Method Article

Визуализация белка киназы активность в голову фиксированной вести мышей, используя в Vivo двухфотонная флуоресценция Пожизненная микроскопия изображений

DOI:

10.3791/59526

⸱

June 7th, 2019

 ,  ,  , 
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедура представлена для визуализации белка киназы деятельности в голову фиксированной, ведя мышей. Улучшенный a-kinase репортер активности, tAKAR, выражается в корковых нейронов и сделал доступным для визуализации через окно черепа. Двухфотонная флуоресценция визуализации микроскопии используется для визуализации деятельности PKA in vivo во время принудительного передвижения.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейромодуляция оказывает мощный контроль над функцией мозга. Дисфункция нейромодуляционных систем приводит к неврологическим и психическим расстройствам. Несмотря на их важность, технологии для отслеживания нейромодуляторных событий с клеточным разрешением только начинают появляться. Нейромодуляторы, такие как допамин, норадреналин, ацетилхолин и серотонин, вызывают внутриклеточные сигнальные события через соответствующие G белковые рецепторы для модулирования нейрональной возбудимости, синаптической коммуникации и других нейронных функции, тем самым регулируя обработку информации в нейронной сети. Вышеупомянутые нейромодуляторы сходятся на пути cAMP/protein kinase A (PKA). Таким образом, in vivo PKA изображений с одноклеточным разрешением была разработана в качестве считыватель для нейромодуляторных событий в порядке, аналогичном визуализации кальция для нейрональной электрической деятельности. В этом виде представлен метод визуализации активности ПКА на уровне отдельных нейронов в коре головного мозга, подаренного мышам. Для этого используется улучшенный репортер активности А-киназы (AKAR), называемый такаре, который основан на рецензировании энергии Фюрстера (FRET). Этот генетически закодированный датчик PKA вводится в моторную кору через внутриутробное электропорацию (IUE) плазмид ДНК, или стереотаксическая инъекция адено-ассоциированного вируса (AAV). Изменения FRET отображаются с помощью двухфотонных флуоресценции визуализации изображения микроскопии (2pFLIM), которая предлагает преимущества по сравнению с коэффициентом метрических измерений FRET для количественной оценки сигнала ФРЕТ в светорассеянии ткани мозга. Для изучения деятельности PKA во время принудительного передвижения, tAKAR' изображен через хроническое окно черепа над корой бодрствования, голова фиксированной мышей, которые работают или отдыхают на скорости контролируемых моторизованной беговой дорожке. Этот подход к визуализации будет применим ко многим другим областям мозга для изучения соответствующих действий PKA, вызванных поведением, и к другим датчикам на основе FLIM для визуализации in vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейромодуляция, также известная как медленная синаптическая передача, налагает сильный контроль над функцией мозга во время различных поведенческих состояний, таких как стресс, возбуждение, внимание и движение1,2,3, 4. Несмотря на свою важность, изучение того, когда и где происходят нейромодуляционные события, все еще находится в зачаточном состоянии. Нейромодуляторы, в том числе ацетилхолин, допамин, норадреналин, серотонин, и многие нейропептиды, активировать G белковых рецепторов (GPCRs), которые, в свою очередь, вызывают внутриклеточные второго посыльного пути с широким окном временных шкалы, начиная от секунд до нескольких часов. В то время как каждый нейромодулятор вызывает определенный набор сигнальных событий, путь cAMP/protein kinase A (PKA) является общим нисходящего пути для многих нейромодуляторов1,5. Путь CAMP/PKA регулирует возбудимость нейронов, синаптической передачии пластичность 6,7,8,9,и, следовательно, настраивает динамику нейронной сети. Поскольку различные нейроны или типы нейронов выражают различные типы или уровни нейромодуляторных рецепторов10, внутриклеточные эффекты одного и того же внеклеточного нейромодулятора могут быть неоднородными в разных нейронах, и, таким образом, должны быть изучалс с сотовым разрешением. На сегодняшний день, она остается сложной задачей для мониторинга нейромодуляционных событий в отдельных нейронов in vivo во время поведения.

Для изучения пространственно-временной динамики нейромодуляции требуется подходящий способ записи. Микродиализ и быстро сканная циклическая вольтаметрия часто используются для изучения выпуска нейромодуляторов, но им не хватает пространственного разрешения для мониторинга клеточных событий11,12. Аналогии с динамикой кальция используется в качестве прокси для нейронной электрической активности в визуализации населения13, PKA изображения могут быть использованы для чтения нейромодуляторных событий по всей нейронной популяции в клеточном разрешении. Настоящий протокол описывает использование улучшенного репортера активности A-kinase (AKAR) для мониторинга деятельности PKA in vivo во время поведения животных. Описанный здесь метод позволяет одновременно визуализировать нейронные популяции в субклеточном разрешении с временным разрешением, которое отслеживает физиологические нейромодуляционные события.

