по соответствующим реагентам/оборудованию, калибровке и т.д. Существует также возможность того, что предвзятые модели мобильности ампликонов, наблюдаемые во время CE, могут отличаться, относительно, в системах ce и/или машинах, как это было ранее задокументировано для других протоколов MLVA15,16. Если происходит в той степени, где окончательные (округленные) VNTR повторных отсчетов становятся затронутыми, это означает, что локус конкретных переменных s и i (таблица 1), используется для определения VNTR повторных отсчетов, должны быть перекалиброваны. Это включает в себя линейную регрессию на участках сравнения точных размеров последовательности по сравнению с CE размер звонки, как описано Gulla et al. 201814.

Сплит пики и пики заикания, как известные артефакты в CE на основе MLVA набрав17, можно наблюдать в электроферограммах во время вызова размера (Рисунок 4). В то время как пики заикания следует игнорировать, более длинный пик должен последовательно побираться для приложений вниз по течению в случае разделенных пиков, разделенных одной базовой парой. Кроме того, отсутствующие пики, указывающие на отсутствие конкретных локусов VNTR редки, но могут возникнуть, и в этом случае следует назначить повторный подсчет '0'. Если начальная культура, из которой извлекается ДНК, не является чистой (т.е. содержит более одного подтипа Y. ruckeri), то после CE могут наблюдаться несколько высоких пиков, соответствующих различным аллелям одного и того же локуса/локусов. Вторичное культивирование должно быть выполнено из отдельных колоний до новой добычи ДНК для повторного ввода.

Как указано в протоколе, шаблон ДНК для ПЦР должен по умолчанию быть извлечен из чистых культур Y. ruckeri. В некоторых случаях, однако, образцы яичной жидкости, положительные для Y. ruckeri qPCR (Ct-values zlt; 27) были успешно MLVA набраны непосредственно, без предварительного культивирования, используя увеличенное количество геномной ДНК (извлеченной с коммерческим комплектом) в качестве шаблона. Хотя этот подход не был тщательно протестирован и не проверен, он указывает на потенциал этого анализа MLVA для изучения сложных биологических матриц, содержащих ДНК из целого ряда различных организмов в дополнение к Y. ruckeri.

Вся представленная здесь процедура ввода MLVA, от экстракции ДНК до эпизоотиологической оценки, может быть завершена за один рабочий день. Тем не менее, количество исследованных образцов находится в сублинейной связи со временем, необходимым для извлечения ДНК, ПЦР и CE, и поэтому метод является гораздо более эффективным временем при запуске нескольких образцов одновременно. Это, тем не менее, относится к большинству лабораторных методов, и в качестве инструмента для эпидемиологического субтипирования Y. ruckeri, сочетание высокого разрешения, простоты и портативности делает этот анализ MLVA выше ранее опубликованных протоколов4 ,5. Он также был использован для проверки ограниченной эпидемиологической значимости Y. ruckeri серотипирования14.

