Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Химическая инактивация E3 Ubiquitin Ligase Cereblon по помалидомидной основе Homo-PROTACs

13.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59472

⸱

15 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Эта работа описывает синтез и характеристику помалидомида основе, бифункциональный гомо-PROTAC как новый подход, чтобы вызвать убиквитинирование и деградацию E3 убиквитин лигазе цереблон (CRBN), цель аналогов талидомида.

Аннотация

Иммуномодулирующие препараты (IMiDs) талидомид и его аналоги, леналидомид и помалидомид, все одобренные FDA препараты для лечения множественной миеломы, вызывают униквитивание и деградацию лимфоидных транскрипционных факторов Ikaros (IK-F1) и Aiolos (IK-F3) через цереблон (CRBN) E3 убиквитин лигаза для протеасомальной деградации. IMIDs недавно были использованы для генерации бифункционального протеолиза ориентации химер (PROTACs) для целевой других белков для убликвитина и протеасомальной деградации CRBN E3 лигазы. Мы разработали и синтезировали помалидомидна основе гомобифункциональных PROTACs и проанализировали их способность вызывать самостоятельной повсеместности и деградации CRBN. Здесь, CRBN служит как, E3 убиквитин лигаза и цель в то же время. Соединение гомо-ПРОТАК 8 ухудшает CRBN с высокой потенцией с минимальным оставшимся воздействием на Ik-F1 и IK-F3. Инактивация CRBN соединением 8 не оказала влияния на жизнеспособность клеток и пролиферацию различных линий клеток миеломы. Это гомо-PROTAC отменяет эффекты ИМИД в нескольких клетках миеломы. Таким образом, наши гомодимерные соединения на основе помалидомида могут помочь определить эндогенные субстраты и физиологические функции CRBN и исследовать молекулярный механизм ИМИД.

Введение

Иммуномодулирующие препараты (IMiDs) талидомид и его аналоги, леналидомид и помалидомид, все одобренные для лечения множественной миеломы, связываются с E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), субстратным адаптером для cullin4A-RING E3 ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. Связывание ИМиД повышает сродство CRL4CRBN к лимфоидным транскрипционным факторам Ikaros (IK-F1) и Айолосу (Ik-F3), что приводит к их увсеквитизации и деградации(рисунок 1)4,5, 6 , 7 (г. , 8. В виду того что IK-F1 и IK-F3 необходимы для множественных клеток миеломы, их инактивация приводит к ингибированию роста. SALL4 был недавно найден в качестве дополнительного IMiD-индуцированного нео-субстрата CRBN, который, вероятно, несет ответственность за тератогенность и так называемую катастрофу Контерган в 1950-х годов, вызванных талидомид9,10. В отличие от этого, казеин киназы 1 "(CK1" является леналидомид-специфический субстрат CRBN, который вовлечен в терапевтический эффект в миелодиспластический синдром с хромосомой 5q делети11.

Способность малых молекул ориентироваться на конкретный белок для деградации является захватывающим следствием для современного развития лекарств. В то время как механизм талидомида и его аналогов был обнаружен после их первого использования в организме человека, так называемый Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) были разработаны специально для целевой белок, представляющий интерес (POI) (Рисунок 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs являются гетеробифункциональные молекулы, которые состоят из конкретного лиганд для POI подключен через ссылку на лиганд E3 убиквитин лигаза, как CRBN или фон-Гиппель-Линдау (VHL)18,19,20, 21,22. PROTACs индуцировать формирование переходного тернари комплекса, направляя POI к E3 убиквитин лигаза, в результате его повсеместности и протеасомальной деградации. Основные преимущества PROTACs по сравнению с обычными ингибиторами заключается в том, что связывание с POI является достаточным, а не его ингибирование и, следовательно, PROTACs потенциально может целевой гораздо более широкий спектр белков, включая те, которые считались неприсменяемыми, как транскрипции факторы15. Кроме того, химерные молекулы действуют каталитически и поэтому обладают высокой потенцией. После переноса убиквитина в POI, тернарийкомплекс отделяется и доступен для формирования новых комплексов. Таким образом, очень низких концентраций PROTAC достаточно для деградации целевого белка23.