AKA, состоят из донора и приемного флуоресцентных белков, связанных пептидом фосфорилирования PKA и вилоголовым, связанным (FHA) доменом, который связывается с фосфорилированным серином или трионином субстрата14,15. При активации pKA пути, пептид субстрата АКАР фосфорилирован. В результате домен FHA связывается с фосфорилированным пептидом субстрата, тем самым в результате чего два флюорофора в непосредственной близости, именуемый закрытым состоянием АКАР. Закрытое состояние фосфорилированного АКАР приводит к увеличению рецензированной рецензной передачи энергии Фюрстера (FRET) между донором и принимающим флюорофорами. Так как доля фосфорилированных АКАР связано с уровнем активности PKA16,количество FRET в биологической выборке может быть использовано для количественной оценки уровня деятельности PKA16,17,18, 19,20.

Ранние версии АКАР были в первую очередь разработаны для двухцветной социометрической визуализации14. При визуализации глубже в ткани мозга, коэффициентеметрический метод страдает от искажения сигнала из-за волны зависит рассеяния света17,18,21. Как уже говорилось ниже, флуоресценция жизни изображений микроскопии (FLIM) устраняет эту проблему, потому что FLIM измеряет только фотоны, испускаемые донором фторофора18,21. В результате, FLIM количественной freT не зависит от ткани глубины17. Кроме того, может быть использован вариант фторофора с «темным» (т.е. низкой квантовой доходностью). Это освобождает цветной канал для облегчения мультиплексного измерения ортогональных нейронных свойств с помощью одновременных изображений второго датчика или морфологического маркера17,19,20.

FLIM визуализации количественно время, что фторофор проводит в возбужденном состоянии, т.е. флуоресценции жизни18. Возвращение фторофора в наземное состояние, таким образом, конец возбужденного состояния, часто сопутствует эмиссии фотона. Хотя эмиссия фотона для отдельной возбужденной молекулы является стохастической, в популяции средняя продолжительность жизни флуоресценции является характерной чертой этого конкретного фторофора. Когда чистая популяция фторофоров возбуждается одновременно, полученная флуоресценция последует за одним экспоненциальным распадом. Время константы этого экспоненциального распада соответствует среднему сроку службы флуоресценции, которая обычно колеблется от одной до четырех наносекунд для флуоресцентных белков. Возвращение возбужденного донорского фторора в наземное состояние может также произойти с помощью ФРЕТ. При наличии ФРЕТ срок службы флуоресценции донорского флюорофора уменьшается. Нефосфорилированные АКАР обладают относительно более длительной продолжительностью жизни донорской флуоресценции. При фосфорилировании PKA, датчик проявляет более короткий срок службы, потому что донор и принимающий флюорофоры привозятся рядом друг с другом и FRET увеличивается. Таким образом, количественная оценка продолжительности жизни флуоресценции в популяции АКАР представляет уровень активности PKA.

Ранние версии АКАР не были успешно использованы для in vivo изображений с одноклеточным разрешением. Это в основном связано с низкой амплитудой сигнала датчиков АКАР к физиологическим активациям17. Недавно, систематически сравнивая доступные датчики AKAR для двухфотонных флуоресценции визуализации микроскопии (2pFLIM), датчик под названием FLIM-AKAR было установлено, превзойти альтернативные датчики. Кроме того, была разработана серия вариантов FLIM-AKAR, называемых целевыми АКАР (такарами) для визуализации активности ПКА в конкретных субклеточных местах: микротрубочки (такаре), цитозола (ТАКАР), актина (такаре), нитевидного актина (такаре), мембраны (такаре), и постсинаптическая плотность (такаря). Среди ТАКАР, ТАКАРЕ увеличила амплитуда сигнала, вызванную норадреналином, в 2,7 раза. Это согласуется с осознанием того, что большинство PKA в нейронах закреплены на микротрубах в состоянии покоя22,23. ТАКАРЕ был лучшим исполнителем среди существующих AKAДляи для 2pFLIM. Кроме того, таКАРАЗ обнаружил физиологически релевантную активность ПкА, вызванную несколькими нейромодуляторами, а выражение такараз не изменило нейронные функции17.

В последнее время, ТАКАРЗ был успешно использован для визуализации PKA деятельности в голову фиксированной себя мышей17. Было показано, что принудительное движение вызвало активность PKA в соразмере нейронов поверхностного слоя (слой 1 через 3, до глубины 300 мкм от пиа) в двигателе, стволе и зрительных кортиках. Активность PKA, вызванная передвижением, частично зависела от сигнализации через адренергические рецепторы и рецепторы D1 допамина, но не была подвержена влиянию антагониста дофаминовых рецепторов D2. Эта работа иллюстрирует способность tAKARs отслеживать события нейромодуляции в vivo с помощью 2pFLIM.

