Методическая статья

VirWaTest, пункт использования метод для обнаружения вирусов в образцах воды

DOI:

10.3791/59463

⸱

11 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем VirWaTest, который является простым, доступным и портативным методом для концентрации и обнаружения вирусов из образцов воды в точке использования.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирусы, выделяемые людьми и животными, могут загрязнять источники воды и представлять опасность для здоровья человека, когда эта вода используется для питья, орошения пищевых продуктов, мытья и т.д. Классический индикатор фекальных бактерий не всегда проверяет наличие вирусных патогенов, поэтому обнаружение вирусных патогенов и вирусных показателей имеет отношение к принятию мер по снижению риска, особенно в гуманитарных сценариях и в районах где часто происходят вспышки вирусной инфекции, передаваемой через воду.

В настоящее время для тестирования в точке использования доступно несколько коммерческих тестов, позволяющих количественно определить бактерии фекальных индикаторов (FIB). Однако такие коммерческие тесты недоступны для обнаружения вирусов. Обнаружение вирусов в пробах воды в окружающей среде требует концентрации нескольких литров в меньших объемах. Кроме того, после сосредоточения, обнаружение вирусов опирается на такие методы, как добыча нуклеиновой кислоты и молекулярное обнаружение (например, полимераза цепной реакции (PCR основе анализов) вирусных геномов.

Описанный здесь метод позволяет концентрацию вирусов из 10 L проб воды, а также извлечение вирусных нуклеиновых кислот в точке использования, с простым и портативным оборудованием. Это позволяет проводить тестирование проб воды в точке применения нескольких вирусов и полезно в гуманитарных сценариях, а также в любом контексте, где не имеется оборудованной лаборатории. Кроме того, метод позволяет концентрировать вирусы, присутствующие в пробах воды, и отгружать концентрат в лабораторию при комнатной температуре для дальнейшего анализа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На первых этапах любой чрезвычайной гуманитарной помощи доступ к чистой воде, санитарии и гигиене имеет решающее значение для выживания пострадавших. Поэтому мониторинг качества воды является приоритетной задачей для предотвращения вспышек воды. Хорошо известно, что загрязненная вода часто является источником заболеваний, но часто бывает трудно определить источники вирусных вспышек, таких как вирус гепатита Е (HEV), даже при наличии обычных лабораторных методов. Контроль качества воды основан на количественной оценкеFIB 1, 2,3,4. Тем не менее, было широко документировано, что нет никакой корреляции между отсутствием FIB и наличие вирусных патогенов, передающихся через воду, таких как ротавирус (RoV), норовирус (NoV), или HEV5,6. Таким образом, использование критериев качества воды, основанных на FIB, может привести к недооценке рисков, связанных с наличием вирусных патогенов, передающихся через воду. Наблюдение за вирусами индикаторов, такими как аденовирусы человека (HAdV), или конкретные патогенные микроорганизмы будут полезны в определении воздействия вирусных патогенов и выявлении потенциального источника инфекции человека7,8, 9,10 и в проверке эффективности санитарных мер11.

До сих пор выявление вирусов в этих сценариях опиралось на квалифицированный персонал и сложную логистику. VirWaTest (virwatest.org) направлена на разработку простого, доступного и портативного метода концентрации и последующего обнаружения вирусов из проб воды в момент использования.

Концентрация вируса основана на принципе органической флоккуляции 10 Л проб воды, с помощью которых вирусы восстанавливаются в меньших объемах12,13. Флоксы собираются и добавляются в буфер, который лизирует вирусы и предотвращает деградацию нуклеиновых кислот при их комнатной температуре не более 2 недель.

Метод извлечения нуклеиновой кислоты основан на использовании магнитных частиц, к которым адсорбируются нуклеиновые кислоты. Они могут быть переданы из одного буфера стирки в другой и, наконец, в буфер elution с помощью магнитной пипетки, к которой прикрепляются частицы. Полученные вирусные нуклеиновые кислотные суспензии могут быть отправлены в референтную лабораторию, где обнаружение может быть выполнено с использованием молекулярных методов, основанных на ПЦР. Для каждой добычи нуклеиновой кислоты, два различных количества тестируются, чтобы исключить ферментативное ингибирование, возникшее в образе. Кроме того, при минимальной доступности оборудования, ПЦР-тесты могут быть запущены в точке использования. Весь процесс предназначен для выполнения независимо от источника питания(рисунок 1).

