Здесь мы представляем метод для ex естественных условиях культуры длинных мышиных кости на обоих фетальных и новорожденных этапах, подходит для анализа костей и хрящей развития и гомеостаза в контролируемых условиях, в то время как переповторение в процессе естественных условиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Культивирование и измерение фетального и новорожденного Мурина длинные кости
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Длинные кости являются сложными и динамичными структурами, которые возникают из окостенения эндохондрал через хрящ промежуточные. Ограниченный доступ к здоровым человеческим костям делает особенно ценным использование моделей млекопитающих, таких как мышь и крыса, чтобы рассмотреть различные аспекты роста костей и гомеостаза. Дополнительно, развитие изощренных генетических инструментов в мышах позволяет более сложные изучения длиннего роста косточки и требует расширения методов используемых для того чтобы изучить рост косточки. Здесь мы представляем подробный протокол для экс естественных мышиных костной культуры, которая позволяет изучать кости и хряща в жестко контролируемой манере в то время как резюме большинство в процессе естественных условиях. Описанный метод позволяет культуру ряда костей, в том числе голени, бедра, и плюсневых костей, но мы сосредоточились в основном на большеберцовой культуры здесь. Кроме того, он может быть использован в комбинации с другими методами, такими как Замедленная съемка или медикаментозное лечение.
Введение
Рост органа должен быть плотно настроен, чтобы предотвратить возникновение расстройств роста, и включает регулирование нескольких типов клеток, молекулярных путей и перекрестных помех между различными частями тела. Методы визуализации имеют важное значение для решения изменений, происходящих с течением времени в растущий эмбрион, как в нормальных условиях, а также после того, как возмущение индуцируется в системе. Эмбрионы с внутриутробного развития, таких, как широко используемых моделей грызунов, представляют собой дополнительную проблему для живой визуализации и медикаментозного лечения, которые могут быть частично преодолены с помощью ex естественных методов культуры. Для успешного резюмировать в естественных условиях процессов и получить значимые результаты, становится решающим, чтобы найти правильные условия культивирования для каждого органа или ткани.
Большинство костей скелета млекопитающих расти через эндохондрал окостенение, где эмбрионального хряща (состоит из клеток, называемых хондроцитов) диски продольного роста и постепенно заменяется костью. Этот процесс происходит на пластин роста, расположенных в конце длинных костей, где можно выделить три зоны: отдых, пролиферативный, и гипертрофическая1,2. Во-первых, круглые хондроциты-предшественники в зоне отдыха переходят в велосипедную колумнарную хондроциты в пролиферативной зоне. Во время следующего этапа дифференциации, эти хондроциты становятся гипертрофических и начать секреции типа X коллагена. Гипертрофические хондроциты организуют последующие шаги окостенения: они выделяют ключевые сигнальные молекулы, такие как фактор роста соединительной ткани, костные морфгенетические белки и Индийский еж, и направляют минерализацию матрицы, вербуют кровеносные сосуды к центральной части кости, и, после апоптоза, позволяют остеобластов (костно-образующие клетки) вторгнуться в матрицу, чтобы сформировать первичный центр окостенения3,4. Минерализованная матрица облегчает проникновение кровеносных сосудов, через которые остеобласты мигрируют, чтобы заменить этот деградирующий хрящ матрицей5. Большинство остеобластов вторгнуться хряща матрицы из перичондриум, волокнистый слой, который обертывания хряща6. Кроме того, доля гипертрофических хондроцитов способны выживать и трансдифференцироваться в остеобласты7,8,9. Окончательная длина кости обусловлена накопленным ростом переходного хряща, темп роста которого в свою очередь зависит от количества и размера гипертрофических хондроцитов, а их матричной продукции10. Кроме того, недавно было показано, что продолжительность последней фазы гипертрофии коррелирует с окончательной длины кости11. Поэтому для обеспечения правильного размера кости требуется жесткая регуляция распространения и дифференциации этих клеток.
Несмотря на существенные знания, полученные за годы работы по организации и развитию плит роста, большинство этих выводов основано на наблюдении за фиксированными гистологическими секциями. Секционирование тканей предоставляет ценную информацию об этом процессе, но может использоваться с техническими артефактами, поэтому он не может быть всегда надежно использован для оценки морфологических или изменения размера между различными этапами. Кроме того, как рост костей является динамичным процессом, статические двумерные (2D) изображения предлагают ограниченное понимание движения клеток в пластины роста, в то время как покадровой визуализации на живой ткани может предложить ценную информацию о поведении хондроциты в пластины роста.