В текущем протоколе весь метод визуализации активности PKA у мышей с фиксированной головой во время принудительной парадигмы передвижения описан в шести шагах. Во-первых, добавление возможностей 2pFLIM к обычному двухфотонный микроскоп(рисунок 1). Во-вторых, строительство моторизованной беговой дорожки(рисунок 2). В-третьих, выражение датчика такарара в коре мыши при внутриутробном электропорации (IUE) плазмид ДНК, или стереотаксической инъекции адено-ассоциированного вируса (AAV). Ранее были опубликованы отличные протоколы для операций для IUE24,25 и стереотаксической инъекции вирусных частиц26. Ключевые параметры, которые мы использовали, описаны ниже. В-четвертых, установка черепного окна. Отличные протоколы были ранее опубликованы для черепно-мозговой хирургии27,28. Описано несколько шагов, которые были изменены из стандартных протоколов. В-пятых, выступая в vivo 2pFLIM. В-шестых, анализ 2pFLIM изображения(Рисунок 3 и Рисунок 4). Этот подход должен быть легко применим ко многим другим головокружичным поведенческим парадигмам и областям мозга.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Орегонского университета здравоохранения и науки.

1. 2pFLIM Настройка микроскопа

  1. Установите модуль подсчета времени фотона (PTCM, таблицаматериалов) и подключитесь к компьютеру (рисунок1) в соответствии с руководством производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PTCM, как правило, компьютерная доска, которая получает "синхронизации" вход для лазерного импульса времени и фотона вход из фотомультипликатора трубки (PMT). Он также получает время часы для пикселей, линий и кадров, от двухфотонных программного обеспечения управления изображениями. PTCM использует сигналы часов для разделения отдельных фотонов на различные пиксели и кадры.
  2. Добавьте фотодиод с пропускной способностью 200 МГц для измерения времени лазера. Поместите стандартный стеклянный покрывало в световой путь, чтобы отразить небольшую часть лазерного света в фотодиод, помещенный перпендикулярно световой дорожке(рисунок1). Подключите выход фотодиода к входной связи PTCM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многие современные лазеры также выход лазерного времени. Для этих лазеров фотодиод не является необходимым, и можно напрямую подключить лазерное синхронизация к синхронизации ввода PTCM.
  3. Обмен PMT, в случае tAKAR, зеленый канал PMT, с низким уровнем шума, быстрый GaAsP PMT (Рисунок 1). Подключите выход PMT к ввожу сигнала PTCM.
    1. Добавьте дополнительный сплиттер сигнала(рисунок 1) если одновременное приобретение интенсивности через обычный двухфотонный канал изображения желательно. Подключите выход PMT к сплиттеру сигнала и подключите выход сплиттера к PTCM и обычному двухфотон-образуя модулю.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ГаАСП ПМТ дают более быстрые однофотоновые сигналы, чем обычные бьалкали ПМТ, и позволяют более точно определить время фотона. Некоторые модели ПМТ GaAsP можно охлаждать до 10–35 градусов ниже температуры окружающей среды, что позволяет подавление темных отсчетов до уровня ниже нескольких сотен в секунду (обычно 200 пунктов/с). Этот низкий уровень шума имеет важное значение для точного измерения жизни флуоресценции, потому что количество шумовых фотонов не может быть легко различимо или вычитано из кривой жизни флуоресценции.
  4. Добавьте фильтр для флуоресценции, который сводит к минимуму спектральное загрязнение, если таковой имеется, от фторофора приемного. Например, для tAKAR, 500 нм и 20 нм барьерный фильтр для зеленого канала используется для уменьшения загрязнения от приемного sREACh, который является темным (Y Y 0.07) желтый флуоресцентный белок (YFP)29,30. Подключите сигналы времени, такие как часы для отдельных пикселей изображений, линий и кадров, в соответствии с программным обеспечением управления и описанными в руководстве пользователя PTCM. Установите соответствующее программное обеспечение для управления данными и приобретения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые производители PTCM(Таблица материалов) предоставляют свое программное обеспечение для 2pFLIM изображений. Здесь используется специальное программное обеспечение под названием FLIMimage, которое было разработано лабораторией Yasuda (Max Planck Florida, через личное общение). Это программное обеспечение функционирует как функция дополнительного пользователя к определенному программному обеспечению для приобретения двух фотонов(Таблица материалов). Он контролирует и общается с PTCM в соответствующее время во время двухфотонного изображения для получения изображений 2pFLIM.

2. Строительство моторизованной беговой дорожки

ПРИМЕЧАНИЕ: Дизайн специально построенной моторизованной беговой дорожки показан на рисунке 2.

