Методическая статья

Оценка «локализация ядра» и «культурное целостность» Зебрая

DOI:

10.3791/59528

⸱

6 мая 2019 г.

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эти протоколы были разработаны для анализа морфологии коры головного хрусталика, структурную целостность швами рыбы данио рерио в фиксированных и живых линз и для измерения положения ядра рыбы объектива данио, по передней задней оси.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данио рыба уникально подходит для генетических манипуляций и в естественных условиях визуализации, что делает его все более популярной моделью для обратного генетических исследований и для генерации transgenics для в естественных условиях визуализации. Эти уникальные возможности делают рыбу данио идеальной платформой для изучения развития и физиологии глазной линзы. Наши недавние выводы о том, что Аквапорин-0, Aqp0a, необходим для устойчивости шва переднего объектива, а также для смещения ядра объектива к центру объектива с возрастом привели нас к разработке инструментов, особенно подходящих для анализа свойств рыб-рыбок данио. Здесь мы очертить подробные методы рассечения объектива, которые могут быть применены как для личинок и взрослых линз, чтобы подготовить их для гистологического анализа, иммуногистохимии и визуализации. Мы фокусируемся на анализе целостности линз шва и морфологии клеток корковых и сравнить данные, полученные от расчлененных линз с данными, полученными в естественных условиях визуализации морфологии объектива стало возможным благодаря новой трансгенной рыбы-данио линии с генетически закодированный флуоресцентный маркер. Анализ расчлененных линз, перпендикулярных их оптической оси, позволяет количественно определять относительное положение ядра объектива вдоль передней-задней оси. Движение ядра объектива от начального переднего положения к центру необходимо для нормальной оптики объектива у взрослых рыб данио. Таким образом, количественная мера ядерной позиции объектива напрямую коррелирует с его оптическими свойствами.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рыба данио является отличной моделью для изучения развития и физиологии объектива из-за анатомического сходства с объективами млекопитающих, относительной легкости генетических и фармакологических манипуляций, скорости эмбрионального развития глаз, небольшого размера и прозрачности на ранних стадиях, позволяющий в естественных условиях визуализации. Методы, описанные здесь были разработаны для анализа морфологии рерио рыбы объектива в эмбриональных и взрослых этапах с акцентом на культурной целостности, корковых мембранных морфологии в пробирке и в естественныхусловиях, и местоположение объектива ядерной позиции вдоль передней задней оси ex естественныхусловиях. Эти методы служат отправной точкой для функциональных исследований развития и физиологии линз, а также обратных генетических экранов для фенотипов объектива в рыбе данио.

Морфология рыб изображения данио зебрая

Аквапорин 0 (AQP0) является наиболее распространенным белком мембранный объектив и имеет решающее значение для обоих, объектив развития и ясности, из-за нескольких основных функций у млекопитающих. У рыбы данио есть два Aqp0s (Aqp0a и Aqp0b), и мы разработали методы анализа потери их функций как в эмбриональных, так и взрослых объективах. Наши исследования показывают, чтоaqp0a-/-мутанты развивают переднюю полярную непрозрачность из-за нестабильности переднего шва, и aqp0a/b Двойные мутанты развивают ядерную непрозрачность1. AQP0 было показано, играть роли в водный транспорт2, адгезия3,4, цитоскелетная якорь5 и генерация градиента индекса преломления6, но эти исследования в значительной степени были выполнены в пробирке. Рыба данио дает уникальную возможность изучить, как потеря функции, или Возмущенные функции Aqp0a или Aqp0b повлияет на морфологию и функции в живых линз. Для оценки морфологии клеток объектива и культурной целостности во время разработки, мы модифицировали существующие в пробирке иммуногистхимических методов7 для использования в эмбриональных и взрослых линз, и генерируемые трансгенов, чтобы контролировать этот процесс в естественных условиях .

Иммуногистизухимический анализ структуры мембраны плазмы и культурной целостности был выполнен в цельных фиксированных эмбрионах и взрослых объективах. Линзы зебрая рыбы чрезвычайно малы (диаметр объектива ~ 100 мкм в зародыши и до 1 мм у взрослых) по сравнению со своими коллегами млекопитающих и имеют точешвы8, которые редко улавливаются в криометазах. Таким образом, целые линзы необходимы для анализа культурной целостности. Для в естественных условиях анализ формирования переднего шва, и визуализации точной архитектуры клеток объектива, мы генерируются transgenics выражая Mapple конкретно маркировки линз мембраны.

