Сравнительно запись в личиночной данио рерио, с помощью Роман конусообразной Губка наконечник электрода

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, который упрощает измерения света вызвали сравнительно ответов от личинок данио рерио. Роман конусообразной Губка наконечник электрода может помочь сделать изучение визуальной разработки в личиночной данио рерио, используя сравнительно Эрг проще для достижения надежных результатов и низкой стоимости.

Аннотация

Данио рерио (Danio рерио) обычно используется как позвоночных модель развития исследований и особенно подходит для визуального нейронауки. Для функциональных измерений визуального исполнения Эрг (ЭРГ) является идеальным неинвазивный метод, который был хорошо установленных в высших позвоночных видов. Этот подход все чаще используется для изучения зрительной функции в данио рерио, в том числе на ранних стадиях развития личинок. Однако наиболее часто используемые записи электрод для личинок данио рерио Эрг на сегодняшний день является Стеклянный электрод микропипеткой, которая требует специализированного оборудования для его производства, бросая вызов для лабораторий с ограниченными ресурсами. Здесь мы представляем протокол Эрг личиночной данио рерио, используя конусообразные Губка наконечник электрода. Роман электрод легче производства и ручкой, более экономично и меньше шансов повредить личиночной глаз, чем микропипеткой стекла. Как ранее опубликованные Эрг методы текущий протокол может оценить внешней функции сетчатки через фоторецептор и биполярных клеток ответов, a - и b волны, соответственно. Протокол можно четко иллюстрируют уточнение зрительной функции на протяжении раннего развития личинок данио рерио, поддерживая Утилита, чувствительность и надежность Роман электрода. Упрощенная электрод особенно полезна при создании новой системы Эрг или модификации существующих малых животного ERG аппарат для измерения данио рерио, помогая исследователям в визуального нейронауки использовать данио рерио модели организма.

Введение

Данио рерио (Danio рерио) стала широко используемых генетических позвоночных модели, включая исследования визуального нейронауки. Растущая популярность этого вида можно объяснить преимущества, включая легкость генетической манипуляции, высоко сохранены позвоночных зрительной системы (нейрон типы, анатомические морфологии и организации и базовой генетики), высокая плодовитость и более низкая стоимость животноводства, по сравнению с млекопитающих модели¹. Неинвазивная сравнительно (ЭРГ) уже давно клинически используется для оценки человеческой зрительной функции и в лабораторных условиях для количественного определения видения в ряде крупных и мелких видов, в том числе грызуны и личинок данио рерио^{2,3 , 4 , 5}. наиболее часто анализируемого Эрг компоненты в волны и волны b, происходящих из светочувствительных фоторецепторы и биполярный интернейронов, соответственно. В личиночной данио рерио 3 дня после оплодотворения (dpf) устанавливаются различные слои в сетчатке и Морфология конуса фоторецепторных терминала синапсов Зрелые до 4 dpf^6,7. Таким образом внешней сетчатки функции личиночной данио рерио устанавливается до 4 dpf, означает, что Эрг измеримые от этого раннего возраста начиная. Из-за короткий цикл экспериментальных и высок объём свойства модели Эрг был применен к личиночной данио рерио для функциональной оценки болезни моделей, анализ развития цвет видение и сетчатки, изучение визуального циркадные ритмы и тестирования препаратов^8,9,10,,1112.

Однако нынешние подходы для личинок данио рерио Эрг имеет некоторые сложности, которые могут сделать это труднее принять. Опубликованные личиночной данио рерио Эрг протоколы обычно используют стекло микропипеткой, наполненный проводящие жидкости как запись электрод^3,4,5,13, которое требует высокого качества микропипеткой подсказка³. Специализированное оборудование, например микропипеткой съемник и в некоторых случаях microforge, необходимых для их производства. Это может быть проблемой для лабораторий с ограниченными ресурсами и приводит к дополнительную плату даже при адаптации имеющихся небольших животных Эрг систем для измерения личиночной данио рерио зрительной функции. Даже когда сглаживаются, кончик острый микропипеткой может повредить поверхность личиночной глаза. Кроме того коммерческие микропипеткой Держатели для электрофизиологии построены с фиксированной серебряной проволокой. Эти несъемные провода стали пассивируется после повторного использования, требующих покупки новых держателей, ведущих к увеличению эксплуатационных расходов.