Здесь мы описываем синтез pomalidomide-pomalidomide конъюгированный гомо-PROTAC (соединение 8), который набирает CRBN для деградации себя24. E3 ubiquitin ligase CRBN служит как вербовщики и цели в то же время (Рисунок 3). Для проверки наших данных мы также синтезировали отрицательный связывающий контроль (соединение 9). Наши данные подтверждают, что недавно синтезированный homo-PROTAC специфичен для деградации CRBN и оказывает лишь минимальное воздействие на другие белки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка молекул PROTAC

ПРЕДУправление: Пожалуйста, проконсультируйтесь со всеми соответствующими листами данных о безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Некоторые из химических веществ, используемых в этих синтезах, являются токсичными и канцерогенными. Пожалуйста, используйте все соответствующие методы безопасности и средства индивидуальной защиты.

  1. Препарат терт-бутил N-(2,6-диоксо-3-пиперидиил)карбамат (соединение 1)
    1. Добавьте 1,1'-карбонимидидазол (1,95 г, 12 ммоль) и каталитическое количество 4-(диметиламино)пиридин (5 мг) в смесь Бок-Глн-ОХ (2,46 г, 10 ммоль) в THF (50 мл) в 100 мл нижней флакны с песочкой и сжимать. Тепло при рефлюксе в течение 10 ч при помешивая, пока не образуется четкий раствор.
    2. Снимите растворитель под пониженным давлением с помощью роторного испарителя, добавьте EtOAc (200 мл) и перенесите его в сепараторную воронку. Вымойте органический слой с H2O (50 мл) и рассол (50 мл) и высушите его над Na2SO4.
    3. Фильтр раствора через короткую площадку кремнезема гель (5 см в диаметре и 5 см высотой) и eluate с дальнейшим объемом (200 мл) EtOAc.
    4. Испарите растворитель и высушите полученный бесцветный твердый в вакуо.
  2. Приготовление терт-бутил N-(1-метил-2,6-диоксо-3-пиперидиил) карбамат (соединение 2)
    1. Смешайте соединение 1 (2,28 г, 10 ммоль) с карбонатом из флята из фрезерова (2,76 г, 20 ммоль) и DMF (25 мл) в круглой нижней колбе 100 мл. Добавьте йодометан (1,42 г, 0,62 мл, 10 ммоль) с помощью шприца и оборудуйте колбу проколотой резиновой перегородкой. Поместите реакционный сосуд в ультразвуковую ванну на 2 ч.
    2. Разбавить реакционную смесь EtOAc (100 мл) и перенести ее в сепараторную воронку. Вымойте органический слой с 1 N NaOH (2x 25 мл), H2O (25 мл), и рассол (25 мл), и высушить его над Na2SO4.
    3. Фильтр и испарять растворитель. Очистите продукт по колонке хроматографии над кремнеземом гель (6 см диаметр омицы и 20 см высотой) с помощью нефтяного эфира / EtOAc (2:1).
  3. Препарат 2-(2,6-диоксопипитридин-3-ил)-4-фтороизоиндолин-1,3-дион (соединение 3)
    1. Смешайте 3-фтортофталинический ангидрид (1,25 г, 7,5 ммоль), глутаримид 1 (1,14 г, 5 ммоль) и раствор ацетата натрия (0,50 г, 6,0 ммоль) в ледниковой уксусной кислоте (20 мл) в 50 мл круглой нижней колбы с перемешиванием и оборудованным рефлексом. Нагрейте смесь при температуре 120 градусов по Цельсию в течение 6 ч.
    2. После охлаждения залить фиолетовую смесь на H2O (100 мл) и перемешать в течение 10 мин. Соберите образовавшиеся твердые фильтрации, промойте H2O (3 х 5 мл) и нефтяной эфир (3 - 5 мл) и высушите в вакуо.
  4. Препарат 4-фтор-2-(1-метил-2,6-диоксопипипидин-3-ил) изоиндолин-1,3-дион (соединение 4)
    1. Смешайте 3-фтортофтальный ангидрид (1,25 г, 7,5 ммоль), глутаримид 2 (1,21 г, 5 ммоль) и раствор ацетата натрия (0,50 г, 6,0 ммоль) в ледниковой уксусной кислоте (20 мл) в 100 мл круглого нижнего колбы с перемешиванием и оснащенным рекоменсом. Нагрейте смесь при температуре 120 градусов по Цельсию в течение 6 ч.
