Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Искусственные РНК-полимераза II Удлинение Комплексы для вскрытия co-транскрипционной РНК обработки событий

9.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59497

⸱

13 мая 2019 г.

 ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Kansas University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем сборку РНК-полимеразы II (Pol II) удлиненных комплексов, требующих только коротких синтетических ДНК и Олигонуклеотидов РНК и очищенных Пол II. Эти комплексы полезны для изучения механизмов, лежащих в основе совместной транскрипционной обработки стенограмм, связанных с комплексом удлинения Пол II.

Аннотация

Эукариотический синтез мРНК представляет собой сложный биохимический процесс, требующий транскрипции шаблона ДНК в прекурсор РНК многосубединым ферментом РНК-полимераза II и сотранскрипционным укупоркой и сплайсингом РНК-прекурсора для формирования зрелой мРНК. Во время синтеза мРНК комплекс удлинения РНК-полимеразы II является мишенью для регулирования большой коллекцией транскрипционных факторов, контролирующих его каталитической активностью, а также укупорки, сращивания и 3'обработки ферментов, которые создают зрелые мРНК. Из-за присущей им сложности синтеза мРНК более простые экспериментальные системы, позволяющие проводить изоляцию и исследование различных стадий сотранскрипции, обладают большой полезностью.

В этой статье мы описываем одну из таких простых экспериментальных систем, пригодных для исследования котранскрипционной РНК-укупорки. Эта система опирается на определенные комплексы рнк-полимеразы II, собранные из очищенной полимеразы и искусственных транскрипционных пузырьков. При обездвижении с помощью биотинителированной ДНК эти комплексы рнк-полимераза II удлинения обеспечивают легко манипулируемый инструмент для вскрытия котранскрипционной РНК-укупорки и механизмов, с помощью которых комплекс удлинения набирает и регулирует укудчивую фермент во время скотрансктионная РНК укупорки. Мы ожидаем, что эта система может быть адаптирована для изучения набора и/или сборки белков или белковых комплексов с ролями на других стадиях созревания мРНК в сочетании с комплексом вытяжения РНК-полимеразы II.

Введение

Эукариотический посыльный РНК (мРНК) синтез является сложным биохимическим процессом, который включает в себя синтез необработанной РНК-прекурсоров РНК-полимераза II и обработка РНК-прекурсора для получения зрелой мРНК. Этапы обработки РНК, укупорки, сращивания и полиаденилаации выполняются в основном совместно транскрипционно. Комплекс удлинения Pol II служит эшафотом, который вербует и организует деятельность многих ферментов обработки РНК. Следовательно, наше окончательное понимание того, как образуются зрелые эукариотические мРНК, будет в значительной степени опираться на разработку экспериментальных систем, позволяющих рассеивать биохимические механизмы, лежащие в основе набора в удлинение комплекса и регулирование ферментов, ответственных за совместное транскрипционное укупорки, сплайсинг и полиаденилацию.

Неудивительно, что разработка таких экспериментальных систем была сложной задачей. Основным препятствием была замечательная сложность самой транскрипции Pol II, где просто ездовестяя базальную транскрипцию Pol II in vitro требует минимального набора из пяти общих факторов инициации транскрипции: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF и TFIIH 1. Кроме того, восстановление любого вида регулируемой транскрипции Pol II in vitro требует еще большего набора транскрипционных факторов и корегуляторов. Таким образом, основной целью было разработать более простые экспериментальные системы, позволяющие воссоздать активные комплексы удлинения Pol II, пригодные для исследования функционального соединения транскрипции Пол II и обработки РНК.

Один из таких простых методов для восстановления активных комплексов удлинения Пол II оказался полезным для структурных и биохимических исследований удлинения Pol II и, в последнее время, для исследования совместной транскрипционной обработки РНК2,3 ,4,5. В этой статье мы покажем, как комплексы удлинения Pol II, приготовленные из очищенного Поля II и синтетических пузырей транскрипции, могут быть эффективно использованы для исследования механизмов, лежащих в основе котранскрипционного укупорки зарождающихся транскриптов Pol II.