Количественный ПЦР-аналитика для обнаружения HAdV, выведенного человеком и обнаруженного в пробах сточных вод в высоких концентрациях, был адаптирован для запуска в точке применения. HAdV используются в качестве человека фекальные вирусные показатели. ПЦР для количественной оценки бактериофага MS2 также был адаптирован, так как MS2 используется в VirWaTest в качестве управления процессом. Метод может быть настроен для обнаружения любого вируса, интересуемого.

После разработки метод VirWaTest был применен пользователями в двух различных условиях в Центральноафриканской Республике (RCA) и Эквадоре, обеспечивая обратную связь о применении протокола в реальных ситуациях.

Насколько нам известно, это первая процедура, которая позволяет концентрации и обнаружения вирусов в точке использования, независимо от какого-либо источника питания, большого оборудования и условий замораживания/охлаждения. Рекомендуется собрать по две реплики каждого образца воды, чтобы получить надежные результаты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка и упаковка

ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы/оборудование, которые будут упакованы, перечислены в таблице 1. Используйте перчатки для обработки реагентов, необходимых для контроля процесса, реагентов концентрации, реагентов для извлечения нуклеиновой кислоты и реагентов обнаружения. Носите защитные очки для обработки реагентов, необходимых для извлечения нуклеиновой кислоты.