Здесь мы описываем метод Эрг, используя конусообразные Губка Совет запись электрода, что особенно полезно для адаптации установленных малых животных Эрг установок для личинок данио рерио Эрг измерений. Электрод легко производится с использованием общей Губка поливинилацетатные (ПВА) и тонкой серебряной проволоки без каких-либо другое специализированное оборудование. Наши данные показывают, что этот роман электрод является чувствительным и достаточно надежным, чтобы продемонстрировать функционального развития сетчатки нейронных цепей в личиночной данио рерио между 4 и 7 dpf. Это экономичный и практичный Губка наконечник электрода может быть полезным для исследователей, создания новых систем Эрг или модификации существующих систем малых животных, данио рерио исследований.

Протокол

Все сравнительно (ЭРГ) процедуры выполнялись согласно положениям австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета кодекса практики для ухода и использования животных и были утверждены Комитетом по институциональной этики животных на Университет Мельбурна.

1. буфер подготовка

1. Подготовка 10 x буфер Золотая рыбка Рингера (1,25 М NaCl, 26 мм KCl, 25 мм CaCl₂, 10 мм MgCl₂, глюкозы 100 мм, 100 мм HEPES) с использованием обратного осмоса (RO) воды. Настроить буфер рН 7,8 и стерилизовать буфер с помощью фильтра 0.22 мкм. Магазин 10 x буфер при 4 ° C как решение штока³.
   Примечание: 10 x буфер Рингера должны быть использованы в течение 3 месяцев.
2. В день эксперимента сделайте 1 x Золотая рыбка звонаря буфера путем разбавления 10 x Золотая рыбка звонаря буфера с использованием обратного осмоса воды.
   Примечание: 1 x Золотая рыбка звонаря буфер используется для насыщения Губка PVA, включая Губка, используемые для размещения личиночной данио рерио и Губка на запись электрода.

2. электрод подготовка

1. Подготовка записи электрода конусообразной Губка.
   1. Вырезать мужской конца от расширения свинца Платиновый электрод и удалить из конца 10 мм внешней политетрафторэтилена теплоизолирующего покрытия с использованием лезвием скальпеля. Будьте осторожны, чтобы не повредить внутренний провод электродный свинца.
   2. Cut длиной 40 мм из серебряной проволоки (диаметром 0,3 мм) и надежно прикрепите это электрод свинца, дизайне которого гармонично сплетаются Серебряная проволока подвергается внутренней проволокой. Накрыть совместное использование изолента, оставляя ~ 15 мм длиной Серебряная проволока подвергается (рис. 1A).
   3. Гальваническим подвергаются серебряной проволоки с хлорид, с использованием источника 9 В постоянного тока для 60 s для улучшения сигнала проводимости. Погрузите кончик воздействию серебра в нормальное saline и подключите другой конец к положительной клемме аккумулятора. Подключите другой провод чтобы отрицательный вывод аккумулятора и погружать на другом конце провода в солевой².
      Примечание: Кроме того хлорирование серебряной проволоки, впитывая его на 1 час в раствор отбеливателя (Гипохлорит натрия активного ингредиента 42 г/Л).
   4. Вырежьте квадрат ПВА ~ 20 мм х 20 мм Губка ножницами сделать конус (рис. 1A). Пропитать губку с помощью 1 x Рингера буфера. Под микроскопом с линейки на окуляр используйте лезвие скальпеля для формирования вершины конуса диаметром ~ 40 мкм. Воздух сухой конусообразной губкой на абсорбирующий бумаги до тех пор, пока это твердый.
      Примечание: Губка PVA значительно расширяется, когда насыщенный, таким образом, важно, что впервые губка насыщена с физиологического раствора до формирования вершины конуса.
   5. После chloriding воздух сухой серебряной проволоки на поглощающей ткани на 5 мин Вставка серебряной проволоки в высушенный, твердые, конусообразные Губка PVA через основание конуса. Изолируйте любой избыток подвергаются металла, с помощью маски ленты для уменьшения фотоэлектрических артефакты (Рис. 1B-C).
      Примечание: После каждой экспериментальной сессии Удалите губкой из серебряной проволоки. Промойте губку с использованием обратного осмоса вода и воздух сухой для повторного использования. Для обеспечения оптимального сигнала коллекции, рекомендуется однократное использование серебряной проволокой. ПВА губки должен быть повторно не более 5 раз.
   6. В день эксперимента погрузиться кончик губки записи электрод 1 x буфер Рингера для по крайней мере 15 минут, чтобы полностью пропитать губку.
2. Подготовьте Справочник электродов, как описано выше, но не подключая кончик губки.
3. Получите землю электрода коммерчески.