Capping относится к ковалентное добавление 5'-гуанозин "шапка" на 5'-трифосфат конце зарождающейся Пол II стенограммы. Крышка важна для последующих этапов созревания мРНК, транспортировки, перевода и других процессов6,7. Крышка добавляется совместно транскрипционно в пол II стенограммы фермента называют укупорки фермента. В клетках млекопитающих активные участки, ответственные за РНК 5'-трифосфатаза и гуанилил трансферазы деятельности фермента укупорки, содержатся в одном полипептиде8. Фермент укупорки завербован к комплексу удлинения Pol II через взаимодействия с еще не определенными поверхностями на теле Pol II и домене rpb1 carboxy-терминального (CTD) фосфорилона на Ser5 его гептапептида повторяет5. В комплексе удлинения фермент укупорки катализает добавление крышки 5'-гуанозин, как только зарождающийся транскрипт достигает длины не менее 18 нуклеотидов и вышел из канала выхода из полимеразной РНК. На первом этапе реакции укупорки, трифосфатазы гидролизов РНК 5'-трифосфат аудионизирует 5'-дифосфат. На втором этапе GTP гидролизуется до GMP гуанилил-трансферазой, образуя промежуточный фермент GMP-capping. Наконец, гуанылил трансферазы передает GMP в 5'-дифосфатный конец зарождающегося транскрипта для получения крышки.

Примечательной особенностью укупорки реакции является то, что совместнотранскрипционные укупорки (т.е. укупорки стенограмм, связанных с функциональными комплексами удлинения Пол II) является гораздо более эффективным, чем укупорки свободной РНК5,9. Таким образом, главный вопрос в этой области заключается в том, как эта драматическая активация укупорки достигается через взаимодействие фермента укупорки с комплексом удлинения Pol II. В этом протоколе мы описываем сборку активных комплексов рнк-полимеразы II с использованием только очищенной РНК-полимеразы II и искусственных транскрипционных пузырей. Эти методы позволяют создавать удлинение РНК-полимераза II комплексов с транскриптами определенной длины и последовательности. В недавнем исследовании, мы использовали эти определенные РНК полимеразы II удлинение комплексов в качестве модели для изучения аспектов механизмов РНК укупорки5. В частности, мы показали, что (i) укупорки РНК, связанные с этими удлинением комплексов, были более чем в 100 раз более эффективными, чем ограничение свободной РНК и (ii) стимулировалось TFIIH-зависимым фосфорилированием Pol II CTD. Описанный здесь подход в принципе можно было бы адаптировать для генерации субстратов для изучения других реакций по обработке РНК, связанных с комплексом удлинения Пол II.

В разделе 1 этого протокола, искусственные комплексы удлинения создаются путем аннулирования синтетического шаблона нити ДНК олигонуклеотида к Олигонуклеотид РНК, который дополняет в своем 3'-end примерно 9 нуклеотидов шаблона нити ДНК. Пол II затем загружается на ДНК: РНК дуплекс. Удлинение комплекс затем завершается добавлением частично дополняющих, не-шаблон наяп ДНК олигонуклеотида, который помечен с биотином на его 3'-конец (Рисунок 1 и Рисунок 2A). Олигонуклеотид РНК продлевается Полом II в этих удлиненных комплексах, чтобы сделать радиомаркированные транскрипты определенной длины и последовательности при добавлении соответствующих комбинаций радиомаркированных нуклеотидов. Кроме того, используя комбинацию смок для удаления неинкорпорированных нуклеотидов и дальнейшего добавления различных комбинаций нуклеотидов, можно «ходить» пол II в разные позиции по шаблону ДНК и синтезировать РНК определенных длин. РНК затем очищается и подвергается электрофорезу в денатурируя гели мочевины-PAGE. В разделе 2 протокола для анализа котранскрипционной РНК-укупорки используются комплексы искусственного удлинения. В приведенном примере представлены меры воздействия фосфорилирования TFIIH на совместное транскрипционное укупорки РНК. В этом эксперименте мы измеряем степень котранскрипционного укупорки как функцию укупорки концентрации фермента (5, 15 и 45 нг на реакцию) и время (1, 2 и 4 мин).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Сборка искусственных удлинений комплексов и Пол II Ходьба