Благодаря комплексному исследованию популяции на основе MLVA с участием 484 Y. ruckeri изолятов, извлеченных из целого ряда пространственно-временное происхождение и места обитания (рыба-хозяин, окружающая среда и т.д.), наше понимание в отношении эпизоотиологии и населения структура этого важного патогена рыбы была существенно увеличена14. Типирование MLVA позволило отслеживать клонов, распространяемых антропогенно на протяжении десятилетий, предположительно путем транспортировки рыбы, а также идентификацию местных штаммов. Кроме того, в то время как некоторые клональные комплексы бактерии могут быть явно связаны с болезнями, в частности, с рыбой (радужная форель и атлантический лосось, соответственно), другие были восстановлены только из экологических источников и/или клинически незатронутых рыб Образцов. Таким образом, применимость метода не ограничивается лишь отслеживанием инфекции, поскольку она может также предоставлять информацию, имеющих потенциальную значимость, например для разработки вакцин, оценки рисков и поддержания национальной биобезопасности. В настоящее время он активно используется в Норвежском ветеринарном институте в качестве инструмента для исследования диагнозов Y. ruckeri в норвежской аквакультуре.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование финансировалось Норвежским исследовательским фондом морепродуктов FHF (проект No 901119 и 901505). Мы хотели бы поблагодарить всех участников бактериальных изолятов и образцов, используемых при разработке метода.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
22° C/15° C инкубаторПо желанию.NA
5' Грунтовка с маркировкой, 10K PMOL, обессоленная, сухаяThermo Fisher Scientific450007Последовательности и маркировка в таблице 1. Подготовьте рабочие жидкости в TE-буфере.
Агароза, универсальная, peqGOLDVWR732-2789P/732-2788Используется при гелевом электрофорезе.
Avant 3500xL Генетический анализаторThermo Fisher ScientificA30469Используется для анализа фрагментов капиллярного электрофореза.
Модули BioNumerics7Прикладная математикаNAИспользуются для создания минимальных остовных деревьев на основе данных MLVA.
Центрифуга(ы)По желанию.NA
Custom DNA Oligo, 25N, обессоленная, сухаяThermo Fisher ScientificA15612в таблице 1. Подготовьте рабочие жидкости в TE-буфере.
Загружающий краситель для ДНК геля (6X)Thermo Fisher ScientificR0611Загрузочный краситель, используемый во время гель-электрофореза.
Пробирки Eppendorf Safe-Lock, 1,5 млПробирки Eppendorf30120086центрифуги, используемые во время экстракции ДНК.
Морозильная камерапо желанию.NA
Вытяжной шкафПо желанию.NA
Система гель-электрофорезаПо желанию.NA
GelRed Краситель для нуклеиновых кислот, 10 000X в водеBiotium41003Флуоресцентный краситель нуклеиновой кислоты, используемый во время гель-электрофореза.
Программное обеспечение GeneMapper 5Thermo Fisher Scientific4475073Используется для чтения электроферограмм из капиллярного электрофореза.
Лестница для ДНК GeneRuler 50.н., готовая к использованиюThermo Fisher ScientificSM0373используемая во время гель-электрофореза.
Стандарт размера красителя GeneScan 600 LIZ v2.0Thermo Fisher Scientific4408399Стандартный размер, используемый при капиллярном электрофорезе.
Нагревательный блокПо желанию.NA
Hi-Di FormamideThermo Fisher Scientific4311320/4440753Деионизированный формамид, используемый во время капиллярного электрофореза. Подготовьте рабочие аликауты.
Milli-Q waterNANAОчищенная вода, используемая при проведении ПЦР и капиллярного электрофореза. Стандартный рецепт; Производится собственными силами.
Мультиплексная ПЦР  Плюс  НаборQiagen206151/206152
ПЦР термоамплификаторПо желанию.NA
POP-7 Полимер для 3500 Dx/3500xL Dx Генетические анализаторыThermo Fisher ScientificA26077/4393713/4393709Разделительная матрица, используемая во время капиллярного электрофореза.
Чистая культура Yersinia ruckeriNANA, например, криоконсервированная или свежая.
Вода без РНКазыQiagenNAIn: Мультиплексная ПЦР  Плюс  Набор
Трис-борат-ЭДТА (TBE)   буферNANAСтандартный рецепт; производится на собственном производстве.
Трипсин соевый агар/агар бычьей кровиNAСтандартныйрецепт; производится на собственном производстве.
Система визуализации/визуализации геля на основе УФ-излученияПо желанию.NA
VortexerКак предпочтительно.NA
последовательности ДНК-лестница ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).">Barnes, A. C. Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri). Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).
  2. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095(2016).">Barnes, A. C., et al. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095(2016).
  3. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73(2015).">Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73(2015).
  4. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).">Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).
  5. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).">Wheeler, R. W., et al. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).
  6. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).">Eyre, D. W., et al. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).
  7. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).">Sun, M., et al. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).
  8. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, SUPPL 2 104-105 (2009).">Bouchouicha, R., et al. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, SUPPL 2 104-105 (2009).
  9. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).">Dahyot, S., et al. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  10. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).">Elberse, K. E. M., Nunes, S., Sá-Leão, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).
  11. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285(2013).">Matejusova, I., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285(2013).
  12. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252(2013).">Duodu, S., et al. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252(2013).
  13. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).">Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., Sørum, H. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).
  14. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).">Gulla, S., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).
  15. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).">Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).
  16. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33(2006).">Lista, F., et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33(2006).
  17. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014).">Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Yersinia ruckeriMLVA assayMultiplex PCRCapillary ElectrophoresisVNTR lociDNA extractionGel electrophoresisGene MapperBioNumericsMinimum spanning tree

Related Articles