Все эти ограничения могут быть потенциально решены с использованием бывших естественных культур костей. В то время как костная культура протоколы были разработаны некоторое время назад, они были безгранично применительно к мышиных длинных костей. Большинство исследований использования куриных костей из-за технических преимуществ, предлагаемых цыпленок модель12,13. Органотипных культур (воздух/жидкость интерфейс) были применены к куриных эмбриональных бедренные кости, которые были сохранены в культуре в течение 10 дней14. Сложные генетические инструменты, доступные в мыши делают эту модель очень привлекательной для использования в бывших естественных костной культуры. Исследования, которые использовали мышей, чтобы заглянуть в рост костей работал в основном с плюсневой кости15, вероятно, из-за их небольшого размера и больших чисел, полученных на эмбрион16. Хотя традиционно считается длинные кости, плюмси введите старение (характеризуется сокращение распространения и инволюции роста пластины17) раньше, чем другие длинные кости в естественных условиях, и, следовательно, их непрерывный рост ex естественных условиях не действительно резюмировать в процессе естественных условиях. Для целей этой статьи, мы будем использовать термин длинные кости для костей из проксимальных и промежуточных областей конечностей. Несколько предыдущих исследований использовали длинные Мурины кости, такие как голени, в ex естественных условиях культуры и наблюдается существенный рост хряща, но мало окостенение18. В последнее время мы также использовали тиберетик культуры, в основном для изучения хондроцитов динамики19. Другие исследования использовали бедренные головки от молодых мышей20 или только дистальной части бедренной кости для культуры21. Некоторые более поздние работы успешно сочетать ex в естественных условиях культуры полных костей с покадровой визуализации для приобретения трехмерных (3D) фильмы хондроцитов в живых мышь ткани22,23. Авторы сумели наблюдать ранее незамеченные события в перестановке хондроцитов к пролиферативной зоне23 в хорошем примере потенциального применения костной культуры ex естественных условиях. Альтернатива, т.е. анализ статических изображений, требует косвенных и сложных приемов. Примером тому служит недавнее исследование, оценивающий важность трансверсально-ориентированных клонов для роста хрящей, где генетическая трассировка с многоразнос-репортерным штаммами мыши в сочетании с математическим моделированием использовалась24. Таким образом, ex естественных условиях культуры может помочь получить представление о динамических процессов в быстрее и более простой способ.
Здесь, мы представляем метод для мышиных длинных костей культуры, которые могут быть объединены с различными молекулярными процедурами и/или с покадровой живой визуализации. Этот протокол адаптирует методы, используемые в предыдущих докладах15,18,25, но рассматриваются некоторые дополнительные вопросы и фокусируется на длинных костей, таких как большеберцовой кости, а не плюсневых костей. Наконец, он исследует потенциал использования статистически мощных спаренных сравнений по выращиванию левой и правой костей отдельно в присутствии различных веществ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты должны проводиться по итогам местных правительственных и институциональных руководящих принципов этического обращения с лабораторными животными.
1. Подготовка к дню костяной культуры
- Настройка приурочена мышь вязки для получения плодов и щенков от эмбрионального день 14,5 (е в. р.) и далее.
Примечание: Культура длинных костей может быть успешно применена к различным штаммам мыши; в настоящем протоколе используются перевоспитанные швейцарские мыши дикого типа. - Подготовьте средство рассечения (адаптированное из Хьюстонского et al.15): разбавленный минимальный необходимый носитель (а-мем) или модифицированный игл Дульбекко (ДМЭМ) 1/13 в фосфат-буферном растворе (PBS) и 2 мг/мл сывороточного альбумина (БСА) и стерилизовать фильтр через 0,22 мкм, диаметр шприца 33 мм фильтра. Хранение аликвотс при температуре-20 °C.
- За день до извлечения плодов, подготовьте сыворотки свободной костной культуры среды, состоящей из ДМЭМ содержащие 0,2% БСА, 0,5 mM L-глютамин, 40 U/mL пенициллин/стрептомицин, 0,05 мг/мл аскорбиновой кислоты, и 1 мм бетаглицерофосфат. Фильтр стерилизовать через 0,22 мкм, 33 мм диаметром шприца фильтр и хранить при температуре 4 ° c до 1 месяца.
- В день культуры и до забой мыши, подготовить 24-хорошо пластин и 60 mm блюда с рассечение среды и держать их ледяной. Подогрев костной культуры среды в 37 °C водяной бане. Спрей 80% (v/v) этанол на инструменты (пинцет и маленькие ножницы), которые будут использоваться для обработки плода. Передача бинокулярного объема в кабинет биобезопасности класса II.