Преимущества живой визуализации transgenics мембраны объектива включают в себя: 1) избежать фиксации артефактов, 2) изучение динамических морфологических изменений в покадровой фильмов, и 3) позволяет продольных исследований, в которых ранее события могут быть коррелированы с более поздней Фенотипов. Пигментация радужки обычно предотвращает четкое изображение периферии объектива. Добавление 1-фенил 2-тиуреа (PTU) до Примордия-5 (прим-5) стадия9 предотвращает Меланогенез и пигментацию глаз до примерно 4 дней постоплодотворения (DPF). Однако, после 4 DPF, периферия объектива скрыта в естественныхусловиях, особенно на старших стадиях. Кроме того, плотность объектива сама затемняет изображения его заднего полюса. Поэтому, чтобы изучить морфологию периферии объектива, или задний шов, после 4 DPF, линзы должны быть иссечено и исправлено.

Трансгенные линии рыбы данио были использованы для анализа эмбриональных мембранные структуры объектива в естественныхусловиях10. Q01 трансгенных выражает голубого флуоресцентного белка сливается с мембраны таргетинга последовательности, Gap43, движимый EF1α промоутер и гексамера DF4 PAX6 усилитель элемента повсеместно в линзы волокна клетки11. Q01 имеет экстра-линзовидные выражения, в том числе амакрин клеток в сетчатке, которая добавляет фоновый сигнал, если основной интерес является объектив. Мы разработали новую трансгенную линию, которая выражает мембранно-привязку mApple специально в объективе, с целью избежать любого экстра-линзовидные сигнала.

Локализация ядра объектива

Мы обнаружили, что ядро объектива перемещается из первоначального переднего расположения в личиночной данио, к центральному расположению в передней-задней оси во взрослых линз. Этот сдвиг в положении ядра объектива преломления индекса, как полагают, является требованием для нормального развития рыбы-объектива зебрано-оптики1. Наши методы позволяют количественно определять ядерную централизацию объектива по отношению к радиусу объектива. Используя этот метод, мы показали, что Aqp0a требуется для объектива ядерная централизация1, и этот простой метод может быть применен к другим исследованиям развития и физиологии объектива и его оптических свойств в модели рыбы данио.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Животных протоколов, используемых в этом исследовании придерживаются ARVO заявление по использованию животных в офтальмологических и Vision исследований и были одобрены институционального ухода за животными и Комитета по использованию (ИАКУК) Калифорнийского университета в Ирвине.

1. зебрау рыбное животноводство и эвтаназия

  1. Поднимите и поддерживайте рыбу данио (штамм AB) в стандартных лабораторных условиях12. Повышение эмбрионов в среде эмбриона (EM)12. Добавить 0,003% PTU к EM от 20-24 h постоплодотворения (до чопорной-5 этап) для предотвращения образования пигмента в эмбрионов12 используется для визуализации на эмбриональных стадиях9. Поднимите личинки от 6-30 дней постоплодотворения (DPF) на диете живых роток до 14 DPF, и жить Артемия после 14 DPF12.
    Осторожно: PTU очень токсичен
  2. Анестезировать рыбу с помощью тричейна до неотзывчивого на ощупь.
    1. Подготовьте запас трикиаин путем комбинирования 400 мг 3-амино бенсодержащий аидефилестер, с 2,1 мл 1 м рис (рН 9), в 100 мл ddH2O. Отрегулируйте к pH 7,0 и храните при температуре-20 ° c.
      Осторожно: Тричейн токсичен.
    2. Развести 4,2 мл бульона Трикс в 100 мл цистерны воды для обезболивать личинок/взрослых или в EM для обезболивать эмбрионов (окончательная концентрация Трикс при 0,0165% w/v).

2. Фиксация эмбрионов и личинок

Примечание: Иммуногикохимические протоколы были адаптированы из ранее опубликованных материалов7.

  1. Исправить дехорионированных эмбрионов или личинок до 2 недель постоплодотворения в 4% (v/v) параформальдегид (ППФ) в фосфат буферизованные физиологический раствор (PBS) на ночь при температуре 4 ° с на рокер.
    Осторожно: Фа является горючим и канцерогенна.
  2. Вымойте эмбрионы три раза в течение 10 минут в PBS, и проникая в PBS с 10% Тритон и 1% ДДСО (PBS-T) на ночь при температуре 4 ° c.
    Осторожно: ДДСО токсичен, вреден при проглатывании или поглощении кожи, несет опасные материалы через кожу и является горючим. Тритон является токсичным, коррозионным и опасным для водной среды.