  1. Контроль процессов
    1. Подготовка MS2 бактериофаг фондовой культуры (Американская коллекция культуры типа (ATCC) 15597-B1), содержащий 1 х 1010 PFU/mL в лаборатории, следуя процедуре ISO 10705-1:199514.
    2. Затем, aliquot 10 qL подвески на трубку, содержащую 1 х 108 PFU в 10 мл труб и пусть вода испаряется при 37 градусов по Цельсию. Используйте одну трубку на образец воды.
    3. Кроме того, приготовьте одну трубку, содержащую 10 мл стерильной дистиллированной воды на собранный образец.
  2. Концентрационные реагенты
    1. Для префлокированного обезжиренного молочного раствора (PSM) используйте следующие количества, чтобы сконцентрировать пять проб воды 10 л.
      1. Приготовьте пластиковую трубку, содержащую 5 г обезжиренного молока.
      2. Приготовьте полиэтиленовый пакет на молнии, содержащий 16,66 г морских солей.
      3. Приготовьте пластиковую бутылку, содержащую 500 мл дистиллированной воды.
    2. Подготовьте реагенты, необходимые для регулировки рН. Используйте следующие суммы для регулировки рН PSM и пяти 10 l проб воды.
      1. Добавьте 5 г лимонной кислоты 1-гидрат ампрогидат в пластиковую трубку 10 мл.
        ВНИМАНИЕ: Лимонная кислота вызывает серьезное раздражение, когда он вступает в контакт с глазами. Если это происходит, ополчить глаз осторожно с водой в течение нескольких минут. Если раздражение сохраняется, обратитесь к врачу.
      2. Положите 2 г гидроксида натрия в пластиковую трубку 10 мл.
        ВНИМАНИЕ: Гидроксид натрия может вызвать сильные ожоги кожи и повреждения глаз. Если проглотить, промыть рот. Не вызывайте рвоту. Если он соприкасается с глазами, осторожно смыть водой в течение нескольких минут. Затем обратитесь к врачу.
      3. Положите 25 мл стерильной дистиллированной воды в пластиковый контейнер.
      4. Положите 50 мл стерильной дистиллированной воды в пластиковый контейнер.
    3. Подготовьте пакетик кондиционирования образца, используемый для флоккуляции, консервантный раствор, используемый для сохранения нуклеиновых кислот, и нейтрализующий пакетик для нейтрализации отбрасываемой воды и материалов. Используйте следующие суммы для каждого образца воды 10 Л для тестирования.
      1. Положите 15 г морских солей и 8 г лимонной кислоты 1-гидрат в застежку-молнию полиэтиленовый пакет для кондиционирования пакетик.
      2. Добавьте 2 мл буфера лизиса(Таблицаматериалов) и 0,3 мл агента сохранения нуклеиновой кислоты (Таблицаматериалов)в трубку 5 мл.
        ВНИМАНИЕ: Лисис буфер содержит гуанидин тиоцианат и Тритон X-100. Контакт с кислотой высвобляет токсичный газ, и это вредно, если проглотить, вдыхать, или вступает в контакт с кожей. Если проглотить, промыть рот. Не вызывайте рвоту. Если он соприкасается с кожей, мыть с большим количеством воды. Затем обратитесь к врачу. Нуклеиновая кислота, сохраняющая агент вызывает раздражение кожи и глаз и вредно при проглатывании. Если он соприкасается с кожей или глазами, промыть обильной водой в течение нескольких минут. В любом случае, особенно если проглотил и чувствует себя плохо, обратитесь к врачу.
      3. Положите 40 г порошка моющего средства в четыре пластиковых пакета молнии.
        ВНИМАНИЕ: Порошковое моющее средство вызывает раздражение глаз. Если он соприкасается с глазами, промыть обильной водой в течение нескольких минут. Если раздражение сохраняется или если проглотил, обратитесь к врачу.
