Методическая статья

Использование линейного ускорителя для проведения в пробирке радиобиологических экспериментов

DOI:

10.3791/59514

⸱

26 мая 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Cleveland Clinic, 2Department of Radiation Oncology, Cleveland Clinic

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клинические линейные ускорители могут быть использованы для определения биологического воздействия широкого спектра дозовых ставок на раковые клетки. Мы обсуждаем, как создать линейный ускоритель для клеточных анализов и анализов для раковых стволовых клеток, выращенных в качестве опухолевых сфер в подвеске и клеточных линиях, выращенных как адепткультуры.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лучевая терапия остается одним из краеугольных камней борьбы с раком. Для большинства видов рака, это наиболее эффективная, нехирургическая терапия debulk опухолей. Здесь мы описываем метод облучения раковых клеток линейным ускорителем. Развитие технологии линейного ускорителя повысило точность и эффективность лучевой терапии. Биологическое воздействие широкого спектра доз радиации и дозы по-прежнему является интенсивной областью исследования. Использование линейных ускорителей может облегчить эти исследования с использованием клинически значимых доз и дозы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Радиотерапия является эффективным лечением длямногих видов рака 1,2,3,4. Дополнительное облучение высокой дозы является относительно новым в лучевой терапии и стало возможным благодаря последним технологическим достижениям в линейных ускорителях5. Клинические преимущества дополнительной высокой дозы по сравнению со стандартной дозой облучения включают в себя сокращенное время лечения и улучшение опыта пациента. Линейные ускорители также обеспечивают клинические условия для клеточной культуры на основе радиационной биологии исследований. Биологические и терапевтические последствия дозы радиации и дозы были в центре внимания радиационных онкологов и биологов на протяжениидесятилетий6,7,8. Однако радиобиология облучения с высокой дозой и облучения вспышки - чрезвычайно высокая доза радиации - до сих пор не исследована.

Облучение гамма-лучей широко используетсяв клеточной культуре на основе радиационной биологии 9,10,11. Радиация достигается гамма-лучами, испускаемыми из разлагающихся радиоактивных источников изотопа, как правило, цезия-137. Использование радиоактивных источников строго регулируется и часто ограничено. С исходным облучением, это сложно проверить широкий спектр дозовых ставок, ограничивая его полезность в анализе биологических эффектов клинических достижимых ставок дозы12.

Там было несколько исследований, которые иллюстрируют как доза и скорость дозы эффекты12,13,14,15,16,17. В этих исследованиях использовались как гамма-облучение, генерируемое радиоактивными изотопами, так и рентгеновские лучи, полученные из линейных ускорителей. Были использованы различные клеточные линии, представляющие рак легких, рак шейки матки, глиобластому и меланому. Радиационное воздействие на выживаемость клеток, арест клеточного цикла, апоптоз и повреждение ДНК были оценены как считываний12,13,14,15,16,17 . Здесь мы описываем метод определения биологических эффектов клинически релевантной дозы и дозы, обеспечивая рентгеновское излучение с помощью линейного ускорителя. Эти исследования должны проводиться при тесном сотрудничестве между биологом, радиационным онкологом и медицинским физиком.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка клетки для культуры клетки подвески