3. рассечение личинок и взрослых рыбы-линзы Зебраи

  1. Анестезировать рыбу из 6 личинок DPF в зрелом возрасте с трик, пока не реагирует на прикосновения, но все еще показывая сильное сердцебиение. Мера рыбы Стандартная длина в соответствии с Шиллинг (2002) для постановки13.
  2. Сразу же акцизные глаза, используя микро-вскрытие ножницы и поместить в рассечение блюдо в PBS (рис. 2 показан для взрослых глаз).
    1. Сделать пользовательский 35 mm блюдо, наполненное силикон для рассечений объектива. После того, как силиконовые установил, акцизного диота около 2-3 мм в диаметре и 0,5 мм глубиной для иммобилизации взрослых глаза/линзы во время рассечения.
  3. Рассечение контактных линз для взрослых в зебраи
    1. Место взрослого глаза в блюдо диот задняя сторона до заполнены PBS. Обездвижить глаз, вставив щипцы на < углом 45 ° через оптический диск. Будьте осторожны, чтобы не Ник или сжимать объектив. Сделать два или три радиальных разрезов через сетчатку и склеры от зрительного диска в ресничной зоне с вскрытий ножницы.
    2. Отцедите сетчатку и склеры, как лепестки цветка и инвертировать глаза, роговицы стороной вверх. Обездвижить объектив косвенно через манипуляции склеры и роговицы с плоской стороной ножницы, в то время как потянув за сетчатку и придает ткани с щипцами. Аккуратно отделим лишнюю ткань от объектива.
      Примечание: Очень важно, чтобы вскрыть тщательно, чтобы получить последовательно здоровых линз.
  4. Рассечение личиночные линзы данио зебрау
    1. Место личинок глаз задней стороной вверх на плоской части силиконового блюда заполнены PBS и использовать заостренные иглы вольфрама, чтобы сделать радиальных сокращений через сетчатку и склеры в то время как иммобилизации глаз с другой иглой вольфрама или щипцы.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы не повредить объектив.
      1. Резкость кончик 2 см длиной 0,1 мм вольфрама проволоки электролитически приостановления проволоки отзыв на 10% (Вт/в) NaOH и применения низкого напряжения переменного тока14. Закрепите иглу в пипетке Пастера путем плавления стеклянного конца с помощью горелки Bunsen.
        Примечание: Также можно использовать альтернативные инструменты тонкого рассечения.
        Осторожно: NaOH является коррозионной.
    2. Аккуратно зачерпнуть объектив от диссоциация глаза с тупой стороны иглы, и осторожно тянуть прочь прилагается ткани.

4. Фиксация расчлененных линз

  1. Сразу же зафиксировать расчлененные линзы в 1,5% (v/v) для ППД в PBS на 24 ч при комнатной температуре (RT). Мыть линзы три раза в PBS за 10 мин каждый.
  2. Проникающую линзы для анализа всей горы или криопротекции для криосекционирования (см. раздел 8).
    1. Проникая линзы в PBS-T ночь на 4 ° c.

5. иммуногистохимия объектива

  1. Маркировать мембраны фиксированных эмбрионов/личинок или взрослых линз путем инкубации в Фаллойдин-Alexa Fluor 546 (1:200 ) и клеточных ядер с Дапи (1:1000 из 5 мг/мл запаса) в PBS-T ночь при температуре 4 °c.
    Осторожно: DAPI является раздражитель кожи и глаз.
  2. Вымойте три раза с PBS-T в течение 10 мин каждый. Очистить ткани путем инкубации в 30%, 50% и 70% в PBS-T (v/v), по крайней мере 1 ч на RT каждый, или на ночь при температуре 4 ° c.
  3. Гора рыбы в 70%, что в PBS-T (v/v) на стеклянное дно 35 mm микролуночных блюда с глазами, как плоские и прямо против покрытия скольжения насколько это возможно. Для более молодых рыб небольшой передний боковой наклон может помочь сориентировать шов объектива на параллельную маскируют.