  3. Реагенты по извлечению нуклеиновой кислоты
    1. Положите 50 л магнитных частиц(Таблицаматериалов) и 1 мл этанола 96% в трубку 5 мл, которые составляют связывающий буфер.
      ВНИМАНИЕ: Магнитные частицы буфера содержит азид натрия, который образует токсичный газ, когда он вступает в контакт с кислотами или ионами тяжелых металлов и является токсичным, если попадает или когда он вступает в контакт с кожей. При погловал или в контакте с кожей, промыть рот или кожу с обильной водой и обратиться к врачу. Этанол является легковоспламеняющейся жидкостью и паром и вызывает серьезное раздражение глаз. Держитесь подальше от тепла, горячих поверхностей, искр и любого другого источника зажигания. Если он соприкасается с кожей или глазами, промыть обильной водой. В случае проглатывания большого количества воды и/или при вдыхании выйдите на свежий воздух на свежий воздух. В любом случае, обратитесь к врачу.
    2. Добавьте 500 кЛ, 600 л и 200 л стиральных буферов 1, 2 и 3, соответственно(Таблицаматериалов), к трем трубам 2 мл.
      ВНИМАНИЕ: Стиральные буферы содержат гиоцинат тиоцианат и хлорид гуанидиний, которые вредны при вдыхании или проглатывании и раздражают кожу и глаза. Контакт с кислотами высвобождает очень токсичный газ. Если они вступают в контакт с кожей или глазами, промыть обильной водой. Если проглотить, промыть рот с обильной водой. Не вызывайте рвоту. Всегда обращитесь за медицинской консультацией.
    3. Добавьте 120 л буфера elution(Таблицаматериалов) к трубке 0.5 mL.
  4. Реагенты обнаружения HAdV и MS2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Две различные реакции извлечения нуклеиновой кислоты могут быть проанализированы одновременно в каждом анализе ПЦР, если 8-колодец термоциклер используется. Для всех анализов ПЦР, подготовить молекулярной биологии воды aliquoted в 1,5 мл труб.
    1. Обнаружение HAdV
      1. Подготовьте смесь, содержащую 10 кЛ из 22,5 мкм AdF вперед грунтовки, 10 зЛ 22,5 мкм AdR обратной грунтовки, и 5 зл 11,25 мкм AdP зонд (Таблица 2).
      2. Добавьте 2,5 л смеси в трубки от 1 до 8 прокладки трубки. Дайте ему высохнуть при комнатной температуре, закройте трубки и защитите их от света.
      3. Разрежьте полосу, разделяющую ее на две полосы: трубки 1-5 и трубки 6-8.
      4. Подготовьте серийное разбавление суспензий ДНК, содержащих нуклеотидную последовательность усиленной области HAdV. Воздушно-сухие 1 л суспензий, содержащих 1 х 105, 1 х 107,и 1 х 109 GC/mL в трубки 6-8.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Держите трубки, содержащие грунтовки, зонд, и высушенные воздухом суспензии защищены от света.
    2. Обнаружение MS2
      1. Подготовьте смесь, содержащую 10 зл 25 мкм pecson-2F передний грунт, 10 зл из 25 мкм pecson-2R обратной грунтовки, и 2,5 зл и 25 мКМ PecP-2 зонда (Таблица 2).
      2. Добавьте 2,25 л смеси в трубки от 1 до 8 прокладки трубки. Дайте ему высохнуть при комнатной температуре, закройте трубки и защитите их от света.
      3. Разрежьте полосу, разделяющую ее на две полосы: трубки 1-5 и трубки 6-8.
      4. Продолжить как в шаге 1.4.1.4, но использовать стандартную подвеску, предназначенную для MS2 вместо.