3. данио рерио подготовка

1. Темный адаптировать данио рерио личинок на ночь (> 8 h) до записи, поместив данио рерио в 15 мл (< 20 личинок в трубку) завернуты в фольгу в темной инкубатора. Снимите крышку для обеспечения адекватной кислорода.
2. В день записи затяните крышку на трубу Сокол, завернутые в фольгу, содержащие личинки и убедитесь, что трубка свет доказательство. Транспортные личинок в лабораторию Эрг.
3. Залейте рыбу в Петри в темноте с помощью тусклый красный освещения от светоизлучающих диодов (СИД; 17,4 cd.m^-2, λ_Макс 600 Нм). Обложка Петри с помощью света доказательство полотенца для сведения к минимуму воздействия света.

4. Губка платформы Подготовка

1. Вырежьте прямоугольник сухой Губка PVA плотно в 35 мм Петри. Убедитесь, что толщина губка должна быть примерно равна глубине Петри.
2. Сделайте небольшой надрез вертикально через один конец Губка для размещения серебряной проволоки электрод сравнения.
3. Замочите губки ПВА 1 x Золотая рыбка звонаря буфера до насыщения. Затем место губки в чашке Петри чистой 35-мм. Используйте бумажную салфетку, чтобы поглотить дополнительную жидкость до тех пор, пока решение не излучает из губки в ответ на нажатие света палец.

5. животных и позиционирование электрода

1. Анестезировать личинки, с помощью tricaine 0,02%, разводят в 1 x Золотая рыбка звонаря буфера.
2. Используйте 3 мл пипетка Пастера для передачи наркотизированных личинка на площади бумажное полотенце (²~ 3 см).
3. Поместите бумажное полотенце, содержащие личинки на платформе влажной губкой, используя пинцет. Позволяет регулировать положение личинка тонкой кистью, смоченной в буфере Рингера. Убедитесь, что это один глаз смотрело вверх, изолированных от близлежащих жидкость на площади бумажное полотенце под личинка.
4. Глазурь личиночной тела, за исключением головы, с увлажняющий гель для глаз держать личинка влажные во время записи Эрг.
5. Расположите Петри с губкой платформы на небольшой платформе с подогревом воды перед Ganzfeld шар света стимул, расположенный внутри клетки Фарадея (рис. 1 d).
   Примечание: Поддержание температуры Губка и личинок тела обеспечивает стабильные сигналы Эрг.
6. Вставьте ссылку электрода в разруба в платформе губки (рис. 1 d).
7. Подключите электрод коммерчески полученные земли в клетку Фарадея.
8. Приложите электрод записи держатель электрода и зафиксируйте держатель для стереотаксического руку микроманипулятор (рис. 1 d). Используйте 3 мл пипетка Пастера закапать капли 1 x раствор Рингера на кончик губки для повторного насыщенности электрода.
9. Поместите микроскоп в клетку Фарадея Эрг платформу для размещения электрода.
   Примечание: Освещенность должна обеспечиваться тусклый красный светодиод (17,4 cd.m^-2, λ_Макс 600 Нм) чтобы разрешить наблюдение личинка и размещения активного электрода, сохраняя dark-adaptation.
10. Отрегулируйте положение Губка платформы позволяют наблюдения личинка под микроскопом. Затем используйте поглощающей ткани для удаления лишней жидкости из губки электрода.
11. Установите активный электрод, таким образом, чтобы он нежно трогает Центральной поверхности роговицы глаза личиночной данио рерио (Рисунок 1E).
12. Переместить чашу Ganzfeld к платформе Губка и убедитесь, что личинка покрыта чаши.
13. Закройте клетку Фарадея для уменьшения посторонних электромагнитных помех.

6. сравнительно запись

1. Используйте компьютер программное обеспечение конкретной системы Эрг (см. таблицу материалов для деталей) для показа стимул и сбора данных на основе параметров рекомендуется ниже².
   1. Задайте частоту выборки системы до 4 кГц над 650 ms записи окна (2560 точек) в приобретении программного обеспечения.
   2. Настроить усиление системы до 1000 ×.
   3. Полосовой фильтр системы 1 – 300 Гц установите.
   4. Используйте узкополосный режекторный фильтр для уменьшения 60 Гц (или 50 Гц, в зависимости от местных коммунальных частоты) шум.
      Примечание: Идеальный уровень шума уровень должен быть не более, чем ±10 мкВ.
2. Начать сбор данных, с помощью описанной ниже процедуры.
   1. Используйте один тест flash (0,06 журнала cd.s/m²) для измерения тест ответ от глаз, чтобы оценить положение электродов.
      Примечание: Этот интенсивности вспышки испытания должно привести к амплитуда волны b, больше чем 25 мкВ в 4-dpf личинки. Если надежный ответ не может быть измерена, затем переместите электродов и другой тест вспышки для подтверждения, что электроды хорошо расположены.
   2. После тест flash, позволяют животное в темноте адаптировать 3 мин в полной темноте до записи.
   3. Настоящее время мигает с диммером ярче света.
   4. Средняя сигналы через повторяется в зависимости от уровня сигнала к шуму.
      Примечание: Как правило в среднем больше сигналов на уровне тусклее светло (не менее 3 повторяет) и меньше на уровне ярче света (обычно 1 повтор). Постепенно удлиняют интервал между стимул от 10 до 60 s от тёмной для яркой освещенности. Образец протокола приводится в таблице 1.
   5. После записи гуманно убить личинок, используя tricaine 0,1%.