6. анализ рыбы данио рерио передняя объектива швы используя трансгенной линии в естественных условиях

  1. Генерируем тг (бонус «Крик»: Mяблоками) , используя Tol2 Kit15. Tol2-система с транссистемой15 позволяет стабильную интеграцию конструкции, где mapple управляется 300 BP человека, который является стимулятора- кристаллаин16 привязал к мембране по последовательности caax, что приводит к выражению особенно в мембране клеточных мембран волокна.
    Примечание: Эта конструкция (ID: 122451) доступна для покупки.
    1. На утро инъекции, подготовить инъекцию смеси и держать на льду. Для достижения конечного объема в 10 мкл содержащих Rrase-и Ндаэ-Free H2O, добавить: 1,5 мкл от Ху-Б1Крик: МАЯБЛС ДНК построить на 50 нг/мкл-[0.375-1.2 ПГ/окончательный инъекции], 1,5 мкл Tol2 Транспозазы мРНК на 300 нг/мкл (Tol2 kit)15 [15-30 ПГ/ Окончательный впрыск], и 1 мкл фенола красного индикатора при 1% w/v [1-4-5% (w/v)/окончательная инъекция].
    2. Впрыснуть 50-100 pL инъекционной смеси в 1-клеточной стадии эмбрионов12.
  2. Измерение эффективности трансгенеза в F0 инъекции эмбрионов путем измерения частоты эмбрионов с mApple положительных линз на 3 DPF.
    Примечание: Ожидайте иметь > 80% эффективность трансгенеза с помощью этого метода. F0 мозаики позволяют детальный анализ мембранной морфологии отдельных клеток. Различные уровни мозаицизма позволяет изображение морфологии отдельных или небольших групп клеток, в то время как более глобальное выражение объектива позволяет анализ многоклеточных структур, таких как линзы швов в естественныхусловиях.
  3. Outcross F0 мозаики рыбы для создания стабильных линий, которые маркировать все волокна клеточных мембран. F0 учредителей с трансгеном интегрированы в герминальных будет генерировать потомство с стабильной интеграции, которые могут быть сохранены как трансгенные линии.

7. анализ данио рыбы переднего объектива швы с помощью трансгенной линии в естественных условиях

  1. Обезболивать 3 DPF или взрослых мозаики или стабильной трансгенной рыбы и смонтировать в 1% низким расплав агарозы (LMA) с триксаин с глазом плоские против покрытия скольжения стекла нижней микролуночных блюд.
    1. Растворить 1 г LMA в 100 мл EM (без метиленового синего), чтобы сделать 1% LMA. Хранить в долгосрочной перспективе, как 15 мл запасов на 4 ° c. Микроволновая печь растворить шток и хранить на 42 °C до тех пор пока каждая пробка не использовать.
  2. Накройте рыбу до 6 DPF с EM с триккаин, или с бак воды с триккаин для взрослых, когда LMA установлен.
    1. Смешайте 5 мл EM без метиленовой голубой или резервуар с водой с 250 МКН акций трикикаин и 7 мкл PTU, если обработка изображений PTU обработила рыбу.

8. объектив Криосекционирование и иммуногистохимия

  1. Криотротэст фиксированные эмбрионы или взрослые линзы путем размещения в 10% сахарозы в PBS (w/v), 20% сахарозы для 1 ч на RT каждый (или на ночь при температуре 4 ° c) и ночь в 30% сахарозы при 4 ° c.
  2. Вставлять ткань в Окт в базовых формах, а затем заморозить на патроны с октября Криоция на 12-14 мкм и собирать на суперпрост/Plus Микроскоп слайды. Теплые разделы на слайд в течение 10 минут на слайде теплее предварительно разогреться до ~ 35 ° c.
  3. Мыть разделы три раза с PBS за 10 мин каждый. Маркировать разделы с Phаллоидин-Алексой мукой 546 (1:200) с DAPI (1:1000) или WGA-Alexa мука 594 (1:200), затем 3 PBS моет. Гора с анти-исчезать монтажа среды, и уплотнение покрывало с лаком для ногтей.

9. Визуализация

  1. Приобретаем изображения с помощью конфокального микроскопа. Приобретите z-стеков или оптических ломтиков с помощью 60x N/A 1,2 воды погружения цели, или аналогичный, в конкретных регионах от передней к задней полюса объектива. Используйте следующие настройки приобретения: 1,2 Воздушный диск с использованием лазера 561 Нм, Техасского красного фильтра для Фаллоидин-Alexa муки 546 или mApple, или лазер 405 с УФ-фильтром для DAPI.
  2. Правильная мощность лазерной энергии z для противодействия потере сигнала с глубиной в объектив. Это позволяет для сильного сигнала на заднем полюсе фиксированной и жить 3 DPF эмбрионов, и сильный сигнал в экваториальных оптических ломтиков у взрослых рыб линз.
  3. Компилируйте и просматривать изображения с помощью программного обеспечения обработки изображений.