    2. После охлаждения залить фиолетовую смесь на H2O (100 мл) и перемешать в течение 10 мин. Соберите образовавшиеся твердые фильтрации, промойте H2O (3 х 5 мл) и нефтяной эфир (3 - 5 мл) и высушите в вакуо.
  5. Приготовление терт-бутил N--2-2--2--2-(2,6-диоксо-3-пиперидиил)-1,3-диоксо-изоиндолин-4-ил-амино-этикси-этил-карбамат (соединение 7)
    1. Заряжайте 50 мл круглой нижней колбы с тертом-бутил N- 2---2-(2-аминоэтокси)этил-карбамат (5, 0,41 г, 1,65 ммоль), соединение 3 (0,41 г, 1,50 ммоль), сухой DMF (10 мл) и DIPEA (0,39 г, 0,51 мл, 3,0 ммоль). Оборудуйте с перемешивания бар и рефлюкс конденсатор. Тепло под атмосферой аргона при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 10 ч.
    2. После охлаждения до комнатной температуры, залить темно-зеленую смесь на H2O (100 мл) и извлечь с EtOAc (3x 50 мл) в сепараторной воронке. Вымойте комбинированные органические слои с H2O (50 мл) и рассолом (50 мл), высушите над Na2SO4,фильтруйте и концентрируйте в vacuo.
    3. Очистите сырой продукт по колонке хроматографии над кремнезема гель (3 см диаметром колонки и 60 см высотой) с помощью градиента нефтяного эфира / EtOAc (1:1 до 1:2).
  6. Приготовление омодимера (соединение 8)
    1. Объедините связующее звено 6 (0,22 г, 0,22 мл, 1,50 ммоль), DIPEA (1,05 мл, 6,00 ммоль) и раствор 3 (0,83 г, 3,00 ммоль) в сухом ДМСО (20 мл) в 50 мл нижнего флаконса с помощью бара и сжимателя. Тепло под атмосферой аргона при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 18 ч.
    2. После охлаждения до комнатной температуры, залить темно-зеленую смесь на H2O (100 мл) и извлечь с EtOAc (3x 50 мл) в сепараторной воронке. Вымойте комбинированные органические слои с H2O (50 мл) и рассолом (50 мл), высушите над Na2SO4,фильтруйте и концентрируйте в vacuo.
    3. Очистите сырой продукт по колонке хроматографии над кремнезема гель (3 см диаметр омицы и 50 см высотой) с помощью градиента нефтяного эфира / EtOAc (1:2) к EtOAc.
  7. Приготовление неогородимного (соединение 9)
    1. Растворите соединение 7 (0,83 г, 1,65 ммоль) в сухом CH2Cl2 (10 мл). Добавить трифтороацетической кислоты (10 мл) и перемешать желтую смесь при 40 градусах по Цельсию в течение 2 ч в закрытой 50 мл круглой нижней колбы.
    2. Удалите летучие вещества и coevaporate с CH2Cl2 (4x 5 мл). Высушите остатки в вакуо в течение 10 ч.
    3. Растворите материал в сухом DMF (20 мл). Добавьте соединение 4 (0,44 г, 1,50 ммоль) и DIPEA (0,78 г, 1,05 мл, 6,00 ммоль) и оборудуйте колбу рефлюксным конденсатором. Тепло под атмосферой аргона при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 10 ч.
    4. После охлаждения до комнатной температуры, залить темно-зеленую смесь на H2O (100 мл) и извлечь с EtOAc (3x 50 мл) в сепараторной воронке. Вымойте комбинированные органические слои насыщенными NaHCO3 (50 мл), H2O (50 мл), 10% KHSO4 (50 мл), H2O (50 мл) и рассолом (50 мл), сухим над Na2SO4,фильтром и концентратом в vacuo.
    5. Очистите сырой продукт по колонке хроматографии над кремнезема гель (3 см диаметр омицы и 50 см высотой) с помощью градиента нефтяного эфира / EtOAc (1:2) к EtOAc.
    6. Разъясняйте и проверяйте структуру молекулы(Рисунок 5A соединение 8, 5B соединение 9) на 1H NMR и 13C NMR спектра в DMSO-d6 на ядерном магнитном резонансе (NMR) Спектрометр. Убедитесь, что чистота обоих соединений выше 97% с помощью жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS), применяя диодное обнаружение массива (DAD) на уровне 220-500 нм.

