Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Исследование токсичности наночастиц оксида цинка в клеточной культуре и в Drosophila melanogaster

10.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59510

⸱

19 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем подробный протокол для оценки токсикологических профилей наночастиц оксида цинка (NO NPs), в частности, тип клеточной смерти в человеческих фибробластах легких MRC5 и образование ROS в плодовой мухе Drosophila.

Аннотация

Наночастицы оксида цинка (NO NPs) имеют широкий спектр применений, но количество сообщений о токсичности, связанной с NP-ассоциированной деятельностью, в последние годы быстро растет. Тем не менее, исследования, которые разъясняют основные механизмы для NO NP-индуцированной токсичности скудны. Мы определили профили токсичности NP с использованием как in vitro, так и in vivo экспериментальных моделей. Значительное снижение жизнеспособности клеток наблюдалось в фибробластах легких MRC5, показывающих, что НП Зно оказывают цитотоксическое действие. Аналогичным образом, интересно, кишечник подвергается NO NPs выставлены резкое увеличение уровня реактивных видов кислорода (ROS) в плодовой мухи Drosophila. Необходимы более углубленные исследования для проведения оценки рисков для более широкого использования NP-нпо в н.п. потребителями.

Введение

Нанотехнология относится к применению наноразмерных материалов, которые используются во всех научных областях, включая медицину, материаловедение и биохимию. Например, NO NPs, которые известны своими ультрафиолетовыми рассеяниями, химическим зондированием и антимикробными свойствами, а также высокой электрической проводимостью, используются в производстве различных потребительских товаров, таких как пищевая упаковка, косметика, текстиль, каучуки, аккумуляторы, катализатор для обработки автомобильным хвостом газа, и биомедицинскихприложений,связанных с 1,2,3.

Вместе с тем растущее применение продуктов на основе НП «Нена», что приводит к увеличению воздействия на людей НП Зно, вызывает обеспокоенность по поводу их потенциального неблагоприятного воздействия на здоровье человека. Ряд исследований в пробирке показали, что Нп., зно-О НП, могут вызывать окислительный стресс, аутофагию, цитотоксичность, воспаление и генотоксичность4,5,6,7,8 . Примечательно, что токсичность NO NPs, как предполагается, вызвана растворением ионов n, чтобы освободить ионы n2, а также поверхностной реактивностью «nO», что приводит к клеточной ионной и метаболическим дисбалансам, которые связаны с нарушением ионного гомеостаза и ингибирование ионного транспорта4,7,9,10. Важно отметить, что исследования показали, что генерация реактивных видов кислорода (ROS) является одним из основных механизмов, лежащих в основе NO NPs-ассоциированной токсичности. Недостаточная антиоксидативная активность после оскорбления ROS была доказана, чтобы нести ответственность за вырастая цитотоксичность и повреждение ДНК9. Токсическое воздействие NO NPs также были зарегистрированы в животных моделях, в том числе грызунов1, зебрафиш11,12, а также беспозвоночных Drosophila13.

Дрозофила служит в качестве устоявшейся альтернативной модели животных для скрининга токсичности химических веществ и наноматериалов (НМ)14,15. Важно отметить, что существует высокий уровень генетического и физиологического сходства между человеком и дрозофилой, что оправдывает использование дрозофилы в качестве модели in vivo для оценки биологических реакций на экологические загрязнители, такие как НМ 16. Кроме того, Есть много преимуществ использования Drosophila из-за его небольшой размер, короткий срок службы, генетические удобства, и легкои и экономически эффективное обслуживание. Кроме того, Drosophila была широко принята для изучения генетики, молекулярной и биологии развития, с тех пор его полный геном был полностью секвенирован лет назад в 2000 году, что делает его пригодным для различных высокой пропускной скрининг и для решения нерешенных биологических вопросов17,18,19,20,21. В последние годы, ряд исследований, связанных с иммунотоксичностью с использованием различных типов NPs в Drosophila были зарегистрированы15,22,23,24. Это фундаментальное новое знание, полученное в ходе исследований с использованием дрозофилы, помогло дать больше информации о нашем понимании нанотоксикологии.