  1. Вырежьте пенный ролик (до 200 мм) до 150 мм в длину с тонкой ножовкой. Кроме того, клей две половинки пены мяч вместе и место ленты над швом. Дополнительно приклейте резиновый коврик с профилем на ролике, чтобы увеличить тягу на ролике.
  2. Просверлите отверстие диаметром 1/4 дюйма через центр ролика на плоской стороне ролика или просверлите отверстие диаметром 1/4 дюйма через середину каждой половины шарика, если используется пенный шарик.
  3. Установите стальную ось диаметром 1/4 дюйма через отверстие. Клей пены ролик / мяч на ось с помощью пены совместимый клей. Дополнительно, изменить два гибких вала соединений (1 /4 дюйма внутреннего диаметра), чтобы укрепить соединение оси на пену ролика / шара.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что многие распространенные клеи могут растворять пену.
    1. Для каждого вала соединения, положение вала соединения на его плоской стороне и в центре прямоугольника металлической пластины (0,7 мм х 15 мм х 76 мм). Сварена пластиной к соединению вала. Просверлите отверстие в 1/4 дюйма в центре пластины, чтобы обеспечить установку модифицированного вала, соединяющегоось с осью, и двух винтовых отверстий в боковую металлическую пластину от центра.
    2. Установите вал соединения на ось против пены ролика / мяча. При использовании последнего, слегка согните пластину, чтобы соответствовать кривизны мяча. Поместите винты в боковые отверстия, чтобы зафиксировать ролик/шар на оси.
  4. Просверлить и нажмите 3/8-32 нить в центре пластины клетки и установить роторный кодер. Просверлите винтовое отверстие в основание правоугольной кронштейна двигателя, чтобы вложение двигателя на столб держателя. Прикрепите как роторный кодер, так и двигатель к концу оси, используя гибкую свалку вала.
  5. Установите собранную беговую дорожку на алюминиевую доску хлеба с помощью столбов для двигателя и роторного кодера(рисунок2). Подключите входные данные двигателя к контроллеру скорости, а роторный кодировщик вывод к аналоговому вхотворному компьютеру сбора данных (DA) борту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Угловая скорость вращения кодируется вращающимся кодером в виде напряжения и оцифровывается с помощью пользовательского программного обеспечения под названием AnimalTracker, написанного в MATLAB.
  6. Установите держатель, совместимый с головой, на кронштейн с правым углом. Установите твердый столб на хлебной тарелке перед беговой дорожкой и установите собранный держатель головного уклада с правоугольным кронштейном на столбе(рисунок2). Убедитесь, что решетки держателя для головного уклада выровнены с осью таким образом, что мышь может принять адекватное и удобное положение ходьбы на беговой дорожке(рисунок 2C).

3. Выражение датчика ТАКАРЗ в мышечной кортексе

  1. При электропорации матки
    1. Подготовьте решение ДНК для IUE, добавив 0,2% конечную концентрацию быстрого зеленого красителя (для визуализации во время инъекции) к плазмидной ДНК (3 х4 мкг/л; датчик строит, содержащий промотор ЦИАГ, последовательность датчиков и вирус гепатита сурка посттранскрипционный элемент реакции (WPRE) трансляционный усилитель) растворенный/разбавленный в воде или Tris-EDTA.
    2. Подготовка приурочен беременных женщин мыши (например, C57BL/6) для IEE на E1624. Анестезить мышь с изофлюран (4% для индукции и 1,5% для обслуживания, на 95% O2 с 5% CO2) и применять подкожную инъекцию пери-оперативных анальгетиков, содержащих 5 мг/кг Meloxicam и 4 мг/кг Bupcainivae. Разрежьте брюшную полость скальпелем и ножницами и тщательно разоблачить рога матки.
    3. Вводят 1 зл раствора ДНК на эмбрион в боковом желудочке одного полушария, как ранее описано24.
    4. Выполните регулярные IUE24 для корковых нейронов, поместив положительный электрод конца ноги на коре и с помощью пяти 100-мс квадратных импульсов (38 V) на 1 Гц с электропортом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные корковые области могут быть направлены на электропорацию, изменив расположение электрода конечной ноги по отношению к боковому желудочку.
  2. Стереотаксическая инъекция
    1. Подготовка мыши в послеродовой день 30 для стереотаксической хирургии26. Анестезия мыши, как описано в шаге 3.1.2., и применять подкожную инъекцию пери-оперативных анальгетиков, содержащих 5 мг/кг карпрофена.
    2. Разбавляйте серотип AAV 2/1 (AAV2/1), выражая hSyn-tAKAR-WPRE эмпирически определенному титеру (No1 х 109х 1010 геномов/Л) в фильтрованных шприцев (0,2 мкм целлюлозы ацетатной мембраны) фосфатно-буферизированного сосудистого раствора.
    3. Просверлите отверстие диаметром 500 мкм с помощью ручного сверла под стереомикроскопом в следующих координатах для моторной коры: 0,5 мм передбреки, от 1,2 мм боковой до средней линии.
    4. Установите инжектор (например, масляный гидравлический манипулятор, с изготовленным на заказ держателем пипов/стеклянных пипетки) к моторизованному манипулятору. Поместите иглу для впрыска под углом 15 градусов по отношению к плоскости брегма-лямбда. Программа диагонального движения по x- и z- осей эквивалентно 700 мкм и 200 мкм прогрессии вдоль передней-заднего и дорсаль-вентральные оси, соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать повреждения тканей непосредственно над предназначенным полем изображения, частицы AAV вводятся под углом относительно плоскости брегма-лямбда.
    5. Расположите кончик иглы впрыска в пиа в центре бурового отверстия и медленно выполните описанное выше диагональное движение (25 мкм/с). Эта процедура будет позиционировать центр впрыска на 1,2 мм передбре в брегму, 1,2 мм боковой до средней линии, 0,2 мм ниже пиа.
    6. Вводят 20 нл разбавленных вирусных частиц (10 нл/мин). Подождите не менее 10 минут и медленно втягивайте иглу для инъекций (12,5 мкм/с).
    7. Закончите процедуру стереотаксической инъекции и клей / шов кожи26.