  1. Культура глиомы стволовых клеток в стволовых клетках культуры стволовых клеток примерно 5 х 106 клеток/ 10 см пластин в инкубаторе культуры клеток с 5% CO2, 95% относительная влажность при 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние культуры клеток одинаково на протяжении всех процедур. Средства массовой информации, используемые в протоколе, являются полными носителями.
  2. За два дня до запланированного облучения соберите глиома, похожие на глиомы, из культурной пластины со стерильной пипеткой мощностью 5 мл в 15 мл центрифуги в капюшоне культуры.
  3. Центрифуги собранных клеток на 200 х г в течение 3 мин в столешницу центрифуги.
  4. Откажитесь от супернатанта и переварить клеточные гранулы (около 1 х 107 клеток) с 1 мл трипсин-EDTA при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы сделать одну суспензию клетки в трипсин-EDTA. Аккуратно встряхните дно центрифуги трубки каждые 2 минуты во время пищеварения, чтобы убедиться, что клетки перевариваются тщательно.
  5. Добавьте 3 мл носителей культуры стволовых клеток (см. таблицуматериалов), чтобы утолить трипсин. Центрифуга собранных клеток на 200 х г в течение 3 мин в столешницу верхней центрифуги. Откажитесь от супернатанта и сохраните клеточные гранулы.
  6. Resuspend клетки с 5 мл клеточной культуры средств массовой информации и рассчитывать клетки с гемоцитометром.
  7. Плита 5 х 106 клеток в двух 10 см пластин, содержащих 10 мл клеточной культуры средств массовой информации.
  8. Непосредственно перед запланированным облучением соберите клетки и отбросьте супернатант после центрифугирования, как описано в шаге 1.3. Повторно приостановить клеточной гранулы с 5 мл клеточной культуры средств массовой информации. Передача 1 мл клеточной подвески в 35-мм пластину, содержащую 2 мл носителей клеточной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем носителя составляет 3 мл в 35 мм пластины, чтобы сделать жидкость 1 см в высоту в пластине.
  9. Передача покрываемых клеток во вторичном контейнере, например, пластиковую или пенопластовую коробку, чтобы снизить риск заражения и довести клетки в контейнере к объекту облучения на тележке общего назначения.
  10. Излучать клетки, как описано в шаге 4.

2. Подготовка клетки для прикрепленной культуры клетки

  1. За день до облучения, в капюшоне клеточной культуры, удалите dMEM-носители из пластины клеточной культуры прикрепленной клеточной линии, такой как клетки HEK-293. Средства массовой информации могут быть всасывания с помощью пипетки Pasteur подключен к вакууму.
  2. Вымойте клетки с 5 мл стерильных PBS в культуре блюдо, чтобы смыть остаточные средства массовой информации.
  3. Пипетка 1 мл трипсина-EDTA в культуре блюдо и осторожно наклонить культуры пластины, чтобы убедиться, что все блюдо покрыто трипсин-EDTA.
  4. Трипсинизуйте клетки при комнатной температуре в течение 5 мин. Утоляют реакцию трипсина-ЭДТА 3 мл DMEM-носителей и собирайте клетки с пипеткой 5 мл в 15 мл центрифуги в культурном капюшоне.
  5. Центрифуга собранных клеток на 200 х г в течение 3 мин в столешницу верхней центрифуги. Откажитесь от супернатанта и сохраните клеточные гранулы.
  6. Resuspend клетки с 5 мл DMEM средств массовой информации и рассчитывать клетки с гемоцитометром.
  7. Плита 2 х 105 ячеек в 35 мм пластины с использованием 3 мл клеточной культуры средств массовой информации на высоту 1 см носителей.
  8. После 24 ч клеточной культуры в инкубаторе при 37 градусах Цельсия перенесите покрыные клетки во вторичном контейнере (т.е. в изолированную пенную коробку) в объект облучения на тележке для коммунальных услуг.
  9. Облученные клетки, как описано в шаге 4.