  1. Обездвижить 1 нмоль нешаблонного олиго ДНК, содержащего молекулу биотина 3' на магнитных бусинах.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Следующие шаги можно сделать заранее, чтобы подготовиться к будущим экспериментам. Все последовательности олиго, используемые в этом протоколе, приведены в таблице1. ОлигорнЫ РНК синтезируются с 5'-трифосфатных модификаций.
    1. Добавьте 200 л магнитных бусин (10 мг/мл) в трубку с низким содержанием белка 1,5 мл, а затем поместите на магнитную стойку на 2 мин.
    2. В то время как трубка находится на магнитной стойке, удалить жидкость из трубки, не нарушая бисера. Чтобы вымыть бисер, снимите трубку со стойки, добавьте 1 мл 5 мМ Tris-HCl pH 7.5, 0,5 мМ EDTA, 1 M NaCl, верните трубку в стойку и удалите раствор для мытья после 2 мин.
    3. Повторите стих стих ает еще 2 раза, используя 200 зл и того же буфера.
    4. Отстегивание магнитных бусин в 400 мл 10 мм Tris-HCl pH 7,5, 1 мМ EDTA, 2 М NaCl, буфер. Затем смешайте с 380 зл и H2O и 20 Зл из 10 мкм нешаблона биотинилатированных ДНК олиго. Поместите трубку на nutator и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
    5. Вымойте обездвиженной нешаблонной ДНК олиго 3 раза с 200 зл и 5 мМ Tris-HCl pH 7.5, 0,5 мМ EDTA, 1 M NaCl, а затем 3 раза с 200 мкм HEPES-NaOH pH 7,9, 20% глицерол, 100 мм KCl, 1 мМ EDTA, 0,5 мг/мл бычьей сыворотки альбумина.
    6. Оставьте трубку на ночь при 4 градусах Цельсия, чтобы закончить блокирование бисера с BSA.
    7. На следующий день поместите трубку в магнитную стойку, снимите и отбросьте жидкость, и отрептите бусы в 200 л 20 ММ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% глицерола, 100 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 0,5 мг/мл крупной сыворотки и перенос на новую трубку. Для этого шаблона ДНК конечная концентрация составляет примерно 5 км.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации и концентрация олиго должны быть эмпирически определены для каждого биотиниляционного олиго ДНК. Этот шаблон должен обеспечить достаточно для 200 реакций, и длиться по крайней мере 6 месяцев при хранении при 4 градусах Цельсия.
  2. Аннеал РНК и ДНК шаблон атрии олигонос в 2:1 молярное соотношение (20 и 10 рмоль, соответственно), чтобы получить ДНК: РНК дуплекс.
    1. Настройка смеси 10 злеа annealing, как описано в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10 юл annealing смеси достаточно для 10 реакций. Annealing смесь может быть масштабирована по мере необходимости, если больше анализов должны быть выполнены.
    2. Выполните annealing реакции в тепловой циклист с помощью следующей программы: 5 мин при 45 градусах Цельсия, а затем 12 циклов по 2 мин каждый, начиная с 43 градусов по Цельсию и снижение температуры 2 градусов по Цельсию за цикл. Простоя при 4 градусах по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это гибкий временной момент. Аннеалинг заканчивается в течение 30 мин, но может быть оставлен при 4 градусах По Цельсию в течение более длительного периода. В лаборатории, annealing смеси были оставлены сидя до 4 ч без наблюдения какого-либо снижения эффективности реакции.
    3. В то время как аннулирование РНК шаблона нити ДНК, подготовить буферы для более поздних шагов протокола. Ингредиенты, необходимые для подготовки каждого буфера для одной реакции с каждым буфером, перечислены в таблицах от 2 до 8. Масштабируйте рецепты в разы в размере 1 евро для мытья и (X-1) для всех других буферов. X - количество реакций, которые должны быть подготовлены; Y - количество необходимых стирок (минимум 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все буферы свежими в день эксперимента. Не размещайте трубки на льду после добавления ПВА в буферы. Добавьте Pol II или нуклеотиды в буферы прямо перед использованием.
  3. Нагрузка очищенная РНК-полимераза II на гибрид ДНК: РНК.
    1. Смешайте 1 пмоль (1 кв л) ДНК: РНК дуплекс с 13 Зл буфера Пол II (из таблицы 3).