2. Функциональная проверка молекул PROTAC

  1. Западный анализ поблужки деградации CRBN PROTACs
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффекты соединения8и соединения9 До 9на уровне белка CRBN были протестированы западным анализом поблучника. Кроме того, можно было бы также подтвердить влияние на уровни ИК-Ф1 и ИК-Ф3 (Рисунок 6).
    1. Подготовка образцов
      1. Растворите соединения 8 и 9,леналидомид (Лен), помалидомид (Пом), MG132 и MLN-4924 в DMSO при концентрации 10 мМ, аликот и хранить при -80 градусов по Цельсию до дальнейшего использования.
      2. Семена 1 х 106 MM1S клеток в 6-колодец пластины с 2,5 мл средств массовой информации и лечения клеток с 100 НМ или 1 ММ соединение 8 или 9 для 24 ч.
      3. Урожайные клетки после лечения и центрифуга при 700 х г,5 мин, 4 кв. C. Вымойте клеточные гранулы с холодной 1x PBS, чтобы удалить оставшиеся средства массовой информации, центрифуга на 700 х г, 5 мин, 4 КК, и отбросить супернатанта. Повторите этот шаг один раз.
      4. Лисы клетки в буфере лисиса (25 мм Tris HCl рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1 мМ EDTA, 5% глицерол, 1x Протеазия и Фивидис Ингибитор Коктейль) для 10 мин на льду, центрифуга на 320 x г. Урожай супернатант и определить концентрацию белка по анализу белка bicinchoninicкислоты (BCA анализ) в соответствии с протоколом производителя.
      5. Денатурные белки (15–30 мкг/образец) с 1x буфером загрузки СПД (5% 2-меркаптоэтанол) и кипятить 10 мин, 75 градусов по Цельсию.
    2. SDS-PAGE
      1. Исправить гель сэндвич с 10% отделяющий гель 4 мл 3x гель буфер (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) сульфат натрия додецил (SDS), рН 8,45), 4 мл акриламида 30%, 2,52 мл глицерола 50%, 1,395 мл H2O, 75 л 11% гульфата аммония (APS), и 9,75 л TEMED и 4% укладка геля Буфер геля 1,992 мл, 0,792 мл 30% акриламида, 3,168 мл Л Н2О, 36 л 11% APS и 6 л TEMED в блоке сборки электродов. Удалите гребни, промыть скважины катодным буфером (100 мм Tris/HCl, 100 мМ трицин, 0,1% (w/v) SDS), и загрузить образцы.
      2. Заполните буфер анода (100 мМ Tris/HCl, pH 8.9) в бак. Загрузите протеиновый образец со ступени 2.1.1.4 и запустите SDS-PAGE на 70 В, 20 мин, а затем 115 V, 150 мин при постоянном напряжении.
    3. Иммуноблоттинг и обнаружение CRBN, IK-F1 и IK-F3
      1. Активировать мембрану PVDF (0,45 мкм) в 100% метанола на 1 мин. Экипратная мембрана и отделяющий гель в 1x переносном буфере (192 мМ глицин, 25 мм Трис-база/HCl, 900 мл H2O), 20% метанол, 0,1% SDS, pH 3.
      2. Соберите блоттинг кассеты в соответствии с протоколом производителя. Передача геля при 180 мА за 90 мин.
      3. Вымойте мембрану 3x в 1x TBS-T (25 мм Tris/HCl, 150 мМ NaCl, рН 7.6, 0.1% Tween 20) для 5-10 мин каждый при комнатной температуре. Блок мембрана в 5% обезжиренного молока (NFDM), TBS-T на 1 ч при комнатной температуре. Вымойте мембрану 3x в 1X TBS-T в течение 5-10 минут каждый при комнатной температуре.
      4. Инкубировать мембрану с первичным антителом для CRBN (1:500 в 5% BSA, TBS-T) с нежной тряской при 4 C, на ночь.