2. Вирусная концентрация

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки в любое время во время сбора проб, подготовки реагентов, флоккуляции, сбора флоксов и процедур удаления отходов. Носите защитные очки во время процедуры подготовки реагента.

  1. Коллекция образцов
    1. Соберите 10 л образца воды в плоском нижнем ведре с крышкой. Соберите минимум две реплики для каждого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать прозрачные ведра для визуализации гранул. Если образец воды содержит взвешенный материал (например, песок, водоросли), пусть это осадок, а затем, собирать воды супернатант в новом ведре.
    2. Зарегистрируйте собранный объем, а также дату расположения и сбора для каждого образца воды.
    3. Положите магнитный мешалку, подключенную к батарее под поддержкой ведра и поместите ведро, содержащее образец воды, на его поддержку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ищите плоскую поверхность в свежем месте и держите ведра, содержащие образцы воды от прямых солнечных лучей.
  2. Подготовка реагентов
    1. реагенты реагенты реагенты регулировки pH
      1. Налейте порошок лимонной кислоты и гранулы гидроксида натрия в кастрюли, содержащие 25 и 50 мл дистиллированной воды, соответственно.
      2. Аккуратно встряхните вручную до полного растворения лимонной кислоты и гидроксида натрия.
        ВНИМАНИЕ: Не наливайте воду на гранулы гидроксида натрия. Вместо этого, залить натрия гидроксида гранулы над водой.
    2. Префлоккуляция обезжиренного молока
      1. Поместите стоячий мешок на магнитный мешалку и залить 500 мл дистиллированной воды в нем. Бросьте помешивающий магнит внутри мешка и включите магнитный мешалку.
      2. Налейте содержимое пакетика морской соли и обезжиренной молочной трубки в стоячий мешок и перемешать в течение 5 минут на средней скорости, чтобы растворить их.
      3. Добавьте 3 мл лимонной кислоты в раствор PSM с помощью пипетки Pasteur, чтобы убедиться, что рН находится между 3,4 и 3,6. Измерьте рН раствора PSM с помощью полос индикатора pH. Добавить меньшее количество лимонной кислоты и гидроксида натрия, как рН становится ближе к 3,5.
      4. Выключите магнитный мешалку и убедитесь, что флоксы видны. Используйте фонарик, чтобы помочь визуализировать флоксы.
  3. Флокуляции
    1. Бросьте помешивающий магнит в воду, установите магнитную мешалку на максимальной скорости и включите его. Убедитесь, что помешивая магнит начинает вращаться.
    2. Добавьте 10 мл дистиллированной воды в трубку управления процессом. Перевернуть трубку несколько раз, чтобы регидратировать вирусный запас и залить раствор в воду.
    3. Налейте содержимое одного образца кондиционирования пакетик в воду и перемешать в течение 5 минут.
    4. Измерьте рН образца воды с помощью полос индикатора рН. Добавьте несколько капель лимонной кислоты или гидроксида натрия в образец воды, чтобы убедиться, что рН находится между 3,4 и 3,6. Добавить меньшее количество лимонной кислоты и гидроксида натрия, как рН становится ближе к 3,5.
    5. Добавьте 100 мл раствора PSM с помощью контейнера объемом 100 мл.
    6. Запечатать ведро крышкой, установить магнитный мешалку на минимальной скорости, и оставить воду помешивая на 8 ч.
    7. Выключите магнитный мешалку и пусть вода еще, по крайней мере 5 ч, чтобы флоксы осесть.
  4. Коллекция Floc
    1. Построить систему сифонирования, состоящую из контроллера пипетки, двух пипетки, и пластиковой трубки, чтобы аспирировать супернатант воды для разрядки воды на флоксах.
      1. Прикрепите 10 мл ленты конец пипетки на контроллер пипетки. Затем прикрепите кончик пипетки к пластиковой трубке.
      2. Снимите фильтр 10 мл пипетки с открытым наконечником с помощью пинцета и прикрепите пипетку к пластиковой трубке.
    2. Поместите пустое ведро на пол.
    3. Погрузите кончик пипетки с открытым наконечником в воду. Убедитесь в том, чтобы держать его близко к поверхности воды, чтобы избежать тревожных флоксов. Призадыхать о водном супернатанте, пока не достигнет котлеты на пленке.
    4. Pinch пластиковой трубки к концу прилагается к ленте конце пипетки и отсоедините его от пипетки.
    5. Поместите трубку в пустое ведро. Отпустите давление на трубку, чтобы вода текла в пустое ведро.
    6. Pinch пластиковой трубки, чтобы остановить поток воды, когда уровень воды вот-вот достигнет перемешивания магнита и переместить пипетку от ведра.
    7. Встряхните ведро, чтобы повторно приостановить flocs и залить их в 500 мл стоячий полиэтиленовый пакет. Разрешить флоксы, чтобы согласиться на 1 ч больше.
    8. Тщательно аспирируйте водный супернатант с помощью 50 мл пипетки и ручного контроллера пипетки, избегая нарушения флоксов.
    9. Приготовьте флоксы с помощью 100 мл пипетки и перенесите их в 50 мл центрифуги трубки. Запишите окончательный объем концентрата образца и перенесите 1 мл его в трубку 5 мл, содержащую консервантный раствор, используя пипетку Pasteur.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы центрифуга трубки градуирована, чтобы окончательный объем концентрированного образца можно было измерить как можно точнее и зарегистрировать.
    10. Выполните добычу нуклеиновой кислоты в поле. Кроме того, храните консервантный раствор, содержащий вирусы, на уровне 20-30 градусов по Цельсию в течение 15 дней или отправляем их в справочную лабораторию для дальнейшего анализа.
  5. Утилизация отходов и повторное использование материалов
    1. Добавьте содержимое нейтрализуемого саше в ведро, содержащее отбрасываемую воду. Смешайте воду, а затем, оставить его еще на 30 минут.
    2. Утилизация очищенной воды в качестве общего отхода.
    3. Поместите пипетки и пластиковую трубку в ведро. Заполните ведро водой и влить содержимое одного нейтрализуя агента пакетик.
    4. Вымойте их, по крайней мере 30 минут, чтобы стерилизовать их и промыть их с обильной чистой водой, чтобы удалить все оставшиеся нейтрализующего агента.

3. Добыча нуклеиновой кислоты

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки и всегда носите защитные очки во время процедуры извлечения нуклеиновой кислоты.

