Соединений дисульфида длиной были знаны, что стабилизировали структуру много протеинов. Простой метод анализа мультимерных комплексов, стабилизированных этими связями, заключается в неуменьшении анализа СДС-СТРАНИЧКА. Здесь, этот метод проиллюстрирован путем анализировать ядерную изоформу dUTPase от людской косточки остеосаркомы клетки линии U-2 OS.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сочетая Неуменьшающие СДС-СТРАНИЧНЫЙ анализ и химические перекрестные ссылки для обнаружения Мультимерных комплексов, стабилизированных дисульфидными связями в клетках млекопитающих в культуре
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Структуры многих белков стабилизируются с помощью ковалентных дисульфидных связей. В последние работы, эта связь была также классифицируется как пост-поступательного модификации. Таким образом, важно уметь изучать эту модификацию в живых клетках. Простой метод для анализа этих цистеин стабилизировались мультимерные комплексы через двухступенчатый метод не снижения СДС-СТРАНИЧНЫЙ анализ и формальдегид кросс-ссылок. Этот двухступенчатый метод выгоден в качестве первого шага к выявлению мультимерных комплексов, стабилизированных дисульфидными связями из-за его технической легкости и низкой стоимости эксплуатации. Здесь, человеческая кость остеосаркомы клеточной линии U-2 OS используется для иллюстрации этого метода, специально анализируя ядерную Изоформа dUTPase.
Введение
Соединений дисульфида длиной были знаны, что стабилизировали структуру много протеинов. В последние работы, эта связь также была классифицирована как обратимые после поступательного изменения, действуя как цистеин основе "редокс переключатель", позволяющий модуляции функции белка, местоположение и взаимодействие1,2, 3,4. Таким образом, важно иметь возможность изучить эту модификацию. Простой метод для анализа этих цистеин стабилизированных мультимерные комплексы через несокращения СДС-PAGE анализ5. Анализ СДД-страниц....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Блокирование свободных остатков цистеина использование Йодацетамид
- Вырасти U-2 ячейки OS в 6 см2 блюдо до 50%-60% беглость в минимальной необходимой среде с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% натрия пируват на 37 ° c в 5% CO2.
- Сделайте свежий запас 10 мм йодацетамид незадолго до использования, затем Выбросьте неиспользованный реагент.
- Добавить 0,1 mM окончательная концентрация йодацетамид непосредственно в медиа клеточной культуры. Нежно раскачивать блюдо при комнатной температуре в течение 2 мин.
2. сбор клеток
- Аспоте СМИ из клет....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Ядерная dutpase формирует межмолекулярную связь дисульфида, формируя стабильную конфигурацию дисульфида через взаимодействие двух остатков цистеина, расположенных на третьей аминокислоты каждого мономерного протеина11. Это показано на рисунке 1a, B. Для обеспечения этой дисульфидной связи не было неспецифическое взаимодействие из-за нарушений миграции в неуменьшенными окружающей среды, т включение надлежащего контроля .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод, изложенная здесь, дает прямой протокол для анализа мультимногомерных комплексов, стабилизированных через дисульфидные связи. Этот протокол может быть легко адаптирован к другим клеточных линий культуры, тканей и организмов, позволяющих для широкого спектра применений.
Важным шагом в этой процедуре является обеспечение того, чтобы увязывание дисульфидных соединений не являлось следствием процедуры извлечения. Любые свободные остатки цистеина могут быть заблокированы с использованием йода.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержимым этой рукописи.
Благодарности
Мы с благодарностью оцениваем усилия, выдвинутые д-р Дженнифер Фишер для очистки поликлональных антител dUTPase и Керри Чиккалион за все ее усилия, чтобы помочь редактировать эту рукопись. Это исследование было частично поддержано грантом фонда здоровья Нью-Джерси (Грант #PC 11-18).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 16% сборные гели TGX | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 см2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 см2 тарелка | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | ||
| Аппарат для переноса Blot | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Брэдфордский белковый реактив | Biorad | 5000006 | |
| Бромофенол Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Буфер для лизиса клеток | Cell signaling | 9803 | |
| Центрифуга | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Сверло | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Аппарат для электрофореза | Invitrogen | A25977 | |
| Сверхплотная западная промокательная бумага | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal бычья сыворотка | Gibco | 1932693 | |
| Формальдегид | ThermoFisher | 28908 | |
| Стекло-тефлоновый гомогенизатор | |||
| Глицерин | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Глицин | RPI | 636050 | |
| Тепловой блок | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Соляная кислота | VWR | 2018010431 | |
| Йодоацетамид | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe Kimtech | 34155 | ||
| Метанол | Pharmco | 339000000 | |
| Обезжиренное сухое молоко | Cell Signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Трубка Posi-click Denville | C2170 | ||
| Блок питания | Biorad | 200120 | |
| Окрашенный маркер | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF мембрана | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Вторичное антитело | Клеточная сигнализация | 70748 | |
| Скребок для мелких клеток | Tygon | S-50HL класс VI | |
| Хлорид натрия | RPI | S23020 | |
| Пируват натрия | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Губчатая подушечка для промокания | Invitrogen | E19051 | |
| Пластина для перемешивания | Corning | PC353 | |
| Сахароза | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Солевой раствор, с Tween 20, pH 7,5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Трис-Глицин беговой буфер | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| Рентгеновская пленка | ThermoFisher | 34090 |
Ссылки
- Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
- Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
