Здесь мы описываем сборку РНК-полимеразы II (Pol II) удлиненных комплексов, требующих только коротких синтетических ДНК и Олигонуклеотидов РНК и очищенных Пол II. Эти комплексы полезны для изучения механизмов, лежащих в основе совместной транскрипционной обработки стенограмм, связанных с комплексом удлинения Пол II.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Искусственные РНК-полимераза II Удлинение Комплексы для вскрытия co-транскрипционной РНК обработки событий
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эукариотический синтез мРНК представляет собой сложный биохимический процесс, требующий транскрипции шаблона ДНК в прекурсор РНК многосубединым ферментом РНК-полимераза II и сотранскрипционным укупоркой и сплайсингом РНК-прекурсора для формирования зрелой мРНК. Во время синтеза мРНК комплекс удлинения РНК-полимеразы II является мишенью для регулирования большой коллекцией транскрипционных факторов, контролирующих его каталитической активностью, а также укупорки, сращивания и 3'обработки ферментов, которые создают зрелые мРНК. Из-за присущей им сложности синтеза мРНК более простые экспериментальные системы, позволяющие проводить изоляцию и исследование различных стадий сотранскрипции, обладают большой полезностью.
В этой статье мы описываем одну из таких простых экспериментальных систем, пригодных для исследования котранскрипционной РНК-укупорки. Эта система опирается на определенные комплексы рнк-полимеразы II, собранные из очищенной полимеразы и искусственных транскрипционных пузырьков. При обездвижении с помощью биотинителированной ДНК эти комплексы рнк-полимераза II удлинения обеспечивают легко манипулируемый инструмент для вскрытия котранскрипционной РНК-укупорки и механизмов, с помощью которых комплекс удлинения набирает и регулирует укудчивую фермент во время скотрансктионная РНК укупорки. Мы ожидаем, что эта система может быть адаптирована для изучения набора и/или сборки белков или белковых комплексов с ролями на других стадиях созревания мРНК в сочетании с комплексом вытяжения РНК-полимеразы II.
Введение
Эукариотический посыльный РНК (мРНК) синтез является сложным биохимическим процессом, который включает в себя синтез необработанной РНК-прекурсоров РНК-полимераза II и обработка РНК-прекурсора для получения зрелой мРНК. Этапы обработки РНК, укупорки, сращивания и полиаденилаации выполняются в основном совместно транскрипционно. Комплекс удлинения Pol II служит эшафотом, который вербует и организует деятельность многих ферментов обработки РНК. Следовательно, наше окончательное понимание того, как образуются зрелые эукариотические мРНК, будет в значительной степени опираться на разработку экспериментальных систем, позволяющих рассеивать биохимические механизмы, лежащие ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Сборка искусственных удлинений комплексов и Пол II Ходьба
- Обездвижить 1 нмоль нешаблонного олиго ДНК, содержащего молекулу биотина 3' на магнитных бусинах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги можно сделать заранее, чтобы подготовиться к будущим экспериментам. Все последовательности олиго, используемые в этом протоколе, приведены в таблице1. ОлигорнЫ РНК синтезируются с 5'-трифосфатных модификаций.- Добавьте 200 л магнитных бусин (10 мг/мл) в трубку с низким содержанием белка 1,5 мл, а затем поместите на магнитную стойку на 2 мин.
- В то время как трубка находится на магнитной стойке, удалить жидкость из трубки, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Цифры 2 и 3 показывают репрезентативные реакции результатов, используемые для генерации комплексов искусственного удлинения, содержащих транскрипты различной длины путем расширения или Pol II из различных источников. На рисунке 4 показано, как эти удлинение комплексы могут быть использованы для проверки котранскрипционного CTD фосфорилирования-зависимой РНК укупорки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Исследования, которые стремятся вскрыть события в сочетании с комплексом удлинения Pol II, таким как обработка РНК и регулирование самой удлинения стенограммы, могут быть значительно облегчены с помощью высокоочищенной ферментной системы. Настройка таких ферментных систем может быть сложной задачей. Промоутер-зависимая транскрипция Пол II требует по крайней мере пяти общих факторов транскрипции. Подготовка и накопление этих факторов может занять месяцы; следовательно, меромером в этом процессе часто является просто подго.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим С. Шумана за предоставление фермента укупорки млекопитающих кДНК. Эта работа была частично поддержана грантом Института медицинских исследований Stowers от Фонда медицинских исследований Хелен Нельсон в Большом Канзас-Сити. Исходные данные, лежащие в основе этой рукописи, можно получить из хранилища исходных данных Stowers в http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| [α-32P] UTP (3000 Ки/ммоль), 1 мКи | Perkin Elmer | NEG007H001MC | Для радиоактивного мечения РНК |
| 2x РНК загружающим красителем | New England Biolabs | B0363S | Настоятельно рекомендуется. Для получения РНК при загрузке гелем |
| 40% Bis:Акриламид раствор | Biorad | 1610144 | |
| Бычья сыворотка Альбумин (20 мг/мл) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (комплекс CAK) Белок, активный, 10 & микро; g | Millipore Sigma | 14-476 | Используется для фосфорилирования |
| олигонуклеотидов | IDT | Смотрите Таблицу 8 для спецификаций чистоты | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | Мы также без проблем использовали Dynabeads M-280 стрептавидин, но предпочитаем гранулы MyOne Streptavidin, потому что они медленнее оседают |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 мг/мл) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Настоятельно рекомендуется. Красители гранулы нуклеиновой кислоты синий делают реакции намного проще в обращении |
| Hoefer SE600 стандартная система вертикального электрофореза с двойным охлаждением с прокладками 1 мм и 15 лунками | гребня Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract пробирки высокой плотности (1,5 мл) | Qiagen | 129046 | настоятельно рекомендуется. Содержит гель высокой плотности, который образует устойчивый барьер между водной и органической фазами; улучшает выход РНК при экстракции раствора |
| протеиназы К (20 мг/мл) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| РНК-олигонуклеотиды | Trilink | Подробнее см. Таблицу 8 | |
| Дрожжевая неорганическая пирофосфатаза (100 ед./мл) | New England Biolabs | NEBM2403S | Требуется только во время реакций каппинга |
Ссылки
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble du....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