4. Установка черепного окна

  1. Выполните размещение черепного окна на мышах, выражающих таКАРЕ через IUE (раздел 3.1) или стереотаксическую инъекцию вирусных частиц (раздел 3.2), между послеродовыми днями 30 и 60. Для мыши, инфицированных вирусными частицами, реализовать черепное окно по крайней мере через две недели после инъекции вируса. Установите окно черепа, как ранее описано27,28, со следующими деталями. Анестезия мыши, как описано в шаге 3.1.2., и применять подкожную инъекцию пери-оперативных анальгетиков 0,075 мг/кг Buprenex и противовоспалительный агент Дексаметазон на 4 мг/кг.
  2. Удалите периостей и ввязать мышцы шеи. Клей края кожи к черепу с клей ткани, чтобы избежать воздействия мускулатуры шеи после операции.
  3. Высушите и удалите периостеум из черепа, аккуратно соскребая с помощью скальпеля. Поместите головной укладизображений (8 мм внутреннего диаметра), чтобы окружить предназначенное поле изображения. Приклейте головной убор к черепу с помощью клея на основе цианоакрилата, за которым следует акриловый цемент. Для оптимальной адгезии убедитесь, что головной уклад лежит на открытых и высушенных черепа. Клей ускоритель может быть использован для ускорения затвердевания.
  4. Нарисуйте круг диаметром 5 мм над предполагаемым полем визуализации (координаты, указанные в шаге 3.2.3) с помощью зубного сверла и разоблачите матер dura.
  5. Нанесите тонкий слой прозрачного полимера, также называемого искусственным дюра, на поверхность дюра, чтобы покрыть все окно черепа. Полимер защитит и стабилизирует dura mater. Поместите стерильный круговой покрывало (диаметром 5 мм) на дюра-матер. Закрепите крышку с cyanoacrylate клей применяется по краям окна следуют зубной акриловый цемент.