3. Препарат клеток для иммуноспоминки после облучения

  1. Оттепель коммерческой внеклеточной белковой матрицы на льду при 4 градусах Цельсия в одночасье. Предварительно йох 200 л пипетки советы и 1,5 мл центрифуги труб на 4 кв кв ночь.
  2. Аликвот внеклеточная белковая матрица с предварительно охлажденным наконечниками пипетки и 1,5 мл центрифуговых трубок по 200 л на трубку.
  3. Разбавить 200 л внеклеточной белковой матрицы в предварительно охлажденных 20 мл клеточной культуры средств массовой информации, чтобы сделать 1% внеклеточного белка матрицы средств массовой информации.
  4. Поместите стерилизованный ковер (22 мм х 22 мм) в 35-мм пластине. Поместите 400 л 1% внеклеточного белка матрицы средств массовой информации на обложке.
  5. Поместите 35-мм пластину в инкубатор клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию на 1 ч, чтобы внеклеточная белковая матрица полимеризировалась на крышке.
  6. При использовании культуры клеток подвески, сделать одну подвеску ячейки, как описано в шагах 1,1 до 1,5.
  7. Плита 5 х 104 клетки на внеклеточного белка матрицы покрытием coverslip помещается в 35 мм пластины. Возвращение покрых клеток в инкубатор клеточной культуры на ночь, чтобы гарантировать, что клетки поддерживаются белковой матрицей. Общий объем носителей в тарелке должен быть 3 мл, чтобы высота носителя достигла 1 см в культурном блюде.
  8. Наблюдайте за клетками под ярким полевым микроскопом с объективом объективного объектива 10-x увеличения. Клетки должны распространяться на крышку, а не плавать. Перенесите блюдо культуры с покрынными клетками во вторичный контейнер, такой как пенная коробка, в облучение на тележке общего назначения и облучать клетки, как описано в шаге 4.
  9. При использовании прикрепленных клеточных культур (например, heK-293 клетки), переваривать клетки, как описано в шагах 2,1 до 2,6. Поместите 5 х 104 клетки на стерильное покрытие скольжения в 35 мм пластины за день до облучения, чтобы убедиться, что клетки полностью прикреплены к поверхности крышки, наблюдая их под микроскопом, как в шаге 3.9. Используйте 3 мл dMEM-носителей, чтобы сделать жидкость высотой 1 см в пластине.
  10. После выращивания клеток на крышках на ночь или до одного дня, перенесите блюдо культуры с покрынные клетки во вторичный контейнер для облучения объекта. Утилита корзину может быть использована для снижения риска утечки. Облученные клетки, как описано в шаге 4.

4. Облучение линейным ускорителем (LINAC)

  1. Используя программное обеспечение консоли LINAC, установите ускоритель gantry и коллиматор на 0 ", откройте X и Y челюсти симметричным 20 х 20 см2 размер поля и втянуть многолистки коллиматоров (MLCs) при наличии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: LINACs может иметь уплощение фильтр атлин (FFF) режим, позволяющий очень высокие дозы. Как следует из названия, это излучение не является однородным (плоским), а высокая скорость дозы достигается только в центре луча. В этом случае используется поле 7 x 7 см 2.
  2. Поместите не менее 5 см водяного эквивалентного материала на лечебном диване. Поместите клеточное блюдо для облучения при 400 МВс/мин (стандартная скорость дозы) на эквивалент воды материала и центр его на LINAC перекрестия.
  3. Поместите клетки для облучения на глубине максимальной дозы в 6 MV рентгеновский луч, около 1,5 см. Поместите дополнительный 1 см воды эквивалентного материала на верхней части блюда. В сочетании с 1 см среды, в которой клетки подвешены, это помещает клетки на среднюю глубину 1,5 см.
  4. Прикрепите передний указатель на голову LINAC. Расширьте передний указатель до тех пор, пока он не сопримнется с поверхностью материала накопления и обратите внимание на расстояние. Отрегулируйте высоту таблицы до расстояния от источника до поверхности накопления 100 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние может быть подтверждено оптическим индикатором расстояния. Кроме того, оптический индикатор расстояния может быть использован вместо указателя переднего для установки источника для накопления поверхности до 100 см.
  5. Рассчитайте соответствующее количество блоков монитора (MU), чтобы доставить нужную дозу радиации в клетки и запрограммировать ускоритель доставить на 400 МВ/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки источника на поверхности (SSD) на LINAC, откалиброванном для доставки 1 cGy/MU на глубину максимальной дозы, необходимое количество блоков монитора рассчитывается с помощью MU и Дозы (cGy) / (1 cGy/MU) / OF (20x20), где коэффициент выхода. Этот расчет должен быть изменен для LINACs с использованием альтернативных населенных установк калибровки.
  6. Оставьте хранилище для лечения и убедитесь, что все остальные люди вышли. Провизите, что в комнате нет других клеток, или они будут получать низкие дозы радиации. Закройте дверь хранилища.
  7. Подтвердите размер поля, MU и MU/min на консоли, а затем включить луч.
  8. Повторите шаги 4.3-4.8 для того, чтобы клетки облучались при более высоких или более низких дозах.
    1. Для достижения более высоких показателей дозы (например, 2100 MU/min или больше) с ускорителем, уменьшить SSD для того, чтобы увеличить эффективную дозу к клеткам в соответствиис обратным квадратным законом: DoseRateEffective
    2. Для низких доз (например, 20 МВт/мин) увеличиваем источник на поверхностное расстояние (SSD-New), чтобы уменьшить дозу. Например, блюдо клеточной культуры может быть помещено на пол процедурного отделения.
    3. Пересчитать настройки блока монитора на ускорителе, если эта установка необходима, используя ДОЗу MU (cGy) / (1 cGy/MU) / OF (20x20)/ (100 см / SSD-New)2. Для получения дополнительной информации о расчетах MU, обратитесь к ссылке McDermott и Ортон18.
  9. Определить скорость дозы в Gy/minute по DoseRate (Gy/Min) - Доза (Gy) (MU/min)/MU. например, 4 Gy доставлены на 400 MU /мин требует 380 MU, так что 4'400/380 и 4,2 Gy/min. Смотрите таблицу 1.

