Здесь мы представляем метод для ex естественных условиях культуры длинных мышиных кости на обоих фетальных и новорожденных этапах, подходит для анализа костей и хрящей развития и гомеостаза в контролируемых условиях, в то время как переповторение в процессе естественных условиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Культивирование и измерение фетального и новорожденного Мурина длинные кости
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Длинные кости являются сложными и динамичными структурами, которые возникают из окостенения эндохондрал через хрящ промежуточные. Ограниченный доступ к здоровым человеческим костям делает особенно ценным использование моделей млекопитающих, таких как мышь и крыса, чтобы рассмотреть различные аспекты роста костей и гомеостаза. Дополнительно, развитие изощренных генетических инструментов в мышах позволяет более сложные изучения длиннего роста косточки и требует расширения методов используемых для того чтобы изучить рост косточки. Здесь мы представляем подробный протокол для экс естественных мышиных костной культуры, которая позволяет изучать кости и хряща в жестко контролируемой манере в то время как резюме большинство в процессе естественных условиях. Описанный метод позволяет культуру ряда костей, в том числе голени, бедра, и плюсневых костей, но мы сосредоточились в основном на большеберцовой культуры здесь. Кроме того, он может быть использован в комбинации с другими методами, такими как Замедленная съемка или медикаментозное лечение.
Введение
Рост органа должен быть плотно настроен, чтобы предотвратить возникновение расстройств роста, и включает регулирование нескольких типов клеток, молекулярных путей и перекрестных помех между различными частями тела. Методы визуализации имеют важное значение для решения изменений, происходящих с течением времени в растущий эмбрион, как в нормальных условиях, а также после того, как возмущение индуцируется в системе. Эмбрионы с внутриутробного развития, таких, как широко используемых моделей грызунов, представляют собой дополнительную проблему для живой визуализации и медикаментозного лечения, которые могут быть частично преодолены с помощью ex естественных методов культ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты должны проводиться по итогам местных правительственных и институциональных руководящих принципов этического обращения с лабораторными животными.
1. Подготовка к дню костяной культуры
- Настройка приурочена мышь вязки для получения плодов и щенков от эмбрионального день 14,5 (е в. р.) и далее.
Примечание: Культура длинных костей может быть успешно применена к различным штаммам мыши; в настоящем протоколе используются перевоспитанные швейцарские мыши дикого типа. - Подготовьте средство рассечения (адаптированное из Хьюстонского et al.15): разбавленный минимальный нео....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Костная культура может быть выполнена с разных стадий. На рисунке 1A-Dпоказано сравнение между культивированных большеберцовой костью и только что извлеченной из них на эквивалентных этапах. Первое замечание заключается в том, что до двух дней культуры, достигнутый размер сравнима с в естественных условиях роста костной ткани для хрящевой и минерализованной кости (рис. 1A, B, D). Более длительные.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Кость ex естественных условиях культуры методы были использованы в течение некоторого времени для оценки биологии роста костей28, но редко применяется для мышиных длинных костей. С развитием методов визуализации, экс естественных костной культуры предлагает привлекательный способ исследования роста костей в режиме реального времени в условиях, тесно напоминающие в условиях естественных условий. В этом сценарии важно определить условия, в которых рост длинных костей сопоставим с их ростом в естеств.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Александра Джойнер за ее поддержку, когда этот протокол был установлен, edwina МакГлинн и Yi-Ченг Чанг для обмена ретиноевой кислоты. Австралийский институт регенеративной медицины поддерживается грантами правительства штата Виктория и австралийского правительства.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 5-этинил-2'-дезоксиуридин | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-бромо-2′-дезоксиуридин | Sigma | B5002 | |
| 50 мл конические центрифужные пробирки | Falcon | 352070 | |
| 60 мм TC-обработанный центральный колодец для культивирования органов, 20 / упаковка, 500 / случай, стерильный | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Adobe | CS4 | |
| Аскорбиновая кислота | Sigma | A92902 | |
| Базовая единица для прицела | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Бетаглицерофосфат | Sigma | G9422 | |
| Бинокулярный прицел | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Бычья сыворотка Альбумин (БСА) фракция v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 фотоаппарат | Набор для | ||
| Cumper Robbins | PFS00034 | ||
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 мл пробирки | Eppendorf | 0030120094 | |
| этанол 96% | Merk | 159010 | |
| щипцы Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 | инкубатор Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 лунки | Falcon | 353047 | |
| Параформальдегид | Sigma | 158127 | |
| пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл) | Gibco | 15140-122 | |
| Пластиковые пипетки 1 мл Стерильные Индивидуально упакованные | Thermo | 273 | |
| Шприц фильтр 0,2 мкм | Медико-биологические науки | PN4612 | |
| Шприц Terumo 20 мл | Terumo | DVR-5174 | |
| Третиноин (ретиноевая кислота) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Тринокулярный прицел | Aunet | AZS400T |
Ссылки
- Long, F., Ornitz, D. M. Development of the endochondral skeleton. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334(2013).
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochon....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
