Method Article

Визуализация белка киназы активность в голову фиксированной вести мышей, используя в Vivo двухфотонная флуоресценция Пожизненная микроскопия изображений

DOI:

10.3791/59526

⸱

June 7th, 2019

 ,  ,  , 
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедура представлена для визуализации белка киназы деятельности в голову фиксированной, ведя мышей. Улучшенный a-kinase репортер активности, tAKAR, выражается в корковых нейронов и сделал доступным для визуализации через окно черепа. Двухфотонная флуоресценция визуализации микроскопии используется для визуализации деятельности PKA in vivo во время принудительного передвижения.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейромодуляция оказывает мощный контроль над функцией мозга. Дисфункция нейромодуляционных систем приводит к неврологическим и психическим расстройствам. Несмотря на их важность, технологии для отслеживания нейромодуляторных событий с клеточным разрешением только начинают появляться. Нейромодуляторы, такие как допамин, норадреналин, ацетилхолин и серотонин, вызывают внутриклеточные сигнальные события через соответствующие G белковые рецепторы для модулирования нейрональной возбудимости, синаптической коммуникации и других нейронных функции, тем самым регулируя обработку информации в нейронной сети. Вышеупомянутые нейромодуляторы сходятся на пути cAMP/protein kinase A (PKA). Таким образом, in vivo PKA изображений с одноклеточным разрешением была разработана в качестве считыватель для нейромодуляторных событий в порядке, аналогичном визуализации кальция для нейрональной электрической деятельности. В этом виде представлен метод визуализации активности ПКА на уровне отдельных нейронов в коре головного мозга, подаренного мышам. Для этого используется улучшенный репортер активности А-киназы (AKAR), называемый такаре, который основан на рецензировании энергии Фюрстера (FRET). Этот генетически закодированный датчик PKA вводится в моторную кору через внутриутробное электропорацию (IUE) плазмид ДНК, или стереотаксическая инъекция адено-ассоциированного вируса (AAV). Изменения FRET отображаются с помощью двухфотонных флуоресценции визуализации изображения микроскопии (2pFLIM), которая предлагает преимущества по сравнению с коэффициентом метрических измерений FRET для количественной оценки сигнала ФРЕТ в светорассеянии ткани мозга. Для изучения деятельности PKA во время принудительного передвижения, tAKAR' изображен через хроническое окно черепа над корой бодрствования, голова фиксированной мышей, которые работают или отдыхают на скорости контролируемых моторизованной беговой дорожке. Этот подход к визуализации будет применим ко многим другим областям мозга для изучения соответствующих действий PKA, вызванных поведением, и к другим датчикам на основе FLIM для визуализации in vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейромодуляция, также известная как медленная синаптическая передача, налагает сильный контроль над функцией мозга во время различных поведенческих состояний, таких как стресс, возбуждение, внимание и движение1,2,3, 4. Несмотря на свою важность, изучение того, когда и где происходят нейромодуляционные события, все еще находится в зачаточном состоянии. Нейромодуляторы, в том числе ацетилхолин, допамин, норадреналин, серотонин, и многие нейропептиды, активировать G белковых рецепторов (GPCRs), которые, в свою очередь, вызывают внутриклеточные ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Орегонского университета здравоохранения и науки.

1. 2pFLIM Настройка микроскопа

  1. Установите модуль подсчета времени фотона (PTCM, таблицаматериалов) и подключитесь к компьютеру (рисунок1) в соответствии с руководством производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PTCM, как правило, компьютерная доска, которая получает "синхронизации" вход для лазерного импульса времени и фотона вход из фотомультипликатора трубки (PMT). Он также получает время часы для пикселей, линий и....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Датчики FRET-FLIM позволяют визуализировать множество различных сигнальных путей, включая путь cAMP/PKA, участвующий в нейромодуляции. Текущий протокол использует недавно разработанный датчик такарара в сочетании с 2pFLIM для визуализации деятельности PKA у мышей с фиксированной головой. Большинство существующих двухфотонных микроскопов можно модернизировать с возможностями 2pFLIM, добавив три-четыре компонента, как показано на рисунке 1 (см. также раздел 1)........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует использование датчика FRET-FLIM tAKAR для визуализации нейромодуляции триггера PKA деятельности в голову фиксированной себя мышей. Это приложение основано на обширном тестировании и характеристиках tAKAR' in vitro и in vivo, чтобы продемонстрировать, что полученный сигнал FLIM имеет отношение к физиологическим нейромодуляторным событиям17. Здесь, одно применение in vivo, деятельность PKA, вызванная передвижением в моторной коре, используется для описания процедур достав.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим г-жу Тесс J. Lameyer, г-жа Рут Франк, и д-р Майкл А. Muniak для редактирует и комментарии, и д-р Ryohei Ясуда на Макс Планк Флорида для 2pFLIM приобретения программного обеспечения. Эта работа была поддержана двумя наградами BRAIN Initiative U01NS094247 (H.) и T.M.) и R01NS104944 (H.A. и T.M.), грантом R01NS081071 (T.M.) и грантом R21 R21. Все награды от Национального института неврологических расстройств и инсульта, Соединенные Штаты.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,2 μ m ацетатная целлюлоза шприц фильтрNalgene190-2520Шаг 3.2.2.
16x 0.8 NA водопогружающий объективNikonMRP07220Step 5.5.
3-контактный кабельамериканский цифровойCA-MIC3-SH-NCStep 2.5. Для подключения датчика вращения к входу сбора данных микроскопа
алюминиевая макетная платаThorlabsMB1012Step 2.5.
Программное обеспечение AnimalTracker MATLABН/Д Шаг2.5 и разделы 5 - 6. Будет предоставлен по запросу ведущего автора
Полосовой барьерный фильтрChromaET500-40mStep 1.4.
Решетчатая плитаThorlabsCP01Шаг 2.4. Используется в качестве крепления для датчика вращения
Заусенцы из углеродистой стали для микродрели, диаметр наконечника 0,5 ммFST19007-05Шаги 3.2.3. и 4.4.
Круглое покровное стекло (диаметр 5 мм)VWR101413-528Шаг 4.5.
Изготовленный на заказ иглодержатель для инъекцийН/Д/ДШаг 3.2.4. Технические детали предоставляются по запросу ведущему автору:
Стоматологический акрилYates Motloid44114шаги 4.3. и 4.5.
Бормашина; Микрокрутящий момент iiRam изделия66699Шаги 3.2.3. и 4.4.
Даусил прозрачный полимерThe Dow Chemical Company3-4680Шаг 4.5. Электрод для
электропорациитвердойLF650P5Шаг 3.1.4.
ЭлектропораторBexCUY21Шаг 3.1.4.
Быстрый зеленый FCFSigma-aldrichF7258-25GStep 3.1.1.
Программное обеспечение FLIMimage MATLABН/Д/ДРаздел 5. Любезно предоставлено доктором Рёхеем Ясуда, Максом Планком, Флорида,
FLIMview программное обеспечение MATLABН/Д Н/ДРазделы 5 и 6. Будет предоставлен по запросу ведущему автору
Пеносовместимый клей (Gorilla White Glue)Gorilla5201204Шаг 2.3.
Оголовьен/д н/дШаг 4.3. Технические детали предоставляются по запросу ведущему автору
Держатель оголовьяН/ДН/ДШаг 2.6. Технические детали предоставлены по запросу ведущего автора, используются в сочетании с монтажным кронштейном стойки и прямоугольным кронштейном
Гидравлический микроманипуляторНаришигэМО-10Шаг 3.2.4.
Клей КрейзиКлей КрейзиKG82648RШаг 4.3. Клей на основе цианоакрилата
Малошумный быстрый фотоумножительHamamatsuH7422PA-40 или H10769PA-40Шаг 1.3.
MATLAB 2012bMathworksN/AШаги 2.6 и разделы 5 и 6. Используется для запуска программного обеспечения для сбора и анализа данных микроскопа
MotorZhengkeZGA37RGStep 2.4.
Регулятор скорости электродвигателяElenkerEK-G00015A1-1Шаг 2.5.
Моторизованный микроманипуляторSutterMP-285Step 3.2.4.
Монтажная базаThorlabsBA1SШаг 2.5. Используется для стоек для двигателя и датчика в сочетании с PH4 и TR2
Монтажная стойкаThorlabsP14Step 2.6. Используется для держателя оголовья в сочетании с PB2
Монтажная стойка основанияThorlabsPB2Step 2.6. Используется для стойки держателя оголовья в сочетании с P14
Кронштейн монтажной стойкиThorlabsC1515Step 2.6. Используется в сочетании с прямоугольным кронштейном и держателем оголовья
Оптическая стойкаThorlabsTR2Step 2.5. Используется для стоек для двигателя и датчика в сочетании с BA1S и PH4
Phosphate-buffered saltΝ/ΑΝ/&Альфа;Шаг 3.2.2. Протокол: Протоколы Колд-Спринг-Харбор 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
ФотодиодThorlabsFDS010Шаг 1.2.
Модуль подсчета времени фотоновBecker and HicklSPC-150Step 1.1.
Плазмида: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE)Addgene119913Шаг 3.1.3.
Держательстолба ThorlabsPH4Шаг 2.5. Используется для стоек для двигателя и датчика в сочетании с BA1S и TR2
Угловой кронштейнThorlabsAB90Step 2.6 Используется в сочетании с креплением кронштейна стойки и держателя оголовья
Энкодервращения US digitalMA3-A10-250-NStep 2.4.
Резиновый коврикRubber-CalB01DCR5LUGШаг 2.1.
Муфта вала (1/4 дюйма x 1/4 дюйма)McMaster6208K433Шаги 2.3. и 2.4.
ScanImage 3.6Svoboda Lab/Vidrio TechnologyН/ДШаги 5.9. и 6.1.
Разветвитель сигналовБеккера и ХиклаHPM-CON-02Шаг 1.3.1.
Ось из нержавеющей стали (диаметр 1/4 дюйма, L = 12 дюймов)McMaster1327K66Шаг 2.3.
Стереотаксическая система юстированияДавида Копфа1900г. Шаги 3.2. и 4.1. модифицированы; Микроманипулятор Саттера, изготовленный на заказ инъекционный иглодержатель, гидравлический микроманипулятор
Двухфотонный микроскопН/ДН/ДРаздел 5. Построен на основе модульной многофотонной микроскопической системы in vivo (MIMMS) от исследовательского кампуса HHMI Janelia (https://www.janelia.org/open-science/mimms)
Тканевый клей Vetbond3M14006Шаг 3.2.6.
Вирус: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE)Addgene119921Шаг 3.2.2.
Белый валик из пенополиэтилена (8 дюймов x 12 дюймов)Производственные предприятия INC.30-2261Шаг 2.1.1.
Белый полистирол для шариковых половинокGrahamSweetдиаметр 200мм 2 полые половинкиШаг 2.1.1.
ZipkickerPACERPT29Шаг 4.3. Ускоритель закалки
используется Н, мозговой оболочки Bex Н, buffer

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
  2. Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
  3. Sun, Y., Hunt, S., Sa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Kinase A ActivityTwo photon Fluorescence Lifetime ImagingIn Vivo ImagingHead fixed Behaving MicetAKAR SensorFRET based PKA SensorIn Utero ElectroporationStereotaxic AAV InjectionChronic Cranial WindowEnforced Locomotion Treadmill

Related Articles