      5. Вымойте мембрану 3x в 1X TBS-T в течение 5-10 минут каждый при комнатной температуре. Инкубировать мембрану с анти-мышь (1:10.000 в 5% NFDM, TBS-T) или анти-кролик (1:5.000 в 5% NFDM, TBS-T) вторичные антитела в сочетании с хреном перекисчиваны HRP (1 ч при комнатной температуре.)
      6. Вымойте мембрану 2x в 1X TBS-T в течение 5-10 минут каждый при комнатной температуре. Повторите этот шаг дважды с 1x TBS.
      7. Инкубировать мембрану на 2 мин с субстратом HRP раствором в соответствии с протоколами производителя и обнаружить хемилюминесценцию в устройстве обнаружения хемилюминесценции.
      8. Вымойте мембрану 1x в 1X TBS в течение 5-10 минут каждый при комнатной температуре. Для высвобождения антител, полоса мембраны в коммерчески доступных зачистки буфера в течение 15 мин. Мыть мембраны 3x в 1X TBS для 5-10 мин каждый при комнатной температуре.
      9. Переблокируйте мембрану в 5% обезжиренного молока, TBS-T на 1 ч при комнатной температуре. Вымойте мембрану 3x в 1x TBS-T в течение 5-10 мин каждый при комнатной температуре и повторно с IK-F1, IK-F3 или тубулин в соответствии с шагом 2.1.3.4.
  2. Конкурсные эксперименты с MG132, MLN4942 или помалидомидом
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить, является ли CRBN деградирует через убиквитин-протеасомы пути, мы провели конкурсные эксперименты с ингибитором протеасомы MG132 и недиляционных активации фермента (NAE) ингибитор MLN4942 (Рисунок 7).
    1. Семена 1 х 106 MM1S клеток на хорошо в 6-колодец пластины. Предварительное лечение клеток с 10 ММ MG132, 10 мкм MLN4942, или леналидомид (100x), и инкубировать 1 ч при 37 кс, 5% CO2.
    2. Добавить 100 нм соединение 8 для 3 ч при 37 КС, 5% CO2.
    3. Клетки урожая для западной поместья в соответствии с шагом 2.1.1.
  3. Анализ жизнеспособности клеток в нескольких линиях клеток миеломы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ используется для проверки воздействия на жизнеспособность клеток и, кроме того, антагонизировать влияние ИМИД на несколько клеток миеломы путем предварительной обработки клеток с соединением 8 (Рисунок 8, Рисунок 9A, B).
    1. Семена 5 х 104 MM1S клеток на хорошо в 96-хорошо пластины в биологических трипликации для жизнеспособности асссе. Для западного анализа помок, семена 1 х 106 MM1S клеток на хорошо в 6-хорошо пластины в биологических триплики.
    2. Лечить клетки с DMSO или 100 нм, 1 ММ, или 10 мкм соединение 8, соединение 9 или pomalidomide и инкубировать на 24 ч, 48 ч, или 96 ч при 37 КС, 5% CO2. Для спасательных экспериментов, лечить клетки с 100 нм соединение 8 на 3 ч, до или после добавления 1 ММ помалидомида и инкубировать на 96 ч.
    3. Измерьте люминесценцию пластины 96-наилучшим образом с люминесцентным анализом жизнеспособности клеток, согласно протоколу производителя на считывателе плиты или клетках урожая от 6-хорошей плиты для западного анализа подись.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы описали дизайн, синтез и биологическую оценку гомодимерного помалидомида на основе PROTAC для деградации CRBN. Наш PROTAC взаимодействует одновременно с двумя молекулами CRBN и формирует тернариальные комплексы, которые индуцируют самоубиквитинацию и протеасомальную деградацию CRBN с минимальным оставшимся воздействием на помалидомидные неосубстраты IK-F1 или IK-F3.