7. анализ

1. Измерения амплитуды в волны от базовой линии до отрицательных корыта-волны и b волны амплитуда от негативных корыта-волна на пик положительных b волны.
2. Измерьте a - и b волны неявные раз от начала стимула корыта в волны и пик волны b, соответственно.

Результаты

Этот раздел предоставляет представителя результаты для Эрг измерений ежедневно от 4 до 7 dpf. От 4 dpf Эрг ответы свидетельствуют надежные компоненты a - и b волны, которые возникают от фоторецепторных клеток и биполярных клеток, соответственно. В каждом возрасте протестированы амплитуда волны b увеличилось с интенсивности света (рис. 2; Рисунок 3). В частности чувствительности личиночной данио рерио сетчатки для диммера вспышки увеличивается...

Обсуждение

Функциональные устройства индикации как Эрг стали все более важное значение в набор инструментов, используемых для изучения личиночной данио рерио^8,9,12,14. Из-за небольшого размера глаза личиночной данио рерио стекло micropipettes была адаптирована как запись электродов в наиболее опубликованные протоколы^3,4,

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,22 & микро; m фильтр	Millex GP	SLGP033RS	Фильтры 10× золотая рыбка звонок буфер для стерилизации
1 мл шприц	Terumo	DVR-5175	с 30G × ½ Иглой следует добавить капли физиологического раствора на кончик губки электрода, чтобы предотвратить высыхание и повышенный шум в сигналах ЭРГ.
30 G × ½ " игла	Terumo	NN*3013R	Для добавления солевого раствора с сопнговым наконечником электрода.
Биоусилитель	ADInstruments	ML135	Для усиления сигналов ЭРГ.
Раствор отбеливателя	Кинг Уайт	9333441000973	Для альтернативного метода хлорирования ленточным электродом. Действующее вещество: 42 г/л гипохлорита натрия.
Циркуляционная водяная баня	Lauda-Koönigshoffen	MGW Lauda	Используется для изготовления водогрейной платформы.
Электродный провод	Grass Telefactor	F-E2-30	Platinum кабели для подключения электродов серебряной проволоки к усилителю.
Фотометрическое решение Faraday Cage	International		Для поддержки адаптации темноты и включения установки Ganzfeld для улучшения соотношения сигнал/шум.
Ганцфельдская чаша	фотометрическое решение International		Специально разработанный светостимулятор: диаметр 36 мм, размер апертуры 13 см.
Luxeon светодиоды	Phillips Light Co.		Для стимуляции света двадцать светодиодов мощностью 5 Вт и один светодиод мощностью 1 Вт.
Микроманипулятор	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Удерживает регистрирующий электрод во время экспериментов.
Microsoft Office Excel		Microsoft версии 2010	Программа для анализа электронных таблиц.
Увлажняющий гель для глаз	GenTeal Gel	9319099315560	Используется для покрытия личинок рыбок данио во время записи во избежание обезвоживания. Действующее вещество: 0,3 % гипромеллоза и 0,22 % карбомер 980.
Пастеровская пипетка	Copan	200C	Используется для бережного переноса личинок данио-рерио.
Система сбора данных Powerlab	ADInstruments	ML785	Управляет светодиодами для генерации стимулов.
Губка ПВА	MeiCheLe	R-1675	Для размещения личинок рыбок данио и изготовления конусообразного электрода из
солевого раствора	Aaxis Pacific	13317002	Для гальванического покрытия электрода из серебряной проволоки.
Программное обеспечение	Scope ADInstruments	версии 3.7.6	Одновременно запускает стимул через систему Powerlab и собирает данные
Серебро (тонкая круглая проволока)	A & E металл	0,3 мм	Используется для изготовления записывающих и эталонных электродов ЭРГ.
Стереомикроскоп	Leica	M80	Используется для придания формы и измерения конусообразной вершины губки (с масштабной линейкой на окуляре). Размещается в клетке Фарадея для установки электродов.
Трикаин	Sigma-aldrich	E10521-50G	Для обезболивания личинок данио-рерио.
Платформа с водяным подогревом	, изготовленная по индивидуальному заказу		Для поддержания температуры губчатой платформы и тела личинки во время записи ERG