ROS является известным виновником цитотоксичности и генотоксичности, вызванных НП, в частности, на основе металла NPs25. ROS являются кислородосодержащими химическими видами с более высокими реактивными свойствами, чем молекулярный кислород. Свободные радикалы, такие как супероксид радикальных (O2-) и даже, нерадикальные молекулы, такие как перекись водорода (H2O2) может выступать в качестве ROS. При нормальном физиологическом состоянии, они необходимы для поддержания клеточного гомеостаза26, однако, чрезмерное ROS из-за перепроизводства или дисрегуляции антиоксидантной системы защиты может вызвать окислительный стресс, что приводит к повреждению белков, липиды и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК)27. Например, по мере повышения уровня ROS и снижения уровня глутатиона (ГСГ) одновременно происходит нарушение синтеза аденозинтрифосфата (АТФ), а уровень лактата дегидрогеназы (ЛПГ) повышается в среде, что приводит к гибели клеток27.

Здесь мы предоставляем протоколы для выполнения клеточного и генетического анализа с использованием культивированных клеток млекопитающих и дрозофилы для определения потенциальных побочных эффектов NO NPs. Обзор метода, используемого для исследования токсичности NPs, показан на рисунке 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Флуоресценция Активированная сортировка клеток (FACS) Анализ на жил /фиксированных клеток

  1. Sonicate NO NPs в подвеске на 15 мин.
  2. Подготовка NO NPs в различных концентрациях (например, 0, 10, 25, 50,100 и 200 мкг/мл) с использованием 1 мг/мл NP-акционерного раствора для лечения культивированных клеток.
  3. Семена MRC5 человеческих фибробластов легких (1 х 105 клеток / хорошо) на 6-хорошо культуры пластины в день вперед, а затем лечить клетки с 2 мл NO NPs (в трипликатов) для 8 ч, 16 ч и 24 ч.
  4. В каждый момент времени, собирать клетки центрифугирования на 300 х г в течение 5 мин.
  5. Вымойте клетки гранулы дважды с фосфатбуферным сольниковым раствором (PBS).
  6. Приостановите работу клеток с 1x связывающим буфером, который состоит из 0,1 M HEPES/гидроксида натрия (NaOH), 1,4 М хлорида натрия (NaCl) и хлорида кальция 25 мм (CaCl2),при концентрации 1 х105 клеток на 100 л.
  7. Добавьте 5 зЛ флуоресцеина изотоцианата (FITC) Annexin V пятно и 5 Зл пропидий йодида (PI) ДНК пятно, и инкубировать клетки в течение 15 минут при комнатной температуре (RT; 25 градусов по Цельсию) в темноте.
  8. Пополнить образцы с дополнительным400 зл и 1x связывающий буфер перед сортировкой клеток по потоку цитометрии. Для каждого образца анализируется как минимум 10 000 клеток.
  9. Табулировать диаграмму бара, используя полученную среднюю интенсивность.

2. Воздействие NPs Зно к Drosophila

  1. Добавьте 1 мл наночастиц в различных концентрациях во флаконы, а затем 9 мл муховой пищи, чтобы сделать окончательную концентрацию 0,1 мг/мл, 0,25 мг/мл или 0,5 мг/мл NP.
  2. Смешайте наночастицы с пищей тщательно во флаконах с помощью пипетки.
  3. Разрешить летать пищи, содержащей NO NPs для охлаждения, по крайней мере 2-3 ч перед использованием.
  4. Ввести взрослых мужчин и женщин мух во флаконы в течение 5 дней, и позволяют им спариваться и откладывать яйца (которые появляются как белые пятна) на поверхности пищи.
  5. Удалить родительских мух, и позволяют яйца претерпевают дальнейшее развитие, которое состоит из 4 различных стадий развития (эмбриональный, личинки, pupal и взрослой стадии).

3. Рассечение мухи

  1. Соберите конце3-й instar личинок со стенки флаконов для анализа. Свежеотложенные яйца обычно превращаются в поздние3-е личинки после 72-120 ч на RT.
  2. Очистите блюдо вскрытия и заполнить хорошо с вскрытием среднего / PBS.
  3. Вскрыть личинки (в конце3-й instar) под стереомикроскоп, используя пару щипкеток.
  4. Используйте кончик щипцы, чтобы сделать крошечное отверстие и разорвать кутикулу слой личинок. Тщательно вытащите кишечник и поместите его в микроцентрифугную трубку 1,5 мл, содержащую дрозофилу среды Шнайдера, до начала фиксации с использованием 1 мл 4% параформальдегида (ПФ).
  5. 3.5Fix кишки в ПФ в течение 10 минут на RT, для последующих экспериментов, таких как иммуностоирование.