2. Культура плода и новорожденного голени и бедра
- Отбирать беременную мышь через вывиха шейки матки на желаемом гестационном этапе (от E 18.5 до E). Если новорожденные щенки используются, удалить их из матери один за другим и отбирать обезглавливанием.
- Положите мышь на спину и стерилизовать брюшной области путем распыления 80% (v/v) этанола на его поверхности.
- Вырезать кожу и брюшную мышцу с маленькими ножницами для доступа к маточных рогов.
- Экстракт матки из брюшной полости с помощью пинцета и маленьких ножниц, удаление мезометриум и резки основание рога. Поместите матку в 60 мм чашку Петри с ледяным рассечение среды и сохранить культуру блюдо на льду в течение всей процедуры.
- Перенесите чашку Петри с маткой в кабинет биобезопасности и работайте там с этого момента.
- Отдельные отдельные плоды с ножницами, разрезая между мешочками.
- Передача индивидуального мешка под стереомикроскопов в чистом 60 mm блюдо с рассечение среды и открыть их с помощью пинцета, чтобы отделить плодов от плаценты и очистить их от мембран.
Примечание: Работайте с одним эмбрионом одновременно, сохраняя при этом остальные на льду. - Обезглавить плод и перенести тело в чистое новое 60 mm блюдо с 1 мл вырезать стерильные пипетки.
- Снимите кожу плодов или детенышей с помощью пинцета, начиная со спины и очищая ее до пальцев ног.
- Отделить задние конечности от тела путем разрезания пинцетом близко к позвоночнику и передачи их в чистое блюдо с ледяно-холодным рассечение среды.
- Отделить большеберцовой кости от бедра с помощью пинцета, тщательно представляя их между поверхностным хрящ дистальной бедра и проксимальной голени.
- Удалите кости бедра из проксимальных бедренных костей и кости Калины и фибула из голени.
- Аккуратно удалите мягкие ткани из бедра и голени колючий и потянув его.
Примечание: Важно, чтобы удалить как можно больше мягких тканей, как это возможно, с особой осторожностью в удалении ткани, которая соединяет два хряща полюсов, но избегая повреждения хряща, перичондриум и костей. - Поместите четыре кости (левый и правый Титас и бедра) в первой скважины 24-хорошо пластины с пластиковой 1 мл стерильной пипеткой. Кроме того, чтобы сравнить эффект различных методов лечения на левой и правой конечностей, поместите контралатеральными конечностей в различных скважин.
Примечание: Особенно следует позаботиться о том, чтобы кости были переданы скважинам, так как они могут легко прилипать к пипетке. - Следуйте таким же образом с таким количеством плодов, сколько необходимо.
Примечание: Изменение блюдо с рассечение среды, как только он становится слишком омрачены, как это важно, чтобы ясно видеть расчлененные кости. -
Когда все нужные кости переносятся в скважины, удалите средство рассечения с пластиковой 1 мл стерильной пипетки и принимать дополнительные уход не аспирин кости.
- В зависимости от цели эксперимента, фотографии могут быть взяты из костей перед удалением среды рассечения, как точка ноль эксперимента. Сфотографирую Микроскоп, прикрепленный к цифровой камере, и аннотировать экспозицию и масштаб, используемый. Чтобы обеспечить легкие и надежные измерения, делайте снимки с хорошим контрастом, чтобы отличить минерализованную часть.
- Добавить 1 мл культуры среды для каждого хорошо. Если какое-либо лечение предназначено для костей (Доксициклин, тамоксифен, факторы роста и т.д.), он должен быть добавлен сейчас.
- Для наблюдения за эффектом ингибирования роста в условиях культуры, лечить левый Тикос с ретиноевой кислоты (RA, 500 Нм), в то время инкубации право Титас с эквивалентным объемом транспортного средства (диметилсульфоксид [ДРСО], окончательная концентрация 0,1%) в качестве элемента управления.
- Оставьте кости расти в течение двух дней или более в инкубаторе культуры клеток при стандартных условиях культуры клеток (при температуре 37 ° c в 5% CO2 инкубатор).
- Для оценки распространения добавьте 5-этниль-2'-дезоксиуридин (Эду) или 5-бромо-2'-деоксиуридин (BrdU) в среду при окончательной концентрации 10 мкм 1 − 2 ч до фиксации.
Примечание: Концентрация на складе в Эду составляет 20 мм.
Осторожно: Эду и BrdU являются аналогами тимидина и могут быть токсичными и мутагенными. - Оттепель 4% параформальдегид (ФА) и исправить кости путем погружения в фа в отдельных 2 мл труб.