Из серии ранее опубликованных помалидомида основе PROT...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Конструкция таких гомо-ПРОТАК, описанных здесь для CRBN, опирается на специфическую близость помалидомда к CRBN, которая успешно используется в многочисленных гетеробифункциональных ПРОТАКи и привела к развитию PROTAC 8 как высоко селективный деградер CRBN. Специфика нашей молекулы уже подтверждена протеомическими анализами24. Для генетически опосредованного нокаута, исключение и проверка побочных эффектов является сложной задачей и отнимает много времени. Кроме того, химически ин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о потенциальном финансовом конфликте интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (Программа Эмми-Ноэтер Kr-3886/2-1 и SFB-1074 в J.K.; FOR2372 до M.G.)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,1'-карбонилдиимидазолхимикаты TCIC0119
2,2′-(этилендиокси)-бис(этиламин)Sigma-Aldrich385506соединение 6
2-меркаптоэтанолSigma-AldrichM6250
3-фторфталевый ангидрид, 98 %Альфа Aesar A12275
4-диметиламинопиридин, 99 %Acros148270250Токсичный
акриламидстаммл; sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)Carl Roth3029.1
Aiolos (D1C1E) mABCell Signaling15103S
Anti-CRBN антитело производится у кроликаSigmaHPA045910
Антитело против кролика IgG HRP-связанное антителоSigma7074S
Персульфат аммонияRoth9592.2
Boc-Gln-OHTCI химикатыB1649
Сывороточный альбумин крупного рогатого скотаSigma-AldrichA7906-100G
CellTiter-Glo Люминесцентный анализ жизнеспособности клетокPromegaG7571
ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
ДМФА, безводный, 99,8 %Acros348435000экстра сухой через молекулярное сито
ДМСО, безводный, 99,7 %Acros348445000Экстра сухое по молекулярному ситу
глицинSigma-Aldrich15523-1L-R
козий антимышиный (конъюгированный HRP)Santa Cruz biotechnologysc-2005
Halt Protease & Одноразовый коктейль с ингибитором фосфатазы (100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y)Mab Cell Signaling14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µ m)MerckIPVH000010
Йодометан, 99 %Sigma-AldrichI8507Высокотоксичный
метанолSigma-Aldrich32213-2,5L
Mg132SelleckchemS2619
Mini Trans-Blot электрофоретический передаточный элементBio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra Вертикальный электрофорезный элементBio-Rad1658004
MLN4942biomol (каймановый)Cay15217-1
Моноклональное антитело к альфа-&альфа;-тубулину, вырабатываемое мышами (B512)SigmaT5168
N-этилдиизопропиламин, 99 %Альфа Aesar Aesar A11801
Обезжиренное сухое молокоPanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 MicroWell White Полистирольная пластинаThermo Scientific136101
NuPAGE LDS Буфер для образцов (4X)Thermo ScientificNP0008
Набор для анализа белка Pierce BCAThermo Scientific23225
PomalidomideSelleckchemS1567
RestoreTM Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46430
Sodium додецилсульфатКарл Рот183,1
Хлорид натрияСигма-ОлдричА9539-500г
ТЕМЕДКарл Рот2367,3
трет-Бутил N-[2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил]карбаматСигма-Олдрич89761Соединение 5
ТрицинКарл Рот6977,4
Основание ТризмыСигма-ОлдричT1503-1кг
Твин-20Сигма-ОлдричP7949-500мл
WesternBright ECL спрейAdvanstaK-12049-D50

Ссылки

  1. Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
  2. Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
  3. Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
  4. Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
  5. Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742(2014).
  6. Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
  7. Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
  8. Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
  9. Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
  10. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  11. Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
  12. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  13. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  14. Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247(2018).
  16. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  17. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
  18. Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  19. Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830(2017).
  20. Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  21. Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  22. Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
  23. Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
  24. Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
  25. Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
  26. Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  27. Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  28. Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
  29. Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
  30. Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
  31. Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
  32. Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
  33. Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
  34. Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
  35. Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Деградация цереблонаPROTAC на основе помалидомидагомо-PROTAC соединение 8инактивация CRBNвестерн-блот-анализанализ жизнеспособности клетокклетки множественной миеломыдеградация IKZF1 и IKZF3ингибирование протеасомыподтверждение структуры методом ЯМР
Химическая инактивация E3 Ubiquitin Ligase Cereblon по помалидомидной основе Homo-PROTACs
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.