4. Обнаружение РОС с использованием дигидроэтидия (DHE) окрашивания

  1. Лечить личинки с различными концентрациями NO NPs, как описано в шаге 2.1.
  2. После вскрытия кишечника от3-го instar личинок, как описано в разделе 3, инкубировать кишечник в Дрозофила среды Шнайдера на RT до окрашивания тканей выполняется. Растворите 1 кЛ красителя DHE (из концентрации запасов 30 мМ) в 1 мл среды Шнайдера, что делает окончательную рабочую концентрацию 10-30 мкм DHE красителя.
  3. Инкубировать кишечник в течение 5 минут на RT в темноте, а затем мыть три раза с помощью среды Шнайдера на каждые 5 минут.
  4. Исправьте кишечник с 4% PF (необязательный шаг) и смонтировать кишки на стеклянные слайды, с анти-fade монтажа среды, содержащей 4 ",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Захват изображений под конфокальный микроскоп.

5. Измерение флуоресценции с помощью программного обеспечения ImageJ

  1. Импортзахваченных флуоресценции изображения, приобретенные с помощью флуоресценции микроскопии или конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в программное обеспечение ImageJ.
  2. Нажмите на меню Анализ и выберите набор измерений.
  3. Выберите измерите вывода, например, интегрированную интенсивность области и среднее серое значение.
  4. Нажмите Мера.
  5. Выберите область без флуоресценции, чтобы установить фон.
  6. Экспортировать данные в электронную таблицу Excel и определять исправленную полную флуоресценцию клеток (CTCF), используя расчет, показанный ниже.
    CTCF - Интегрированная плотность - (Площадь выбранной ячейки X Средняя флуоресценция фоновых показаний)
  7. Постройте диаграмму и выполните статистический анализ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

NP-экспонированные клетки были обработаны с набором реагентов окрашиваемого клетки, последовано за сортировкой клетки используя цитометрию потока. Нек-обработанные клетки (нижняя, правая панель) демонстрируют более высокий процент ранних (R3)/ поздних апоптотических клеток (R6), чем контрольные клетки (R5, нижняя, левая панель). Некротические клетки смерти обозначается R4 (верхняя, правая панель) (Рисунок 2). Результаты FITC/Annexin V Assay по фибробластам, о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для того, чтобы оценить, если NO NP может вызвать апоптоз в фибробластах MRC5, мы используем цитометрию потока, чтобы отличить клетки от некротической или апоптотической смерти клеток. В нормальных живых клетках фосфатидилсерин (PS) локализован в клеточной мембране. При возникновении апоптоза ПС транссиба транссиба трансируется в внеклеточную листовку плазменной мембраны, что позволяет связывать сярприг Annexin V с флюоресценцией (FITC Annexin V)29. С другой стороны, красно-флуоресцентный пропидий...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Исследование было поддержано номером гранта R706-000-043-490. Исследование не отражает мнение спонсора гранта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15% метил4-гидроксибензоатSigma Aldrich
4% параформальдегидSigma AldrichP6148
Bacto AgarBD biosciences
cncCK6/TM3, Sbподарок от доктора Керпполы
T Кукурузная мука, глюкоза, дрожжи пивовараSigma Aldrich
CyAn ADP с Программное обеспечение SummitDAKOhttps://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Дигидроэтидий (гидроэтидин)Thermo Fisher ScientificD11347
FITC Аннексин V Набор для обнаружения апоптоза IBD бионауки556547
флуоресцентный микроскопOlympus
GlucolinСупермаркет
Программное обеспечение ImageJ NIH
MRC5 фибробласт легких человекаATCCCCL-171
Schneider' s Drosophila mediumThermo Fisher Scientific21720-024
Vectashield для защиты от выцветания с DAPIVector LaboratoriesH-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyONIG-FLY
Наночастицы оксида цинкаSigma Aldrich721077см. лист 2

Ссылки

  1. Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
  2. Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
  3. Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
  4. De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
  5. Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
  6. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
  7. Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
  8. Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
  9. Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
  10. Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
  11. Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
  12. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  13. Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
  14. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
  15. Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
  16. Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
  17. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  18. Jennings, B. H. Drosophila - a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  19. Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
  20. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
  21. Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
  22. Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
  23. Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
  24. Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
  25. Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
  26. Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
  27. Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
  28. Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
  29. Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
  30. Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , Chapter 1 (2011).
  31. Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
  32. Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
  33. Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Жизнеспособность клетокактивные формы кислородапроточная цитометрияфлуоресцентная микроскопияконфокальная микроскопияфибробласты легкого MRC5анализ кишечникаокрашивание аннексином V
Исследование токсичности наночастиц оксида цинка в клеточной культуре и в Drosophila melanogaster
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.