figure-protocol-1
Рисунок 1 : Настройка блюда клеточной культуры на линейном ускорителе. (A) Показан клинический линейный ускоритель. (B) 5 см воды эквивалентного материала помещается на обработку диване. (C) Блюдо культуры клеток помещается на поверхность материала. (D) Блюдо по центру с помощью ускорителя перекрестие в области обработки показано квадратное светлое поле. (E) 1 см воды эквивалентный материал помещается на верхней части тарелки культуры клеток. Источник на расстояние поверхности (SSD) проверяется с помощью оптического индикатора расстояния(F, G) или указателя фронта (H,I). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

5. Биологические анализы после облучения

  1. После облучения верните клетки в инкубатор клеточной культуры таким же образом, как описано выше (шаг 1.9, 2.8 и 3.10).
  2. По мере необходимости, адаптировать различные биологические анализы, чтобы вписаться в исследовательский проект.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы показываем репрезентативный анализ клеточного цикла16 в качестве примера биологического анализа после облучения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения эффекта клеточного цикла стандартной дозы и дополнительного облучения высокой дозы линейным ускорителем, с помощью этого протокола были подготовлены три образца стволовых клеток глиомы и собрано 24 ч после облучения17: один контрольный образец , который не был облучены(Рисунок 2A), один образец облученных с 400 MU/min (монитор единицы, 4,2 Gy/мин стандартная скорость дозы, Рисунок 2B) до 4 Gy...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Радиотерапия является неотъемлемой частью борьбы с раком. Продолжающиеся усилия направлены на повышение эффективности и эффективности лучевой терапии. Достижения в технологии линейного ускорителя предоставили возможность лечить пациентов с беспрецедентной точностью и безопасностью. Поскольку большинство пациентов лечатся с высокой энергией рентгеновских лучей от линейных ускорителей, исследования изучения биологических эффектов большого диапазона доз, выполняемых на линейных ускорителей могут быть легко применены к пацие...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Кливлендскую клинику за использование линейных ускорителей. Мы благодарим доктора Джереми Рича за его щедрый дар стволовых клеток, похожих на глиому. Это исследование было поддержано Кливлендской клиникой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Material
glioma стволовая клетка 387подарок от доктора Джереми Рича
293 клеткиATCCCRL-1573
нейронные среды для культивирования стволовых клетокThermo Fisher Scientific21103049NeurobasalTM среда
DMEMThermo Fisher Scientific10569044
Фетальная бычья сывороткаThermo Fisher Scientific16000044
пенициллин/стрептомицинThermo Fisher Scientific15140-122
Рекомбинантный человеческий EGF белокR& D Systems236-EG-01M
человеческий FGF основныеR&; D Systems4114-TC-01M
B-27™ ДобавкаThermo Fisher Scientific17504044
пируват натрияThermo Fisher Scientific11360070
L-глутаминThermo Fisher Scientific25030164
Tripsin-EDTAThermo Fisher25200056
внеклеточный протен матриксCorning354277MatrigelTM
ЭтанолFisher химикатA4094
Equipment
10 см чашка для клеточных культурDenvilleT1110
3,5 см чашка для клеточных культурСША Scientific Inc.CC7682-3340
22x22 мм стеклянная крышка скользящаяэлектронная микроскопиянауки 72210-10
15 мл центрифужная пробиркаThomas Scientific1159M36
50 мл центрифужная пробиркаThomas Scientific1158R10
5 мл пипеткаFisher Scientific14-955-233
пипеткаFisher Scientific13-681-06
Вихревой смесительFisher Scientific02-215-414
ЦентрифугаEppendorf5810R
Линейный ускорительVarianн/д
водный эквивалент материалSun Nuclear corporation557Твердая водаTM<
>Реагентный препарат
DMEM media10% фетальная бычья сыворотка (FBS), 2 мМ L-глутамин, 100 ЕД/мл пенициллина G, 100 и микро; г/мл стрептомицина в среде 500 мл среда для
мл добавка B27, 20 и микро; г hFGF, 20 & микро; g hEGF, 2 мМ L-глутамина, 100 единиц/мл пенициллина G, 100 &; г/мл стрептомицина в дозе 500 мл Нейробазальная среда
Рекомбинантный strong культивирования стволовых клеток DMEM 10

