Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Трехмерная паттерна инженерных биопленок с сделай-сам Биопринтер

9.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59477

⸱

16 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bionanoscience & Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 2Department of Biology, University of Rochester

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описывается метод превращения недорогого коммерческого 3D-принтера в бактериальный 3D-принтер, который может облегчить печать узорчатых биопленок. Описаны все необходимые аспекты подготовки биопроинтера и био-чернил, а также методы верификации для оценки формирования биопленок.

Аннотация

Биопленки представляют собой агрегаты бактерий, встроенных в самопроизводно-узорный внеклеточный матрикс. Бактерии внутри биопленки развивают повышенную устойчивость к антибиотикам, которая создает потенциальную опасность для здоровья, но также может быть полезной для экологических применений, таких как очистка питьевой воды. Дальнейшее развитие антибактериальных терапевтических и биопленки-вдохновил приложений потребует разработки воспроизводимых, инженерный методы для создания биопленки. Недавно был разработан новый метод приготовления биопленки с использованием модифицированного трёхмерного (3D) принтера с бактериальной краской. В этой статье описываются шаги, необходимые для создания этой эффективной, недорогой 3D биофинтер, который предлагает несколько применений в бактериально-индуцированной обработки материалов. Протокол начинается с адаптированного коммерческого 3D принтера, в котором экструдер был заменен на био-чернила распылитель подключен к системе шприца насос позволяет управляемый, непрерывный поток био-чернил. Для разработки био-чернил подходит для биопленки печати, инженерии кишечной палочки бактерии были приостановлены в растворе альгината, так что они затвердевают в контакте с поверхностью, содержащей кальций. Включение индуктор химического вещества в печать субстрата диски выражения биопленки белков в печатных био-чернил. Этот метод позволяет 3D печать различных пространственных паттернов, состоящих из дискретных слоев печатных биопленок. Такие территориально контролируемые биопленки могут служить в качестве модельных систем и могут находить применение в различных областях, которые оказывают широкомасштабное воздействие на общество, включая профилактику устойчивости к антибиотикам или очистку питьевой воды, в частности.

Введение

В настоящее время растет потребность в разработке экологически чистых, устойчивых решений для производства материалов с территориально-узором, в связи с расширением числа рынков для таких материалов1. Эта статья представляет простой, экономичный метод для производства таких материалов и, следовательно, предлагает широкий спектр будущих приложений. Представленный здесь метод позволяет трехмерную (3D) печать пространно-узорных конструкций с использованием био-чернил, содержащей живые бактерии. Бактерии остаются жизнеспособными в печатных структурах в течение более одной недели, что позволяет бактериям выполнять естественные или инженерные метаболические действия. Печатные бактерии могут тем самым производить и депозит желаемых компонентов в рамках печатной структуры, например, создание функциональных кросс-связанной биопленки2.

Традиционные методы производства передовых материалов связаны с высокими энергетическими расходами (например, высокими температурами и/или давлением) и могут производить большое количество химических отходов, часто токсичных веществ, которые требуют широкого использования с высокой стоимостью3 ,4. В отличие от этого, несколько бактериальных видов способны производить материалы, которые могут быть легко применимы в различных отраслях промышленности. К ним относятся полимеры, такие как полигидрокяльканоаты (ГФА)5 или поли (гликолиде-Co-lactide) (плгла)6, Бактериальная целлюлоза7, бактериальные бетонные материалы8, Биомиметические композиты9, Амилоид основе клеи10, или био основе электрических переключателей11, среди других. Кроме того, бактериальное производство ценных материалов, как правило, происходит при близкой температуре и давлении и в окружающих средах, без необходимости или производства токсичных соединений. В то время как производство материалов с бактериями было продемонстрировано в литературе и некоторые промышленные приложения уже появились12,13, надежный метод для пространственного паттерна таких материалов остается проблемой.

Эта статья демонстрирует прямой метод превращения недорогого коммерческого 3D-принтера в 3D-бактериальный принтер. Протокол показывает, как подготовить био-чернила, содержащие и поддержания живых бактерий, а также как подготовить субстраты, на которых 3D печать может быть выполнена. Этот метод подходит для использования с различными природными и инженерии бактериальных штаммов, способных производить материалы. Эти бактерии могут быть территориально распределены в 3D печатной структуры и по-прежнему продолжать свою метаболическую активность, что приведет к пространственному распределению желаемых материалов, производимых бактериями.

Этот метод печати позволяет аддитивное производство биопленок, агрегатов бактерий, окруженных самодпроизводной внеклеточной матрицей. Биопленки являются неоднородными 3D-сетями, в которых белки, полимеры, бактериальные клетки, кислород и питательные вещества являются территориально структурированными14. В виде биопленки бактерии проявляют повышенную устойчивость к антибиотикам и структурную устойчивость, что затрудняет их ликвидацию на поверхностях, включая медицинские катетеры и имплантаты. Ключом к свойствам биопленки, а также крупнейший вызов биопленки исследования, кажется, гетерогенность биопленок15,16,17. Особый интерес представляет производство биопленок, контролируемых в рамках территориально-пространственной модели, поскольку это позволит либо воспроизводить, либо настраивать пространственные структуры компонентов биопленки, способствуя пониманию стабильного осаждения биопленок практически на любой поверхности в Природа.

Эта статья представляет собой метод для производства биопленок с использованием 3D-печатных гидрогелей, содержащих модифицированные бактерии E. coli , которые производят протеины биопленки в присутствии индуктор, а также методы верификации формирования биопленки2 . Основные внеклеточные матрицы компоненты этих биопленок являются curli амилоидных волокон18 , которые содержат самособранном CGA белков. При инженерии E. coli бактерии индуцируется, чтобы выразить белки КПГА, они образуют стабильную модель биопленки, которая защищает клетки от смывается поверхности печати. Такая трехмерная биопленка может быть территориально контролируемой и может послужить полезным исследовательским инструментом для исследования структуры многомасштабной биопленки-механики функций или материаломики19. Эти индивидуальные биопленки помогут пониманию принципов формирования биопленки и их механических свойств, что позволит дополнительно исследовать механизмы устойчивости к антибиотикам среди других применений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Преобразование коммерческого 3D-принтера в 3D-биоинтер

  1. Удалите экструдер и нагреватель коммерческого 3D-принтера (таблица материалов) из рамы принтера и отключите проводки, контролирующие эти элементы, от основной печатной платы (рис. 1a). Поскольку датчик, контролирующая оперативную температуру принтера, должен быть функциональным для связи с программным обеспечением принтера, удалите из печатного программного обеспечения алгоритм, который задерживает печать до достижения операционной температуры.
  2. Подключите наконечник пипетки (200 мкл наконечник) через кремниевых труб (внутренний диаметр 1 мм) до 5 мл шприца загружен в шприц насоса. Держатель пипетки наконечник на 3D-принтер экструдер голову в качестве замены для оригинального экструдера (рис. 1B).
  3. Если более чем один тип био-чернил будет использоваться, смонтировать дополнительные трубы системы (ы) и пипетки отзыв (ы) к принтеру.

2. субстрат для подготовки 3D-печати

  1. Добавить 4 мл 5 м КАГЛ2 раствор до 400 мл 1% w/v агар растворенного в Лурии-Бертани БУЛЬОН (lb), дополненный соответствующими антибиотиками и индукторы (здесь 34 мкг/мл хлорамфеникола и 0,5% rhamnose).
  2. Обойтись 20 мл раствора LB-агар в каждую 150 мм х 15 мм чашку Петри. Высушите 30 мин при комнатной температуре с крышкой наполовину открытой.
    Примечание: протокол может быть приостановлен здесь, сохраняя эти печатные подложки при температуре 4 ° c на протяжении нескольких дней.