  1. Операция магнитных пипетков
    1. Ознакомьтесь с работой магнитного пипетки перед выполнением экстракции.
  2. Добыча нуклеиновой кислоты
    1. Упорядочить трубки, содержащие реагенты, необходимые для извлечения в стойке, слева направо: связывание буфера, стиральные буферы, и elution буфера. Установите соответствующее количество трубок в зависимости от количества анализируемых образцов или репликатов.
    2. Передача 1 мл образца концентрата в трубку, содержащую связывающий буфер, с помощью одноразовой пипетки Pasteur. Перевернуть трубку 8x до 10x, чтобы гомогензизировать раствор.
    3. Инкубировать раствор при комнатной температуре в течение 10 минут при непрерывном смешивании, либо с помощью орбитальной энергии на солнечных батареях, либо вручную.
    4. Соберите магнитные частицы с помощью магнитного пипетки и чистого наконечника, который может быть повторно использован для трех стиральных буферов.
    5. Отпустите магнитные частицы в трубку, содержащую 500 злиц моющих буфера 1. Вымойте их, осторожно встряхивая раствор кончиком в течение 30 с и собирать их.
    6. Перенесите магнитные частицы в трубку, содержащую 600 злителю стирального буфера 2. Вымойте их, осторожно встряхивая раствор кончиком в течение 30 с и собирать их.
    7. Перенесите магнитные частицы в трубку, содержащую 200 зл и буфер для мытья 3. Вымойте их, осторожно встряхивая раствор кончиком в течение 30 с и собирать их.
    8. Отпустите магнитные частицы в трубку, содержащую буфер elution, и отбросьте кончик.
    9. Инкубировать раствор при комнатной температуре в течение 5 минут при непрерывном смешивании, используя орбитальную энергию на солнечных батареях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешивание магнитных частиц в буфере elution является важным шагом. При отсутствии орбитальной, непрерывно смешивать вручную во время инкубации времени.
    10. Замените наконечник на магнитной пипетке на новый и соберите магнитные частицы из буфера elution. Убедитесь в том, чтобы полностью удалить магнитные частицы из буфера elution, поскольку они могут вмешиваться в молекулярные методы обнаружения.
    11. Отбросьте кончик с прикрепленными к нему частицами. Продолжить анализ ПЦР, отправить буфер elution в референтную лабораторию, или хранить буфер elution в при 4 кВ для дальнейшего анализа.

4. Вирусное обнаружение с аккумуляторной 8-трубкой в режиме реального времени термоциклер

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки и всегда носите защитные очки во время процедуры обнаружения нуклеиновой кислоты. Замените перчатки на новые при выполнении нового эксперимента ПЦР, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

  1. HAdV количественный ПЦР
    1. Добавьте 14 qL безнужной воды в трубки 2, 4 и 5.
    2. Добавьте 4 qL смеси ПЦР в трубки 1-5.
    3. Добавьте 14 qL извлечения нуклеиновой кислоты из образца А в трубку 1 и 14 Л из образца В в трубку 3.
    4. Добавьте 2 злицы извлеченных нуклеиевых кислот из образца А в трубку 2 и 2 Зл из образца В в трубку 4. Закройте пятитрубную полосу.
    5. Добавьте 14 qL безнужной воды в трубки 6, 7 и 8.
    6. Добавьте 4 qL этой смеси в трубки 6, 7 и 8, и закройте их.
    7. Положите обе полосы в термоциклер и выберите соответствующий пробег(Таблица 3).
    8. Откажитесь от водяной трубки и держите извлеченную нуклеиновую кислоту в морозильной камере, если это возможно, или, если нет, то в свежем месте, защищенном от света в случае, если необходимо провести второй тест.
    9. Очистите микропипетты, стойку, рабочий материал и весь материал должным образом с нуклеиновой кислотой чистых, и отказаться от полиэтиленового пакета, содержащего использованный кончик, перчатки и трубки.
      ВНИМАНИЕ: Удаление нуклеиновой кислоты является очень легковоспламеняющейся жидкостью и паром. Не дышите в тумане спрей и избежать любого контакта жидкости с глазами или кожей. В противном случае, сразу промыть обильной водой и обратиться к врачу.
    10. Соберите результаты и проанализируйте полученные данные.
  2. MS2 количественный ПЦР
    1. Добавьте 14 qL безнужной воды в трубки 2, 4 и 5.
    2. Добавьте 4 зЛ смеси ПЦР и 0,5 л фермента обратной транскриптазы в трубки 1-5.
    3. Добавьте 14 qL извлечения нуклеиновой кислоты из образца А в трубку 1 и 14 Л из образца В в трубку 3.
    4. Добавьте 1 зл и l извлеченных нуклеиевых кислот из образца А в трубку 2 и 1 Зл из образца В в трубку 4. Закройте пятитрубную полосу.
    5. Добавьте 15,5 кл.л воды без нуклеаза в трубки 5, 6, 7 и 8, и закройте их.
    6. Добавьте 4 зЛ смеси ПЦР и 0,5 л фермента обратной транскриптазы в трубки 6, 7 и 8.
    7. Положите обе полосы в термоциклер и выберите соответствующий пробег(Таблица 3).
    8. Продолжить, как описано в шагах 4.1.8 до 4.1.10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка метода