5. В Vivo Двухфотонная Флуоресценция Пожизненная Микроскопия изображений

  1. Начало 2pFLIM изображения на или за 2 недели после установки черепного окна (раздел 4). Свести к минимуму экспериментальные помехи из-за стресса при частой обработке и scruffing мыши до начала исследования изображений, чтобы приучить мышь.
  2. Установите двухфотонное возбуждение лазерной длины волны до 960 нм с помощью программного обеспечения, которое управляет двухфотонным лазером.
  3. Анестезируйка мышь с помощью 4% изолюран. Подтвердите правильное обезвращество хвостом и соблюдайте скорость дыхания. То есть, не должно быть никакого ответа на хвост-щепотку и скорость дыхания должна быть снижена до 1 дыхание в секунду. Чтобы свести к минимуму ненужное процедурное время и потому, что анестезия длится всего две-три минуты, глазные смазки не используются.
  4. Перенесите обезболную мышь на моторизованную беговую дорожку(рисунок 2C)и установите головной уклад мыши к держателю головного знака установки беговой дорожки (подробнее см. рисунок 2). Очистите поверхность черепного окна крышкой на мышке с 70% этанола.
  5. Поместите моторизованную беговую дорожку с установленной мышью под целью 2pFLIM. Нанесите каплю дистиллированной воды между черепным оконным покрытием и целью.
  6. Пусть установленная мышь проснуться от анестезии и стать акклиматизированы к беговой дорожке и микроскоп окружающей среды, по крайней мере 10 мин. Монитор скорости дыхания мыши в то время как установленная мышь просыпается от анестезии.
  7. Перейдите к месту инъекций под эпи-подсветкой. Документ фидуциальных особенностей (т.е. кровеносные сосуды) под яркое поле, чтобы помочь изображению той же области интереса (ROI) во время последующих сеансов изображения.
  8. Устраните любой входящий свет, кроме испускаемого света из ткани мозга. Выключите источник освещения эпиосвещенности и закройте корпус установки 2pFLIM. Активируйте 2pFLIM PMT, включив управление командным напряжением.
  9. Приобретите изображение z-stack 2pFLIM с помощью программного обеспечения для приобретения 2pFLIM FLIMimage со следующими рекомендуемыми настройками для визуализации tAKAR-положительной соматы в бодрствующих мышах. Установите кадр в среднем до 3 кадров, скорость сканирования до 2 мс/линии, размер изображения до 128 х 128 пикселей, и поле зрения до 90-100 мкм. Отрегулируйте настройки изображений в зависимости от подготовки и конфигурации оборудования.
  10. Осмотрите приобретенное изображение в FLIMview (в доме разработано пользовательское программное обеспечение; см. раздел 6). Отрегулируйте настройки изображения после шага 5.9, чтобы оптимизировать количество фотонов и свести к минимуму фотоотбеление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работоспособное интегрированное количество фотонов в рентабельности инвестиций для визуализации в течение всей жизни такара-положительной сомы in vivo составляет 1 000–10 000 фотонов в зависимости от амплитуды сигнала, которая является результатом конкретного стимула (см. Обсуждение).
    1. При необходимости используйте уменьшенное поле зрения, снижение скорости сканирования, увеличение мощности лазера и увеличение количества кадров, которые необходимо усреднеть для увеличения числа встроенных фотонов и уменьшения погрешности оценки продолжительности жизни. В то же время, не забудьте использовать минимальную необходимую мощность лазера, усреднение кадра, и скорость сканирования, чтобы свести к минимуму фотоотрубь.
  11. Изображение в обычном интервале времени (например, каждые 30–60 с) путем повторения приобретения z-stack с помощью настроек, определенных в шаге 5.10. Приобретите базовые изображения 2pFLIM в течение по крайней мере 15 минут при нулевой скорости беговой дорожке.
  12. Установите скорость вращения беговой дорожки до 15 см/с в течение 15 мин при приобретении изображений 2pFLIM. Продолжить визуализацию в течение 20 минут после выключения вращения беговой дорожки, чтобы оценить продолжительность активности PKA после прекращения принудительного передвижения.