3. Био-чернила подготовки

  1. Подготовьте раствор альгината натрия (3% w/v) и нагрейте до точки кипения три раза, чтобы стерилизовать раствор. Хранить при температуре 4 ° c до использования.
  2. Выращиваем e. COLI MG1655 Pro Δксга ompR234 (e. coli δксга) бактерии, несущие плазмид pSB1C3-Green ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ белок (GFP) (экспрессия GFP)2 или PSB1C3-GFP-КПГА выражение) на ночь в 37 ° c с встряхивания на 250 оборотов в минуту в 50 мл LB среды, содержащей 34 мкг/мл хлорамфеникола и 0,5% rhamnose.
  3. Центрифуга клеточной культуры в течение 5 минут на 3 220 х г , чтобы гранулы бактерий. Удалите супернатант.
  4. Re-приостановить гранулы бактерии в 10 мл LB среды и добавить 10 мл альгината натрия (3% w/v).

4. процесс 3D печати

  1. Установите и откройте программное обеспечение 3D-печати (таблица материалов) на компьютере. Подключите 3D-принтер к компьютеру. Переместите печатающая головка к его домашнему положению, щелкнув домашнюю кнопку для оси X, Y и Z.
  2. Для каждой печати поместите подготовленную печать подложки на определенном месте на печатной кровати.
  3. Калибровка высоты печатающей головки в оси Z.
    1. Поднять печатающей головки на высоту 22 мм под ручное управление, так что он не будет сталкиваться с краем чашки Петри при перемещении в нужное положение. Расположить печатающая головка поверх пластины и переместить ее вниз до тех пор, пока кончик пипетки не свяжется с поверхностью печати. Назначить эту Z-ось позиции как Z1 (высота поверхности печати).
    2. Поднимите печатающая головка и переместите ее за пределы области пластины ручным управлением в X, Y и Z-топорами. Если рабочее расстояние между печатающей головкой и поверхностью пластины определено как Z2, введите Z1 + Z2 в программу печати в качестве Z-значения во время печати.
  4. Программируйте форму печатания самостоятельно разработанной точеческой координацией, определяемую по желаемой траектории.
    1. Если желаемая траектория представляет собой прямую линию, определите только точки старта и конца. Включение дополнительных точек на изогнутых линиях приведет к более гладким изгибу. Перемещение печатающей головки вручную в каждую точку последовательно, и записывать координаты этих точек в порядке. Ввод всех этих координат, а также печатающая головка скорость перемещения для каждого печатного сегмента в G-код редактора.
  5. Как до, так и после печати, поднимите печатающая головка на расстояние выше кромки пластины (20 мм) и двигайтесь прямо из области пластины. Сохраните эту программу как файл G-код и загрузите непосредственно для использования в последующих принтах, при повторном измерении высоты оси Z для каждого нового печатного подложки.
    Примечание: см. таблицу 1 для примера G-код для печати квадрата.
  6. Загрузите предварительно запрограммированный файл G-Code. Откройте редактор G-кода в программном обеспечении, и программа в командах для печати желаемой формы. На каждой командной строке позиция печатающей головки может быть изменена в оси X, Y и/или Z. Ввод значения Z во время всех этапов печати как Z1 + Z2 (высота поверхности печати + рабочее расстояние).
    Примечание: скорость движения также регулируется; 9 000 мм/мин является подходящим значением для типичных ставок печати.
  7. Загрузите жидкость био-чернил в шприц (ы), и смонтировать их в шприц насоса (ы) 3D биоинтер.
  8. Печать био-чернил на печать подложки, нажав на кнопку печати .
  9. Во время печати, управление печатающей головки движение полностью программным обеспечением. Вручную запустите шприц-насос, прежде чем печатающая головка соприкасается с поверхностью печати.
    Примечание: координация шприца насоса и принтера эмпирически определяется в зависимости от скорости экструзии, скорость, с которой печатающая головка перемещается в первую точку печати, и исходное положение печатающей головки. Если исходная позиция печатающей головки составляет 20 мм, с помощью печатающей головки 9 000 мм/мин и экструзионной скоростью 0,1 мл/ч, начинайте насос-шприц сразу после начала печати. Если экструзионные скорости меняются с 0,1 мл/ч до 0,3 мл/ч, то подождите 2 − 3 с, чтобы запустить шприц-насос после начала печати.
  10. Остановите шприц-насос, как только в последней точке печати прибудет печатающая головка. Остановка насоса шприца перед печатающей головкой поднимает в конце процесса печати, в противном случае избыток био-чернил упадет на печать подложки и уменьшить разрешение печати.
  11. Для построения 3D конструкций, контролировать все движения печатающей головки в G-код редактора. Введите печать в высоту первого слоя. Увеличьте значение Z-значения в G-коде на 0,2 миллиметров для второго слоя, чтобы увеличить высоту печати. После этого увеличьте Z-значение на 0,1 миллиметров при перемещении на более высокий слой. Не перемещаем пластинку во время процесса печати.
  12. Для измерения ширины и высоты печатного гидрогеля используйте стальной правитель, помещенный под или рядом с образцом.