Эта процедура была разработана в Лаборатории вирусов загрязняющих веществ воды и продуктов питания в сотрудничестве с GenIUL и Oxfam Интерман. Она состоит из трех различных шагов. Первый, концентрация вирусных частиц, является адаптацией метода обезжиренного молока флоккуляции ранее описанных12,17,18. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод VirWaTest позволяет концентрацию вирусов и извлечения нуклеиновой кислоты из проб воды в точке использования неопытными пользователями. Это доступный, быстрый и простой протокол. Концентрация основана на принципе органической флоккуляции с использованием обезжиренного молока, с помощью которого низкий рН и высокие условия проводимости делают обезжиренные молочные белки, агрегатированные в флоксы, к которым адсорбирует сяд. Когда осадки флокса, легко собрать их, что позволяет сконцентрировать 10 л воды, в то время к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VirWaTest — исследовательский проект, финансируемый программой HIF (Гуманитарные инновационные фонды) КОМПАНИИ ELHRA (Повышение уровня обучения и исследований в области гуманитарной помощи). Авторы признают, WASH команды, которые любезно сотрудничали в этом исследовании. Анализ образцов в Эквадоре финансировался Оксфам Эквадор и Direccion де Investigaciones де ла Universidad де-лас-Америка (AMB. BRT.17.01). С. Бофилл-Мас является стипендиатом Серра-Хантер в Университете Барселоны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)Solis BioDyne08-14-00001включает в себя 5x HOT FIREПольский зонд qPCR Mix Plus (qPCR mix), 50 реакций
8-микропробирочных стрип с крышкамиdD Biolab840637низкопрофильные, тонкостенные, адаптированные для количественных и качественных ПЦР
батарей и адаптеры питания для магнитной мешалкиGenIUL900011674включает в себя автомобильное питание 12 В адаптер
Опора для ведраGenIUL900011648Алюминиевый опорный
ковш, 10 лCater4You10LTRПолипропилен, защищенный от несанкционированного доступа, пробирка
для центрифуги прозрачного цвета, 50 млLabBoxCTSP-E50-050полипропилен, стерильный, градуированный, с юбкой
лимонная кислота 1-гидрат, 500 гPanReac AppliChem1410181211чистый, фармацевтический сорт, 1 килограмм
Прозрачная ПЭТ-бутылкаLabBoxFPET-500-088Прозрачный цвет, ПЭТ, крышка не входит в комплект
Difco Обезжиренное молоко, 500 гBecton Dickinson232100Дегидратированная
ДНК/РНК Shield, 250 млZymo ResearchR1100-250Среда для сохранения ДНК/РНК, 250 мл
Контроллер пипеток Easy9LabBoxEAS9-001-0010,3 μ m фильтр, пипетки от 0,1 до 100 мл, автоклавируемый силиконовый держатель для пипеток
Eppendorf Tube, 0,5 млEppendorf0030121023полипропилен, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 2 млEppendorf0030120094полипропилена, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 млdD Biolab999542полипропилена, стерильный, градуированный
этанол 96% V/V, 1 лPanreac AppliChem361085-1611Для УФ, IR  и ВЭЖХ
лабораторных пинцетовLabBoxFORS-007-002Тонкий, изогнутый конец, L= 120 мм
магнитная мешалкаGenIUL900017000батарейный
маркерdD Biolab929203черный, сверхтонкий наконечник, водостойкий, быстросохнущий, для пластиковой и стеклянной посуды
Micro Rota-Rack для микропробирокdD Biolab377824 модуля, Д x Ш x В = 208 x 100 x 100 мм
Mini8 Циклер для ПЦР в реальном времениCoyote Biosciences, КитайMini-8Портативный, работает с источниками питания 12 В или внешними батареями, два канала, емкость для 8 пробирок
NucliSens Lysis BufferBiomerieux200292реагенты до 48 выделений, хранение при температуре окружающей среды
Серологическая пипетка с открытым наконечником, 10 млDeltalab900136Nстерильная, индивидуально упакованная (бумага/пластик)