6. Анализ изображений 2pFLIM

  1. Откройте приобретенные изображения в FLIMview и установите следующие параметры в FLIMview.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Детали параметра описаны в DISCUSSION.
    1. Нажмите на одно фотонные поля (SPC) с минимальным и максимальным диапазоном в FLIMview. Введите соответствующее минимальное и максимальное значение диапазона SPC, обычно варьирующееся между 1,2 и 10-12 нс, соответственно.
    2. Нажмите на поле значения t0 в FLIMview и введите значение t0 (обычно 2 нс). Нажмите на поле минимального порогового значения продолжительности жизни в FLIMview и введите желаемое пороговое значение до 5-30 фотонов.
  2. Нажмите на новуюкнопку группы (N ) и присвоите имя группы эксперимента. Это позволит создать группу, которая объединяет данные с каждого добавленного изображения FLIM.
  3. Нажмите на кнопку roI в модуле Управления Roi FLIMview и нарисуйте рентабельность инвестиций вокруг сомы, положительной соме. Уменьшите диапазон z-stack, перемещая нижний и верхний z-лимит в ползунки z-stack Control в FLIMview, чтобы свести к минимуму загрязнение сигнала, возникающее из фоновых фотонов в других глубинах z.
  4. Нажмите на кнопку «К», чтобы добавить изображение FLIM в группу (шаг 6.2). Нажмите на кнопку Calc, чтобы вычислить среднее время жизни (LT, также называемый средним временем эмиссии фотона (MPET), для рентабельности инвестиций и ошибки оценки продолжительности жизни (яп.
  5. Откройте следующий файл в серии изображений 2pFLIM. Повторите шаг 6.4. Не забудьте скорректировать положение ROI и z-стек диапазон для измерения той же ТАКАРЕ-положительной сомы с течением времени, потому что может быть ткани дрейфа с течением времени.
  6. Выберите deltaMPET/MPET0 в выпадающем меню модуля группового контроля. Нажмите на исходное поле и введите индекс (es) (например, 1 2 3 4 5 для первых пяти изображений в группе, созданной в шаге 6.3). Это позволит определить изображение (ы), используемое длярасчета базового срока службы (LT 0).
  7. Нажмите на участок для создания графика, содержащего ответ FLIM (ЗЛТ/LT0) tAKAR в ходе эксперимента в определенных ROIs. Нормализация изменений в продолжительности жизни (ЗлТС) отдельных ROIs по соответствующему базовому сроку службы (LT0) позволяет для сравнения активности PKA во время передвижения по различным ROIs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Датчики FRET-FLIM позволяют визуализировать множество различных сигнальных путей, включая путь cAMP/PKA, участвующий в нейромодуляции. Текущий протокол использует недавно разработанный датчик такарара в сочетании с 2pFLIM для визуализации деятельности PKA у мышей с фиксированной головой. Большинство существующих двухфотонных микроскопов можно модернизировать с возможностями 2pFLIM, добавив три-четыре компонента, как показано на рисунке 1 (см. также раздел 1)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует использование датчика FRET-FLIM tAKAR для визуализации нейромодуляции триггера PKA деятельности в голову фиксированной себя мышей. Это приложение основано на обширном тестировании и характеристиках tAKAR' in vitro и in vivo, чтобы продемонстрировать, что полученный сигнал FLIM имеет отношение к физиологическим нейромодуляторным событиям17. Здесь, одно применение in vivo, деятельность PKA, вызванная передвижением в моторной коре, используется для описания процедур достав...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим г-жу Тесс J. Lameyer, г-жа Рут Франк, и д-р Майкл А. Muniak для редактирует и комментарии, и д-р Ryohei Ясуда на Макс Планк Флорида для 2pFLIM приобретения программного обеспечения. Эта работа была поддержана двумя наградами BRAIN Initiative U01NS094247 (H.) и T.M.) и R01NS104944 (H.A. и T.M.), грантом R01NS081071 (T.M.) и грантом R21 R21. Все награды от Национального института неврологических расстройств и инсульта, Соединенные Штаты.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,2 μ m ацетатная целлюлоза шприц фильтрNalgene190-2520Шаг 3.2.2.
16x 0.8 NA водопогружающий объективNikonMRP07220Step 5.5.
3-контактный кабельамериканский цифровойCA-MIC3-SH-NCStep 2.5. Для подключения датчика вращения к входу сбора данных микроскопа
алюминиевая макетная платаThorlabsMB1012Step 2.5.
Программное обеспечение AnimalTracker MATLABН/Д Шаг2.5 и разделы 5 - 6. Будет предоставлен по запросу ведущего автора
Полосовой барьерный фильтрChromaET500-40mStep 1.4.
Решетчатая плитаThorlabsCP01Шаг 2.4. Используется в качестве крепления для датчика вращения
Заусенцы из углеродистой стали для микродрели, диаметр наконечника 0,5 ммFST19007-05Шаги 3.2.3. и 4.4.
Круглое покровное стекло (диаметр 5 мм)VWR101413-528Шаг 4.5.
Изготовленный на заказ иглодержатель для инъекцийН/Д/ДШаг 3.2.4. Технические детали предоставляются по запросу ведущему автору:
Стоматологический акрилYates Motloid44114шаги 4.3. и 4.5.
Бормашина; Микрокрутящий момент iiRam изделия66699Шаги 3.2.3. и 4.4.
Даусил прозрачный полимерThe Dow Chemical Company3-4680Шаг 4.5. Электрод для
электропорациитвердойLF650P5Шаг 3.1.4.
ЭлектропораторBexCUY21Шаг 3.1.4.
Быстрый зеленый FCFSigma-aldrichF7258-25GStep 3.1.1.
Программное обеспечение FLIMimage MATLABН/Д/ДРаздел 5. Любезно предоставлено доктором Рёхеем Ясуда, Максом Планком, Флорида,
FLIMview программное обеспечение MATLABН/Д Н/ДРазделы 5 и 6. Будет предоставлен по запросу ведущему автору
Пеносовместимый клей (Gorilla White Glue)Gorilla5201204Шаг 2.3.
Оголовьен/д н/дШаг 4.3. Технические детали предоставляются по запросу ведущему автору
Держатель оголовьяН/ДН/ДШаг 2.6. Технические детали предоставлены по запросу ведущего автора, используются в сочетании с монтажным кронштейном стойки и прямоугольным кронштейном
Гидравлический микроманипуляторНаришигэМО-10Шаг 3.2.4.
Клей КрейзиКлей КрейзиKG82648RШаг 4.3. Клей на основе цианоакрилата
Малошумный быстрый фотоумножительHamamatsuH7422PA-40 или H10769PA-40Шаг 1.3.
MATLAB 2012bMathworksN/AШаги 2.6 и разделы 5 и 6. Используется для запуска программного обеспечения для сбора и анализа данных микроскопа
MotorZhengkeZGA37RGStep 2.4.
Регулятор скорости электродвигателяElenkerEK-G00015A1-1Шаг 2.5.
Моторизованный микроманипуляторSutterMP-285Step 3.2.4.
Монтажная базаThorlabsBA1SШаг 2.5. Используется для стоек для двигателя и датчика в сочетании с PH4 и TR2
Монтажная стойкаThorlabsP14Step 2.6. Используется для держателя оголовья в сочетании с PB2
Монтажная стойка основанияThorlabsPB2Step 2.6. Используется для стойки держателя оголовья в сочетании с P14
Кронштейн монтажной стойкиThorlabsC1515Step 2.6. Используется в сочетании с прямоугольным кронштейном и держателем оголовья
Оптическая стойкаThorlabsTR2Step 2.5. Используется для стоек для двигателя и датчика в сочетании с BA1S и PH4
Phosphate-buffered saltΝ/ΑΝ/&Альфа;Шаг 3.2.2. Протокол: Протоколы Колд-Спринг-Харбор 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
ФотодиодThorlabsFDS010Шаг 1.2.
Модуль подсчета времени фотоновBecker and HicklSPC-150Step 1.1.
Плазмида: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE)Addgene119913Шаг 3.1.3.
Держательстолба ThorlabsPH4Шаг 2.5. Используется для стоек для двигателя и датчика в сочетании с BA1S и TR2
Угловой кронштейнThorlabsAB90Step 2.6 Используется в сочетании с креплением кронштейна стойки и держателя оголовья
Энкодервращения US digitalMA3-A10-250-NStep 2.4.
Резиновый коврикRubber-CalB01DCR5LUGШаг 2.1.
Муфта вала (1/4 дюйма x 1/4 дюйма)McMaster6208K433Шаги 2.3. и 2.4.
ScanImage 3.6Svoboda Lab/Vidrio TechnologyН/ДШаги 5.9. и 6.1.
Разветвитель сигналовБеккера и ХиклаHPM-CON-02Шаг 1.3.1.
Ось из нержавеющей стали (диаметр 1/4 дюйма, L = 12 дюймов)McMaster1327K66Шаг 2.3.
Стереотаксическая система юстированияДавида Копфа1900г. Шаги 3.2. и 4.1. модифицированы; Микроманипулятор Саттера, изготовленный на заказ инъекционный иглодержатель, гидравлический микроманипулятор
Двухфотонный микроскопН/ДН/ДРаздел 5. Построен на основе модульной многофотонной микроскопической системы in vivo (MIMMS) от исследовательского кампуса HHMI Janelia (https://www.janelia.org/open-science/mimms)
Тканевый клей Vetbond3M14006Шаг 3.2.6.
Вирус: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE)Addgene119921Шаг 3.2.2.
Белый валик из пенополиэтилена (8 дюймов x 12 дюймов)Производственные предприятия INC.30-2261Шаг 2.1.1.
Белый полистирол для шариковых половинокGrahamSweetдиаметр 200мм 2 полые половинкиШаг 2.1.1.
ZipkickerPACERPT29Шаг 4.3. Ускоритель закалки
используется Н, мозговой оболочки Bex Н, buffer