5. выращивание и тестирование эффективности производства биопленки E. coli

  1. Инкубировать напечатанные образцы при комнатной температуре в течение 3 − 6 дней, чтобы позволить производство компонентов биопленки (волокна curli). Изображение пластин с помощью камеры или флуоресцентного сканера.
  2. Чтобы растворить альгинат матрицы, добавить 20 мл 0,5 M раствор цитрат натрия (рН = 7 скорректированы с NaOH) на печатные субстраты, и инкубировать для 2 ч с 30 об/мин встряхивания при комнатной температуре. Выбросьте жидкость и изображения пластин снова сравнить с изображениями пластин до цитрата лечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Первым шагом для успешной 3D-печати биопленок является преобразование коммерческого 3D-принтера в биоинтер. Это преобразование достигается путем удаления экструдера и нагревателя принтера, предназначенные для печати с полимерных чернил, и заменив их компонентами, подходящими для печати био-чернил, содержащих живые бактерии (рис. 1A). Экструдер заменяется наконечника пипетки (или советы, если несколько био-чернила будут использоваться в процессе печати) прилаг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, представленный здесь для 3D-печати инженерных биопленок, имеет два критических шага. Во-первых, является подготовка поверхности агаровой печати, которая является наиболее важным фактором для производства конкретного разрешения печати. Важно обеспечить, чтобы поверхность печати была плоской и чтобы Пипетка на печатающей головки была расположена на правильной высоте от поверхности. Если поверхность не плоская, рабочее расстояние изменится во время процесса печати. Если рабочее расстояние меньше 0,1 мм, раствор КА...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом АОАР (No. FA2386-18-1-4059), Нидерландская организация научных исследований (НВО/OCW) в рамках программы "границы нанонауки" и программы "передовые материалы NWO-НФК" (No 729.001.016). Авторы признают лабораторную помощь Рамона ван дер валка и Роланда Киффер.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3D-принтерCoLiDo3D-P Kit Программное
обеспечение для 3D-печатиCoLiDoPrint-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
АгарSigma-Aldrich05040
CaCl2 дигидратSigma-AldrichC7902
ЦентрифугаEppendorf5810 R
ХлорамфениколSigma-Aldrich3886.1
LB бульонный порошокSigma-AldrichL3022
Орбитальный шейкерVWR89032-092Модель 3500
Чашка ПетриVWR25384-326150 x 15 мм
РамносSigma-Aldrich83650
Силиконовая трубкаVWR DENE 3100103/25
Шприцевой насосProSense B.V. NE-300
Альгинат натрияSigma-AldrichW201502
Цитрат натрия одноосновнойSigma-Aldrich71498
Гидрооксид натрияVWR28244.295

Ссылки

  1. Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
  2. Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
  3. Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
  4. Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287(2017).
  5. Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
  6. Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
  7. Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860(2017).
  8. Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
  9. Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
  10. Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
  11. Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
  12. Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
  13. Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
  14. Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
  15. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
  16. Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
  17. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  18. Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
  19. Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
  20. Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
  21. Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
  22. Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
  23. Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
  24. Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
  25. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  26. Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3DEscherichia coliZG
Трехмерная паттерна инженерных биопленок с сделай-сам Биопринтер
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.