Полиэтиленовая винтовая крышка PP28LabBoxTP28-004-020для ПЭТ-бутылок Полоска
для индикатора pHLabBoxWSPH-001-001диапазон pH от 2,8 до pH 4,4, 50 полосок в упаковке
Пластиковая пробиркаQuimikals300913включает крышку
полиэтиленовая пипетка ПастераLabBoxPIPP-003-500градуированная, общий объем 7 мл, Нестерильная
полипропиленовая винтовая колба с завинчивающейся крышкой, 150 млDeltalab409726Завинчивающаяся крышка, стерильная, градуированная до 100 мл
Полипропиленовая винтовая колба с завинчивающейся крышкой, 60 млDeltalab409526GВинтовая крышка, стерильная, градуированная до 50 мл
Порошковое порошковое моющее средство--Обычное порошковое мыло для стирки одежды
Кабели питания для магнитной мешалкиGenIUL900011692Соединение между батарейками и магнитными мешалками
QuickPick Магнитный инструментBioNobile24001Ручной инструмент для магнитных частиц
QuickPick Tips in BoxBioNobile24296РНаза-Free, автоклавный, 96 единиц
QuickPick XL gDNA Магнитные частицыBioNobileSN511003,2 мл
морской солиSigma-AldrichS9883-500GИскусственная солевая смесь, очень похожая на состав растворенных солей океанской воды
Силиконовая трубкаLabBoxSILT-006-005Рулон 5 метров, Inner  ø x Outer  ø= 6 x 10 мм
Гранулы гидроксида натрия, 98,5 - 100,5%VWR Химикаты28244295пеллеты, 1 кг
Солнечная роторная платформаSOL-EXPERT Group70020Акриловая пластина, 10 об/мин, поддерживает до 300 грамм
SOLIScript 1-ступенчатый набор зондовSolis BioDyne08-57-00250включает в себя 5x одноэтапную смесь зондов Solis Biodyne (смесь для количественной ПЦР) и 40x одноступенчатую смесь SOLIScript (фермент обратной транскриптазы), 250 реакций
SPEEDTOOLS набор для экстракции РНК-вирусовBioTools21.141-4197Включает в себя буфер BAW от BioTools (буфер для стирки 1), буфер BAV3 (буфер для стирки 2 и 3) и буфер BRE (буфер для элюирования).
SpinBar Восьмиэдральный магнит для перемешиванияdD Biolab045926шарнирным кольцом, L x  ø = 38 x 8 мм, синяя
серологическая пипетка, 10 млDeltalabPN10E1стерильная, в индивидуальной упаковке (бумага/пластик)
Серологическая пипетка на скотче, 50 млDeltalab900043стерильная, в индивидуальной упаковке (бумага/пластик)
Termi-DNA-tor - средство для удалениянуклеиновых кислотBioTools22001-4291Средство для удаления нуклеиновых кислот, бактерий, грибков и микоплазм из материалов и поверхностей, 450 мл
реагента для молекулярной биологии воды, 1 лSigma-AldrichW4502-1Lбез нуклеазы и протеазы, 0,1 мкм; m Сумка
Whirl-Pak с фильтром, 540 млDeltalab200361Стабильное дно
Простая сумка на молнииLabBoxBZIP-080-100Полиэтилен, Д x Ш= 120 x 80 мм

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
  2. Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
  3. World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
  4. World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
  5. Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
  6. Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
  7. Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
  8. Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
  9. Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
  10. Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
  11. Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
  12. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  13. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
  14. International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
  15. Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
  16. Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
  17. Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
  18. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

VirWaTestMS2

Похожие статьи