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Stupp, R., et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. The Lancet Oncology. 10 (5), 459-466 (2009).
  3. Tao, R., et al. Hypoxia imaging in upper gastrointestinal tumors and application to radiation therapy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1044-1053 (2018).
  4. Gajiwala, S., Torgeson, A., Garrido-Laguna, I., Kinsey, C., Lloyd, S. Combination immunotherapy and radiation therapy strategies for pancreatic cancer-targeting multiple steps in the cancer immunity cycle. Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1014-1026 (2018).
  5. Liney, G. P., Whelan, B., Oborn, B., Barton, M., Keall, P. MRI-Linear accelerator raiotherapy systems. Clinical Oncology Journal | The Royal College of Radiologists. 30 (11), 686-691 (2018).
  6. Hall, E. J. Radiation dose-rate: a factor of importance in radiobiology and radiotherapy. The British Journal of Radiology. 45 (530), 81-97 (1972).
  7. Steel, G. G., et al. The dose-rate effect in human tumour cells. Radiotherapy & Oncology. 9 (4), 299-310 (1987).
  8. Ling, C. C., Gerweck, L. E., Zaider, M., Yorke, E. Dose-rate effects in external beam radiotherapy redux. Radiotherapy & Oncology. 95 (3), 261-268 (2010).
  9. Castro, G., et al. Amotosalen/UVA treatment inactivates T cells more effectively than the recommended gammadose for prevention of transfusion-associated graft-versus-host disease. Transfusion. 58 (6), 1506-1515 (2018).
  10. Gaddini, L., et al. Exposing primary rat retina cell cultures to γ-rays: An in vitro model for evaluating radiation responses. Experimental Eye Research. 166, 21-28 (2018).
  11. Simara, P., et al. DNA double-strand breaks in human induced pluripotent stem cell reprogramming and long-term in vitro culturing. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 73(2017).
  12. Wang, Z., et al. A comparison of the biological effects of 125I seeds continuous low-dose-rate radiation and 60Co high-dose-rate gamma radiation on non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 10 (8), 0133728(2015).
  13. Lasio, G., Guerrero, M., Goetz, W., Lima, F., Baulch, J. E. Effect of varying dose-per-pulse and average dose rate in X-ray beam irradiation on cultured cell survival. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (4), 671-676 (2014).
  14. Karan, T., et al. Radiobiological effects of altering dose rate in filter-free photon beams. Physics in Medicine and Biology. 58 (4), 1075-1082 (2013).
  15. Sarojini, S., et al. A combination of high dose rate (10X FFF/2400 MU/min/10 MV X-rays) and total low dose (0.5 Gy) induces a higher rate of apoptosis in melanoma cells in vitro and superior preservation of normal melanocytes. Melanoma Research. 25 (5), 376-389 (2015).
  16. Hao, J., et al. The effects of extra high on glioma stem-like cells. PLoS One. 13 (8), 0202533(2018).
  17. Liu, J., et al. Radiation-induced G2/M arrest rarely occurred in glioblastoma stem-like cells. International Journal of Radiation Biology. 94 (4), 394-402 (2018).
  18. Mcdermott, P., et al. The Physics and Technology of Radiation Therapy. , Medical Physics Pub Corp. Madison WI. (2010).
  19. Lohse, I., et al. Effect of high dose per pulse flattening filter-free beams on cancer cell survival. Radiotherapy & Oncology. 101 (1), 226-232 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи