Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сочетая Неуменьшающие СДС-СТРАНИЧНЫЙ анализ и химические перекрестные ссылки для обнаружения Мультимерных комплексов, стабилизированных дисульфидными связями в клетках млекопитающих в культуре

9.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59483

⸱

2 мая 2019 г.

 , 
1Department of Molecular Biology, Rowan University, School of Osteopathic Medicine and Graduate School of Biomedical Sciences

В этой статье

Краткое содержание

Соединений дисульфида длиной были знаны, что стабилизировали структуру много протеинов. Простой метод анализа мультимерных комплексов, стабилизированных этими связями, заключается в неуменьшении анализа СДС-СТРАНИЧКА. Здесь, этот метод проиллюстрирован путем анализировать ядерную изоформу dUTPase от людской косточки остеосаркомы клетки линии U-2 OS.

Аннотация

Структуры многих белков стабилизируются с помощью ковалентных дисульфидных связей. В последние работы, эта связь была также классифицируется как пост-поступательного модификации. Таким образом, важно уметь изучать эту модификацию в живых клетках. Простой метод для анализа этих цистеин стабилизировались мультимерные комплексы через двухступенчатый метод не снижения СДС-СТРАНИЧНЫЙ анализ и формальдегид кросс-ссылок. Этот двухступенчатый метод выгоден в качестве первого шага к выявлению мультимерных комплексов, стабилизированных дисульфидными связями из-за его технической легкости и низкой стоимости эксплуатации. Здесь, человеческая кость остеосаркомы клеточной линии U-2 OS используется для иллюстрации этого метода, специально анализируя ядерную Изоформа dUTPase.

Введение

Соединений дисульфида длиной были знаны, что стабилизировали структуру много протеинов. В последние работы, эта связь также была классифицирована как обратимые после поступательного изменения, действуя как цистеин основе "редокс переключатель", позволяющий модуляции функции белка, местоположение и взаимодействие1,2, 3,4. Таким образом, важно иметь возможность изучить эту модификацию. Простой метод для анализа этих цистеин стабилизированных мультимерные комплексы через несокращения СДС-PAGE анализ5. Анализ СДД-страниц является методом, используемым во многих лабораториях, где результаты могут быть получены и интерпретируются быстро, легко и с минимальными затратами, и выгодно по сравнению с другими методами, используемыми для выявления дисульфидных связей, таких как масс-спектрометрия6 ,7 и круговой дихроизм8.

Одним из важных шагов в определении, если этот метод является подходящим методом для оказания помощи в исследовании является тщательное изучение первичной последовательности белка интерес застраховать есть цистеин остаток (ы) настоящее время. Еще одним полезным шагом является исследование каких-либо предыдущих кристаллических структур опубликованы или использовать Биоинформатика приложения для изучения трехмерной структуры белка интерес для визуализации, где остаток цистеина (ы) могут быть расположены. Если остаток (ы) присутствует на внешней поверхности это может быть лучшим кандидатом для формирования дисульфидной связи, а не цистеин остаток похоронен на внутренней стороне структуры. Тем не менее, важно отметить, что белки могут подвергнуться структурным изменениям после подложных взаимодействий или белков белка взаимодействий, позволяющих эти остатки затем становятся подвержены воздействию окружающей среды, а также.

Выявленные мультимерные комплексы можно затем проверить с помощью химического скрещиывания, используя формальдегид. Формальдегид является идеальным кросс-Linker для этого технику проверки из-за высокой проницаемости клеток и коротких кросс-ссылок пролета ~ 2-3 е, обеспечивая обнаружение специфических белок-белковых взаимодействий9,10. Здесь, этот метод иллюстрируется путем анализа ядерного Изоформа dUTPase из человеческой кости остеосаркомы клеточной линии U-2 OS11. Однако, этот протокол может быть адаптирован для других клеточных линий, тканей и организмов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Блокирование свободных остатков цистеина использование Йодацетамид

  1. Вырасти U-2 ячейки OS в 6 см2 блюдо до 50%-60% беглость в минимальной необходимой среде с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% натрия пируват на 37 ° c в 5% CO2.
  2. Сделайте свежий запас 10 мм йодацетамид незадолго до использования, затем Выбросьте неиспользованный реагент.
  3. Добавить 0,1 mM окончательная концентрация йодацетамид непосредственно в медиа клеточной культуры. Нежно раскачивать блюдо при комнатной температуре в течение 2 мин.

2. сбор клеток

  1. Аспоте СМИ из клеток.
  2. Промыть клетки с 5 мл холодного фосфата-буферизованные физиологический раствор (PBS) в три раза. Аспоте окончательный PBS мыть решение затем добавить 1 мл холодного PBS.
  3. Очистите клетки от нижней части блюда, используя скребок ячейки. Использование пипетки 1 мл составить PBS и клеточную подвеску и распределить всю жидкость в 1,5 мл трубки микроцентрифуги.
  4. Спин клетки на 7 500 x g в течение трех минут при температуре 4 °c. Аспоте PBS, оставив ячейку гранул позади. Ячейки гранулы могут храниться при температуре-80 ° c до обработки

3. Извлечение белка

  1. Подготовьте 100 мкл 1-х лизиса буфера, разбавленного в ddH2O (см. таблицу материалов). Добавить фенилметилсульфонал фторид (ВБГ) непосредственно перед использованием 1 мм окончательной концентрации.
  2. Добавить 50 мкл 1-го буфера лизиса непосредственно к клеточной грануле и приостановить. Инкубировать это на льду в течение 5 мин.
  3. Sonicate для 8 с использованием режима постоянного импульса на 40% (см. таблицу материалов для sonicate; настроить по мере необходимости для различных sonicаторов), сохраняя экстракт на льду.
  4. Спин экстракт при температуре 4 °C в течение 5 минут при 16 000 х г. Супернатант-это растворимая белковая фракция. Брэдфорд анализ может быть выполнена для определения концентрации белка при желании.

4. Подготовка образцов

  1. Возьмите 10 мкл растворимого белка и добавьте 10 мкл 1-х буферного буфера (4% СДД, 20%-н-3, 0,004% синий бромфенол и 0,125 м рис-совместимого, pH 6,8). Не добавляйте сокращения реагентов.
  2. Если анализ СДС-страницы будет выполнен в этот день, держите пробы на льду; для долгосрочного хранения,-20 °C соотвествующее. Прямо перед началом работы геля Нагрейте образец на 5 минут при температуре 85 ° c.

5. в естественных условиях формальдегид кросс-ссылок эндогенных белков в U-2 ячейки OS

  1. Вырасти U-2 ячейки OS в 175 cm2 колбы до 70%-80% беглость (см. раздел 1).
  2. Выполните формальдегида перекрестно увязки реакции
    1. В вытяжке, Алиготе 37% раствор формальдегида приобрел из коммерческих источников. Добавить в формальдегид фиксативный непосредственно в среду до конечной концентрации 1% и инкубировать при комнатной температуре с нежной агитации в течение 15 мин.
    2. Для утоления реакции, добавьте 1,25 м глицина в окончательную концентрацию 0,125 м и Инкубируйте при комнатной температуре с нежной агитацией на качалку в течение 5 мин.
  3. Промыть клетки с 5 мл холодного PBS в три раза. Аспоте окончательного PBS мыть решение и добавить 10 мл PBS. Очистите клетки от дна колбы, используя скребок для клеток.
  4. Использование пипетки 10 мл, составить PBS и клеточную подвеску и распределить все жидкости в 15 мл конической трубки центрифуги. Спин клетки на 500 x g для 2 мин при температуре 4 °c. Аспоте PBS, оставив ячейку гранул позади.

6. фракционирование ядер

  1. Приготовьте 10 мл буфера гомогенизации: 0,25 м сахароза, 1 мм ЭДТА, 10 мм HEPES и 0,5% БСА на pH 7,4. Добавляйте ВБГ непосредственно перед использованием до 1 мм конечной концентрации и 3 мл буфера подвески ядер (0,1% тритон X-100 в PBS).
  2. Добавьте буфер однородизации 5 мл непосредственно в клеточную Пелле и приостановить полностью. Центрифуга подвеска на 500 x g для 2 мин при температуре 4 °c затем отбросить supernatant.
  3. Приостановить гранулы в 5 мл буфера гомогенизации. Используйте плотно прилегает стекло-тефлон гомогенизатор, dounce гомогенизации клеток при 10 штрихов/500 оборотов в минуту.
  4. Центрифуга подвеска на 1 500 x g для 10 мин при температуре 4 °c, затем отбросить supernatant.
    Примечание: Используйте супернатант для изоляции митохондрий путем центрифугирования на 10 000 x g в течение 10 мин.
  5. Приостановить гранулы в 1 мл суспензии буфера и инкубировать на льду в течение 10 мин.
  6. Центрифуга на 600 x g в течение 10 мин. выбросите супернатант.
  7. Приостановить гранул в 1 мл суспензии буфера и центрифуги снова. Выбросьте супернатант. Окончательный гранулы будут выделены ядра.

7. Извлечение белка

  1. Повторите раздел 4, за исключением добавления 25 мкл 1-го буфера лизиса непосредственно в ячейку гранул затем приостановки.

8. Подготовка образцов

  1. Подготовьте два образца для СДС-страницы, приняв 10 мкл каждого из растворимого белка и добавьте 10 мкл 2-х буферного буфера СДМ и 1 мкл 2-меркаптоэтанола (BME).
  2. Нагрейте один образец в течение 5 минут при температуре 37 ° с и второй образец в течение 15 минут при температуре 98 ° с, чтобы обратить вспять перекрестное формальдегид.

9. СДВ-анализ страниц

  1. Подготовьте 1 л 1x рис-глицин работает буфер (25 мм рис, 192 mM глицин, 0,1% (w/v) СДБ).
  2. Настройка запущенных аппаратов ГДС-Пэйдж.
    Примечание:     этот протокол использует 16% сборного железобетона Tgx СДПБ-Page. Следует отметить, что любой процент гель может быть использован.
    1. За протокол производителя, откройте пакет гель хранится в и удалить кассету.
    2. Снимите гребень, который выравнивая колодцы и ленту из нижней части кассеты.
    3. Поместите гель в работает аппарат.
    4. Заполните камеру с 1x работает буфер до скважин погружают в жидкость. Использование пластиковых Pipet, промыть скважин с работает буфер.
  3. Загрузите образцы на гель вместе с 10 мкл предварительно окрашенных Стандартный маркер.
  4. Запустите гель на 200 V до фронта красителя примерно 1 см от дна геля.

10. Вестерн-блот

  1. Подготовьте 1 л 1x трансферного буфера (25 мм рис, 192 mM глицин, 20% метанола) и хранить при температуре 4 °C до использования.
  2. Аккуратно удалите гель и откройте кассету. Используя бритву, аккуратно вырезать и отбросить укладки гель. Возьмите гель с помощью одного угла и поместите его в лоток с буфером передачи, что позволяет ему качать осторожно в течение 5 минут.
  3. В то время как гель раскачивается, поместите ледяной блок (хранится в-20 ° c) в цистерну и добавить буфер передачи до 3/4 Full.
  4. Влажные поливинилидене фторид (ПВХ) мембраны путем замачивания его в 100% метанола для 30 с.
  5. После того, как 5 минут прошло, подготовиться к настроить передачу в лоток с буфером передачи. Буфер передачи должно быть достаточно, чтобы полностью затопить пятно. Настройка помаркой передачи следующим образом: внизу, в нижней части держателя кассеты (черный); затем толстые губки, экстра толстые промокательной бумаги, полиакриламида гель, мембрана ПВХ, толстые промокательной бумаги, и толстые губки; Затем, наконец, в верхней части кассеты держателя (белый) на вершине.
  6. Блокировка кассеты и поместить устройство в цистерну с ПВХ мембраны к положительному аноду и гель к негативному. Довершение единицы с буфером передачи пока ваш трансфер полностью погружен.
  7. Поместите устройство на верхнюю часть пластины перемешать. Добавить перемешать бар с блоком и начать перемешивании на 125 оборотов в минуту.
  8. Выполнить на 100 V для 60 мин.
  9. В то время как передача выполняется, подготовить раствор 5% сухого молока растворяется в рис-буферизованные физиологический раствор, с между-20, рН 7,5 (ТБСТ).
  10. Демонтаж блока и удаление мембраны, отметив, какая сторона была в контакте с гелем; Убедитесь, что эта сторона остается в лоток для оставшихся шагов.
  11. Замочите мембраны в течение 2 минут в рис-буферном физиологического раствора (ТБС), а затем блокировать мембраны путем инкубации в 5 мл 5% молока-ТБСТ раствор для 30 мин при комнатной температуре.
  12. Замените молоко свежим 4 мл 5% молока-ТБСТ раствора и добавить первичные антитела при надлежащем разведении (в этом случае, наше разбавление 1:2000 для антитела dUTPase) и инкубировать в течение ночи с нежным покачиваясь на 4 ° c.
  13. На следующий день, снимите пятно от 4 ° c качалку для качалку комнатной температуры, отбрасывая первичного раствора антитела.
  14. У трех быстрых моет с ТБСТ, используя достаточно жидкости, чтобы полностью погрузить пятно, а затем 3 моет, 5 мин каждый, качаясь медленно.
  15. После последнего мытья, добавить 5 мл 5% молока-ТБСТ решения и рок-блот в течение 15 минут, а затем отбросить.
  16. Добавьте вторичное антитело разбавленное в 5% молочно-ТНТ при нужной концентрации. (В этом случае, 1:5000 разведении козьего анти-кролика разбавленного в 5 мл 5% молока-ТБСТ раствора)
  17. Инкубировать при комнатной температуре, раскачиваясь на 1 ч, затем отбросить раствор.
  18. У трех быстрых моет с ТБСТ следуют 3 моет, 5 мин каждый, качалки медленно, затем отбросить окончательный мыть и добавить 5 мл ТБС.
  19. Подготовьте смесь 1:1 для раствора хемилюлюминесцентных растворов ECL (1 мл каждого реагента для конечного объема 2 мл) и добавьте это непосредственно в инкубации блот на 1 мин.
  20. Удалите мембрану с помощью пинцета и промокните угловой лабораторным протирайте, удаляя излишки раствора. Поместите мембрану в термоусадочную пленку и поместите протеиновую сторону в рентгеновскую кассету.
  21. Подвергайте мембрану рентгеновской пленке. Время экспозиции будет меняться.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ядерная dutpase формирует межмолекулярную связь дисульфида, формируя стабильную конфигурацию дисульфида через взаимодействие двух остатков цистеина, расположенных на третьей аминокислоты каждого мономерного протеина11. Это показано на рисунке 1a, B. Для обеспечения этой дисульфидной связи не было неспецифическое взаимодействие из-за нарушений миграции в неуменьшенными окружающей среды, т включение надлежащего контроля ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, изложенная здесь, дает прямой протокол для анализа мультимногомерных комплексов, стабилизированных через дисульфидные связи. Этот протокол может быть легко адаптирован к другим клеточных линий культуры, тканей и организмов, позволяющих для широкого спектра применений.

Важным шагом в этой процедуре является обеспечение того, чтобы увязывание дисульфидных соединений не являлось следствием процедуры извлечения. Любые свободные остатки цистеина могут быть заблокированы с использованием йода...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержимым этой рукописи.

Благодарности

Мы с благодарностью оцениваем усилия, выдвинутые д-р Дженнифер Фишер для очистки поликлональных антител dUTPase и Керри Чиккалион за все ее усилия, чтобы помочь редактировать эту рукопись. Это исследование было частично поддержано грантом фонда здоровья Нью-Джерси (Грант #PC 11-18).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% сборные гели TGXThermoFisherXp00160
175 см2 FlaskCell star658175
18COATCCCRL-1459
6 см2 тарелкаVWR10861-588
A549ATCCCCL-185
Amersham ECL detection kitGE
Аппарат для переноса BlotBiorad153BR76789
BMESigma AldrichM3148
Брэдфордский белковый реактивBiorad5000006
Бромофенол Blue
BSACell signaling99985
Буфер для лизиса клетокCell signaling9803
ЦентрифугаEppendor5415D
DMEMGibco11330-032
Сверло
EDTASigma AldrichM101
Аппарат для электрофорезаInvitrogenA25977
Сверхплотная западная промокательная бумагаThermoFisher88610
Fetal бычья сывороткаGibco1932693
ФормальдегидThermoFisher28908
Стекло-тефлоновый гомогенизатор
ГлицеринSigma Aldrich65516
ГлицинRPI636050
Тепловой блокDenville10285-D
HepesSigma AldrichH0527
Соляная кислотаVWR2018010431
ЙодоацетамидThermoFisher90034
Kimwipe Kimtech34155
МетанолPharmco339000000
Обезжиренное сухое молокоCell Signaling99995
PBSSigma AldrichP3813
PMSFSigma Aldrich329-98-6
Трубка Posi-click DenvilleC2170
Блок питанияBiorad200120
Окрашенный маркерThermoFisher26619
PVDF мембранаBiorad162-0177
RockerReliable Scientific55
Saos2ATCCHTB-85
SDSBiorad161-0302
Вторичное антителоКлеточная сигнализация70748
Скребок для мелких клетокTygonS-50HL класс VI
Хлорид натрияRPIS23020
Пируват натрияGibco
SonicatorBranson450
Губчатая подушечка для промоканияInvitrogenE19051
Пластина для перемешиванияCorningPC353
СахарозаSigma AldrichS-1888
Tris BaseRPIT60040
Tris Buffered Солевой раствор, с Tween 20, pH 7,5Sigma AldrichSRE0031
Трис-Глицин беговой буферVWRJ61006
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Tween 20Sigma AldrichP9416
U-2 OSATCCHTB-96
Рентгеновская пленкаThermoFisher34090
16817200

Ссылки

  1. Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
  2. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).
  3. Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins. Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).
  4. Groitl, B., Jakob, U. Thiol-based redox switches. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).
  5. Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha. Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).
  6. Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. Protein disulfide bond determination by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).
  7. Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).
  8. Kelly, S. M., Price, N. C. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
  9. Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585(2010).
  10. Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).
  11. Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut). Protein Science. , (2018).
  12. Caradonna, S., Muller-Weeks, S. The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity. Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).
  13. Macpherson, L. J., et al. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).
  14. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

U 2 OSdUTPase
Сочетая Неуменьшающие СДС-СТРАНИЧНЫЙ анализ и химические перекрестные ссылки для обнаружения Мультимерных комплексов, стабилизированных дисульфидными связями в клетках млекопитающих в культуре
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.