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
  2. Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
  3. Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety. Neuron. 87 (3), 468-470 (2015).
  4. Berke, J. D. What does dopamine mean? Nature Neuroscience. 21 (6), 787-793 (2018).
  5. Chen, Y., et al. Endogenous Gαq-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A. Neuron. 96 (5), 1070-1083 (2017).
  6. Madison, D. V., Nicoll, R. A. Cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 372 (1), 245-259 (1986).
  7. Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction. Nature Neuroscience. 6 (1), 15-16 (2003).
  8. Pedarzani, P., Storm, J. F. PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons. Neuron. 11 (6), 1023-1035 (1993).
  9. Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Current Opinion in Neurobiology. 7 (3), 397-403 (1997).
  10. Radnikow, G., Feldmeyer, D. Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex. Frontiers in Neuroanatomy. 12 (January), (2018).
  11. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
  12. Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
  13. Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
  14. Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochemical and Biophysical Research Communications. 348 (2), 716-721 (2006).
  15. Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14997-15002 (2001).
  16. Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging. Frontiers in Pharmacology. 5 (April), 1-12 (2014).
  17. Ma, L., et al. A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice. Neuron. 99 (4), 665-679 (2018).
  18. Yellen, G., Mongeon, R. Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).
  19. Tang, S., Yasuda, R. Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity. Neuron. 93 (6), 1315-1324 (2017).
  20. Tillo, S. E., et al. Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates. Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).
  21. Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).
  22. Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2. Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).
  23. Zhong, H., et al. Subcellular dynamics of type II PKA in neurons. Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).
  24. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
  25. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. Journal of Visualized Experiments. (107), e53303(2016).
  26. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).
  27. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).
  28. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  29. Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP. Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).
  30. Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).
  31. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  32. Yu, K., et al. The central amygdala controls learning in the lateral amygdala. Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).
  33. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
  34. Yasuda, R. Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).
  35. Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Kinase A ActivityTwo photon Fluorescence Lifetime ImagingIn Vivo ImagingHead fixed Behaving MicetAKAR SensorFRET based PKA SensorIn Utero ElectroporationStereotaxic AAV InjectionChronic Cranial WindowEnforced Locomotion Treadmill

Related Articles