Осторожно: Фа токсична и обозначена как возможный человеческий канцероген. Избегайте дыхания параформальдегида порошок и паров. Эду и BrdU являются аналогами тимидина и могут быть токсичными и мутагенными. - После краткого 10-минутный фиксации в фа при комнатной температуре, передача кости в PBS для приобретения изображения на конечной момент времени. Затем поместите кости обратно в для ночного крепления на 4 ° c.
- После фиксации кости могут быть обработаны для желаемых нисходящих приложений.
3. измерение и анализ полной длины кости и минерализованной области
- Использование программного обеспечения для редактирования изображений для измерения длины костей, с учетом масштаба изображения. Измерение как общая длина кости и минерализованной области. Начало измерений из первых темных клеток на одном конце до последних на другом конце.
Примечание: Минерализованная область характеризуется более темным цветом и легко выделяется из хряща. - Для расчета темпов роста, определяемых как среднее увеличение длины в день, разделите разницу между конечной длиной кости и начальной по количеству дней в культуре.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Костная культура может быть выполнена с разных стадий. На рисунке 1A-Dпоказано сравнение между культивированных большеберцовой костью и только что извлеченной из них на эквивалентных этапах. Первое замечание заключается в том, что до двух дней культуры, достигнутый размер сравнима с в естественных условиях роста костной ткани для хрящевой и минерализованной кости (рис. 1A, B, D). Более длительные...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Кость ex естественных условиях культуры методы были использованы в течение некоторого времени для оценки биологии роста костей28, но редко применяется для мышиных длинных костей. С развитием методов визуализации, экс естественных костной культуры предлагает привлекательный способ исследования роста костей в режиме реального времени в условиях, тесно напоминающие в условиях естественных условий. В этом сценарии важно определить условия, в которых рост длинных костей сопоставим с их ростом в естеств...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Александра Джойнер за ее поддержку, когда этот протокол был установлен, edwina МакГлинн и Yi-Ченг Чанг для обмена ретиноевой кислоты. Австралийский институт регенеративной медицины поддерживается грантами правительства штата Виктория и австралийского правительства.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 5-этинил-2'-дезоксиуридин | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-бромо-2′-дезоксиуридин | Sigma | B5002 | |
| 50 мл конические центрифужные пробирки | Falcon | 352070 | |
| 60 мм TC-обработанный центральный колодец для культивирования органов, 20 / упаковка, 500 / случай, стерильный | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Adobe | CS4 | |
| Аскорбиновая кислота | Sigma | A92902 | |
| Базовая единица для прицела | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Бетаглицерофосфат | Sigma | G9422 | |
| Бинокулярный прицел | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Бычья сыворотка Альбумин (БСА) фракция v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 фотоаппарат | Набор для | ||
| Cumper Robbins | PFS00034 | ||
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 мл пробирки | Eppendorf | 0030120094 | |
| этанол 96% | Merk | 159010 | |
| щипцы Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 | инкубатор Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 лунки | Falcon | 353047 | |
| Параформальдегид | Sigma | 158127 | |
| пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл) | Gibco | 15140-122 | |
| Пластиковые пипетки 1 мл Стерильные Индивидуально упакованные | Thermo | 273 | |
| Шприц фильтр 0,2 мкм | Медико-биологические науки | PN4612 | |
| Шприц Terumo 20 мл | Terumo | DVR-5174 | |
| Третиноин (ретиноевая кислота) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Тринокулярный прицел | Aunet | AZS400T |
Ссылки
- Long, F., Ornitz, D. M. Development of the endochondral skeleton. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334(2013).
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
- Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. The control of chondrogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification. The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Zhou, X., et al. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genetics. 10 (12), e1004820(2014).
- Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).
- Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora. PloS One. 10 (4), e0121653(2015).
- Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).
- Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies. Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).
- Lui, J. C., et al. Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions. PLoS Biology. 16 (7), e2005263(2018).
- Agoston, H., et al. C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways. BMC Developmental Biology. 7, 18(2007).
- Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice. PLoS Biology. 16 (6), e2005086(2018).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEy Reports. 5, 818(2016).
- Okubo, N., et al. Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates. PloS One. 8 (11), e78306(2013).
- Hirota, K., et al. Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system. Scientific Reports. 8 (1), 10332(2018).
- Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage. Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Alvarez, J., et al. TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression. Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).
- De Luca, F., et al. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).
- Stern, T., et al. Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance. PLoS Biology. 13 (8), e1002212(2015).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium. Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).
- Erben, R. G. Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Springer. 99-117 (2003).
- Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).
- Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains. Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).
- Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