    2. Добавьте 0,02 единицы очищенной РНК Pol II (1 квл) в смесь со ступени 1.3.1 и смешайте, аккуратно трубачя вверх и вниз и помешивая кончиком трубы, не вводя пузырьков. Инкубировать в течение 10 мин при 30 градусах По Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы, приведенные отсюда, для одной реакции; масштабировать по мере необходимости для количества реакций в эксперименте. РНК Pol II очищены от печени крысы, как описано10 используется в этом примере; однако, РНК Пол II очищены от других источников, в том числе культивированных клеток млекопитающих или дрожжей также могут быть использованы3,4,5,11,12,13.
  4. Завершите удлинение комплекса путем добавления биотинилатной нешаблонной ДНК.
    1. Добавьте 5 пмоль (1 кЛ) олиго нешаблонной ДНК до 14 qL нешаблонного буфера ДНК (из таблицы4), добавьте в трубку от шага 1.3.2, и инкубировать в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия.
    2. Поместите образец в магнитную стойку в течение 2 мин. Вымойте 1x с 30 злителем буфера для мытья (из таблицы7), чтобы удалить неинкорпорированные Пол II и олиго.
  5. Создание удлиненных комплексов, содержащих радиомаркированные РНК 23mers.
    1. Выполните все дальнейшие инкубации при 30 градусах Цельсия. Добавьте 1 кЛ из 15 ММ АТФ и 10 «Ci»L (1 qL) из з--32P UTP (3000 Ci/mmol) к 23 Зл буфера импульса и используйте это для повторной работы промытых магнитных бусин.
      ПРЕДЕКТО: Радиоактивный материал опасен. Убедитесь в том, чтобы носить соответствующее защитное оборудование и следовать всем лабораторным рекомендациям для безопасного использования и удаления радиоактивных материалов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замените радиомаркированный UTP 15 ММ UTP, когда радиомаркированная РНК не требуется, например, для западных экспериментов по блот.
    2. Инкубировать реакцию в течение 10 минут, чтобы синтез радиомаркировки 23mers.
    3. Добавьте 1,5 зл раствора, содержащего 100 ММ АТП и 100 мкм UTP смесь 3,5 л буфера погони, добавить в трубку, содержащую предварительно собранные удлинение комплексов, и инкубировать в течение 5 минут, чтобы преследовать все зарождающиеся стенограммы в 23mers.
    4. Поместите образец в магнитную стойку в течение 2 мин, удалите супернатант, вымойте один раз с 30 зл и буфером для мытья, чтобы удалить неинкорпорированные нуклеотиды, и повторно вновь в 30 зл мыть буфера.
    5. Либо добавить 94 л стоп-миксса с протеиназы K и гликогена(таблица 9) прекратить реакции или перейти к разделу 1.6 для создания удлинения комплексов с более длинными транскриптами или раздел 2 для выполнения укупорки анализы.
  6. (Необязательно) Прогулка Pol II, чтобы сделать 23, 25 и 29 нуклеотидных стенограмм
    1. Следуйте процедуре, описанной в шагах 1.2.1 до 1.5.4 для подготовки удлиненных комплексов, содержащих радиомаркировку 23mers. Масштабируйте в 4 раза, чтобы создать 120 злителкомплексов вымытой удлинения, что достаточно комплексов для 4 реакций.
    2. Этикетка 3 новых труб "23mer", "25mer" и "29mer". Перенесите 30 зл и средств вымытой удлиненных комплексов в трубку «23mer» и добавьте 94 злилок стоп-миксса с протеиназой K и гликогеном.
    3. Поместите трубку, содержащую оставшиеся 90 юрлица промытых удлиненных комплексов, в магнитной стойке на 2 мин, удалите супернатант и отдохните шарики в 90 л БТБ, дополненные 1,2 мЛ каждый из 1,5 мМ АТФ и 1,5 мМ CTP. Инкубировать в течение 10 мин при 30 градусах По Цельсию.
    4. После мытья один раз с 90 qL буфера стирки и resuspending в 90 qL буфера мытья как описано в шаге 1.5.4, перенесите 30 qL комплексов удлинения к пробке «25mer» и добавлено 94 qL смешивания стопа с proteinase k и гликогеном.
    5. Поместите трубку, содержащую оставшиеся 60 юрлица комплексов в магнитной стойке в течение 2 минут, удалите супернатант, и resuspend шарики в 60 Л Л БТБ дополняется 0,8 мл каждый из 1,5 мм АТФ и 1,5 мм CTP.
    6. Инкубировать в течение 10 минут при 30 градусах Цельсия, мыть один раз с 60 qL буфера мытья, как в разделе 1.5.5, и resuspend в 60 qL буфера мытья.
    7. Перенесите 30 qL из 2x образца в трубку "29mer" и либо добавьте 94 л стоп-микса с протеиназой K и гликогеном, либо перейдите в раздел 2 для выполнения анализов укупорки.
    8. Приступай к очищению и анализу РНК (раздел 3).

2. Использование искусственных комплексов удлинения, чтобы ассировать cotranscriptional Capping

  1. Создание промытых удлиненных комплексов, содержащих 23mers путем масштабирования процедуры, описанной в шагах 1.2.1 до 1.5.5 13-кратного раза. Этого достаточно для 12 реакций и 1 дополнительно.
  2. Фосфорилирование Pol II CTD
    1. Поместите трубку, содержащую промытые удлиненные комплексы, в магнитную стойку на 2 мин, удалите супернатант и отдохните шарики в 377 Л БТБ, дополненные 13 юл 1,5 мМ АТФ.
    2. Подготовьте две новые трубки, помеченные как ЗН и -H, соответственно. К трубке с надписью «H» добавляйте 3 qL из 300 нг/Л TFIIH, а к трубке с пометкой -H добавить 9 л 20 мМ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% глицерол, 100 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 0,5 мг/мл булбума из сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно используем TFIIH очищенный от печени крысы, но мы получили аналогичные результаты, используя 0,6 мкг/реакцию коммерчески доступных рекомбинантных Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK, который является модулем киназы от TFIIH). Смотрите таблицу материалов для получения информации.
    3. Добавьте 87 qL промытых удлиненных комплексов от шага 2.2.1 к трубке помеченной «H» и 270 зл промываемых удлиненных комплексов к трубке с надписью -H. Инкубировать 10 мин при 30 градусах Цельсия.
    4. Поместите образец в магнитную стойку на 2 мин. Чтобы удалить избыток нуклеотидов и несвязанного белка, промойте удлинение комплексов в реакциях ЗН и -H с 90 qL или 270 зл буфера мытья, соответственно.
  3. РНК-кеппирование
    1. Resuspend удлиненные комплексы в трубке помечены ЗН в 87 л укупорки смеси (BTB дополнен50 ММ GTP (Таблица 10). Resuspend удлиненные комплексы в трубке с пометкой -H в 261 Зл укупорки смеси.
    2. Подготовьте 4 новые трубки с надписью 5 ng CE,H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Разбавлять фермент (CE) в 20 мМ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% глицерол, 100 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 0,5 мг/мл бычьего сывороточных альбумина для приготовления растворов, содержащих 5 ng CE/l, 15 нг CE/l, или 45 нг CE/l и дозированный 4-й раствор.
    3. Подготовьте 12 новых трубок с добавлением 94 qL стоп-буфера (2.1.1).
    4. Начните каждую укупорковую реакцию, добавив 87 зЛ удлинение комплекса, обработанного TFIIH или не маркированных труб, содержащих фермент укупорки. Инкубировать при температуре 30 градусов в тепловом блоке.
    5. После 1, 2 или 4 мин, остановить реакции, передавая 30 qL каждой реакции смеси в трубки, содержащие 94 л стоп-буфера. Очистите и проанализируйте реакционные продукты, описанные в разделе 3.

3. Очистка и анализ РНК

  1. Очистка РНК
    1. Инкубировать реакционные продукты в стоп-буфере в течение 20 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приостановка точки. Образцы в этом буфере были сохранены на срок до 4 ч без потери или деградации РНК.
    2. Экстракт один раз с 124 л фенола: хлороформ: изоамил алкоголя (25:24:1) и один раз с хлороформом: изоамил алкоголя (24:1).
      ПРЕДЕКТО: Фенол чрезвычайно токсичен и быстро усваивается кожей. Носите соответствующее защитное оборудование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для максимального восстановления РНК во время извлечения используйте коммерчески доступные трубки, содержащие гель высокой плотности, который образует стабильный барьер между водной и органической фазами. Смотрите Обсуждение и таблицу материалов.
    3. Перенос визуальной фазы (верхний слой) в новые трубки, содержащие 12,4 л 3 М ацетата натрия pH 5.2.
  2. Этанол выпадает
    1. Добавьте 350 л 100% этанола и тщательно перемешайте путем инверсии.
    2. Инкубировать не менее 10 мин на сухом льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приостановка точки. Для удобства можно остановиться здесь и завершить процедуру на следующий день; однако, можно приступить непосредственно к шагу 3.3 и запустить гель в тот же день. РНК можно хранить при -80 градусов в течение нескольких дней до дальнейшей обработки, но не оставлять на более длительные сроки.
  3. Подготовка образцов РНК для геля электрофореза
    1. Разрешить образцы для оттепели, смешать путем инвертирования 2-3 раза, и центрифуга в течение 15 минут при 21000 х г, 4 КК, в столешной центрифуге. Между тем, создать денатурный гель микс (раздел 3.4.1).
    2. Тщательно удалите этанол из образцов, не нарушая гранулы.
    3. Добавить 500 л 70% этанола, инвертировать трубку пару раз, чтобы мыть гранулы, а затем центрифуга снова на 21000 х г в течение 5 минут при комнатной температуре или 4 градуса по Цельсию.
    4. Удалите как можно больше этанола, как это возможно и сделать быстрый спин (5-10 s) из труб в центрифуге столешницы. Затем, с гель-загрузки наконечник, удалить последний оставшийся объем этанола.
    5. Воздушно-сухие гранулы в течение 3 мин при комнатной температуре.
    6. Растворите РНК, добавив 4 Зл из H2O в верхней части каждой гранулы. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
    7. Добавьте 4 qL 2x красителя РНК (см. таблицуматериалов) к смешиванию, а затем вихрь каждой трубки в течение нескольких секунд, чтобы полностью восстановить РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: РНК краситель, который содержит формамид вместо мочевины рекомендуется, так как последний осаждает при низких температурах.
    8. Быстро спина труб, а затем инкубировать их при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 10 минут в теплоблоке.
    9. Храните трубки на сухом льду до готовности к загрузке на гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ:       Сохранение РНК на сухом льду позволяет гибко работать над другими экспериментами, в то время как гель полимеризуется. Образцы не нужно разогревать после оттаивания. Тем не менее, РНК может быть непосредственно загружена после нагрева, если гель готов к запуску.
  4. Приготовление геля Urea-PAGE
    1. Для смеси геля 40 мл смешайте в конической трубке 50 мл: 16,7 г мочевины, 15 мл 40% бис:акриламидного раствора (19:1 соотношение), 4 мл 10-x TBE (1 M Tris-HCl, 1 М натриевого бората, 20 мм EDTA) и 8 мл H2O. Этот объем достаточен для одного стандартного размера геля (18 см высотой х 16 см в ширину) с 1,0 мм прокладки.
      ПРЕДЕКТО: Акриламид чрезвычайно токсичен. Хотя нет риска ингаляции, когда он находится в растворе, всегда носить лабораторное пальто, перчатки и защитные очки во время обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта смесь предназначена для литья денатурного 15% полиакриламидного геля, который легко разрешает РНК между 15-50 nt. Изменение концентрации бис / акриламид по мере необходимости для решения различных РНК стенограммы различной длины.
    2. Поместите закрытую трубку, содержащую гель смесь на nutator до полного растворения мочевины.
    3. Настроили гель-кастинг со стеклянными пластинами, 1 мм прокладками и 15-колодец.
    4. Работая быстро, добавить 40 л TEMED и 400 л 10% раствора персульфата аммония к раствору геля и хорошо перемешать. Используя трубку 25 мл, залить раствор геля между пластинами, вставить гребень, и позволяют гель полимеризации, по крайней мере 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если гель наливают более чем на 2 ч перед использованием, как только он полимеризованных покрыть его влажным бумажным полотенцем (оставляя гребень на месте) и оберните полиэтиленовой пленкой, чтобы предотвратить его от высыхания.
  5. Денатурирующий гель РНК электрофорез
    1. После полимеризации, передача геля в работающий бак и предварительно запустить его на 20 мА в 1x TBE в течение 15-30 мин.
    2. Между тем, оттепель образцов (если замороженные), вихрь, и спина их в течение 4 мин при 2000 х г, 4 кв. C.
    3. Когда готовы, выключите блок питания, и тщательно промыть каждый колодец с 1x TBE с помощью шприца.
    4. Используйте гель-загрузки советы для загрузки образцов на гель.
    5. Запуск геля при постоянном 20-30 мА около 2 ч или до нижнего красителя (ксилен цианол FF) достигает нижней части геля.
  6. Снимите гель, поместите его на кусок абсорбциентной бумаги и заверните полиэтиленовой пленкой.
  7. Вывешивать радиомаркированный гель на фосфорэкран.
  8. Сканирование фосфорного экрана с помощью фосфораигаисера и анализ изображения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Цифры 2 и 3 показывают репрезентативные реакции результатов, используемые для генерации комплексов искусственного удлинения, содержащих транскрипты различной длины путем расширения или Pol II из различных источников. На рисунке 4 показано, как эти удлинение комплексы могут быть использованы для проверки котранскрипционного CTD фосфорилирования-зависимой РНК укупорки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Исследования, которые стремятся вскрыть события в сочетании с комплексом удлинения Pol II, таким как обработка РНК и регулирование самой удлинения стенограммы, могут быть значительно облегчены с помощью высокоочищенной ферментной системы. Настройка таких ферментных систем может быть сложной задачей. Промоутер-зависимая транскрипция Пол II требует по крайней мере пяти общих факторов транскрипции. Подготовка и накопление этих факторов может занять месяцы; следовательно, меромером в этом процессе часто является просто подго...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим С. Шумана за предоставление фермента укупорки млекопитающих кДНК. Эта работа была частично поддержана грантом Института медицинских исследований Stowers от Фонда медицинских исследований Хелен Нельсон в Большом Канзас-Сити.  Исходные данные, лежащие в основе этой рукописи, можно получить из хранилища исходных данных Stowers в http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
[α-32P] UTP (3000 Ки/ммоль), 1 мКиPerkin ElmerNEG007H001MCДля радиоактивного мечения РНК
2x РНК загружающим красителемNew England BiolabsB0363SНастоятельно рекомендуется. Для получения РНК при загрузке гелем
40% Bis:Акриламид растворBiorad1610144
Бычья сыворотка Альбумин (20 мг/мл)New England BiolabsB9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (комплекс CAK) Белок, активный, 10 & микро; gMillipore Sigma14-476Используется для фосфорилирования
олигонуклеотидовIDTСмотрите Таблицу 8 для спецификаций чистоты
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies Invitrogen65001Мы также без проблем использовали Dynabeads M-280 стрептавидин, но предпочитаем гранулы MyOne Streptavidin, потому что они медленнее оседают
GlycoBlue Coprecipitant (15  мг/мл)Life Technologies InvitrogenAM9516Настоятельно рекомендуется. Красители гранулы нуклеиновой кислоты синий делают реакции намного проще в обращении
Hoefer SE600 стандартная система вертикального электрофореза с двойным охлаждением с прокладками 1 мм и 15 лункамигребня HoeferSE600-15-1.5
MaXtract пробирки высокой плотности (1,5 мл)Qiagen129046настоятельно рекомендуется. Содержит гель высокой плотности, который образует устойчивый барьер между водной и органической фазами; улучшает выход РНК при экстракции раствора
протеиназы К (20  мг/мл)Life Technologies Invitrogen25530049
РНК-олигонуклеотидыTrilinkПодробнее см. Таблицу 8
Дрожжевая неорганическая пирофосфатаза (100 ед./мл)New England BiolabsNEBM2403SТребуется только во время реакций каппинга
Pol II CTD ДНК

Ссылки

  1. Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
  2. Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
  3. Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
  4. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
  5. Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392(2018).
  6. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
  7. Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
  8. Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
  9. Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
  10. Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
  11. Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
  12. Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
  13. Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
  14. Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
  15. Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
  16. Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
  17. Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
  18. Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
  19. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

TFIIH
Искусственные РНК-полимераза II Удлинение Комплексы для вскрытия co-транскрипционной РНК обработки событий
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.