10. Измерение локализации ядра объектива в передней-задней оси

  1. Ориент свежевырезанных линз аксиально в PBS в 35 mm блюдо с покрытым стеклом снизу, с полюсами и швов, ориентированных параллельно плоскости фокуса. Ищите разницу в индексе преломления, который обычно происходит в интерфейсе коры объектива и ядра объектива для идентификации ядра объектива.
    Примечание: Здоровые линзы дикого типа для взрослых чрезвычайно прозрачны, что затрудняет видеть швы и ядро объектива или определять ориентацию объектива. В этом случае, небольшой Ник с щипцами для объектива капсула вызывает незначительные повреждения, что делает швы и ядро объектива очевидной примерно в 10 минут помогает ориентироваться объектив для этого измерения. Тем не менее, линзы становятся непригодными для использования в нисходящих приложениях, поскольку они теперь повреждены.
  2. Возьмите изображения линз с ядром объектива в фокусе под ярким освещением поля с или без дич оптики с помощью рассечения микроскопа с камерой прилагается. Изображение микрометра под тем же увеличением для калибровки.
    1. Нажмите на кнопку "живая", отрегулируйте настройки экспозиции, чтобы визуализировать периферию ядра и объектива, и Возьмите изображение, нажав кнопку Snap Shot. Сохранить в качестве МФТ файла.
    2. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для калибровки изображений приобретенных линз. Выберите прямой линии инструмента и нарисовать линию известной длины на микрометра изображения, нажмите проанализировать | установить масштаб. Введите известное расстояние, единицы и выберите «глобальную» калибровку и щелкните OK.
  3. Измерение расстояния центра ядра объектива до переднего полюса (a-r).
    1. Используйте прямую линию инструмента в программном обеспечении обработки изображений, чтобы нарисовать линию через отображаемого центра объектива ядра в осевой ориентации. Возьмите центр этой линии как центр ядра объектива.
    2. Нарисуйте другую линию от этой точки до переднего полюса объектива и выберите ' измерение ' в меню ' анализировать ', чтобы измерить расстояние (a-r), где радиус объектива и r -расстояние от центра объектива до центра Ядра.
    3. Нарисуйте другую линию от передней к задним полюсам и измерьте это расстояние как диаметр объектива (2A). Скопируйте эти длины из окна "результатов" и переведите их в электронную таблицу или программу статистики.
      Примечание: Это легче точно измерить от центра ядра до переднего полюса, чем измерение от центра ядра объектива до центра объектива. Это измерение преобразуется формулой в шаге 10.3.5 для того чтобы сообщить Расстояние центра ядра объектива к центру объектива. Всегда используйте взрослое ядро для измерений, даже если эмбриональное ядро очевидно.
    4. Разделите диаметр на 2, чтобы вычислить радиус объектива, a.
    5. Расчет r/a, как figure-protocol-1 , нормализованная локализация ядра объектива по отношению к радиусу объектива.
      Примечание: для ядра, помещено ближе к передней полюсу, r/a будет > 0.0, в то время как центральное локализованное ядро будет иметь r/a 0,0.
  4. Граф журнала нормализованных осевых измерение ядра в качестве функции стандартной длины, чтобы определить изменения в локализации ядра объектива в процессе развития рыбы данио.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анатомия взрослой рыбы в глазном зебрае очень напоминает млекопитающих (рис. 1a). Несмотря на некоторые различия между рыбами данио и млекопитающихся глаз, таких, как с ресеплярной зоны вместо ресницах тела17, различия в оптических свойств18, и различия в морфогенез во время эмбрионального развития19, глазной рыбий глаз является отличной моделью для изучения развития глаз и понимания офта...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ морфологии линзы данио рерио является начальным шагом в понимании фенотипов в мутантах, или эффекты фармакологических вмешательств, направленных на изучение биологии глазной линзы. Мы обрисовать методы для анализа швов объектива, корковых морфологии клеток волокна и аспекты объектива ядра. Эти подходы представляют собой комбинацию в пробирке и в естественных условиях (по сравнению в таблице 1). В пробирке методы позволяют более подробно внешней морфологии клеток коры, а ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У нас нет информации.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы отметить наш источник финансирования: низ R01 EY05661 к J. E. H, Инес Герринг для оказания помощи в генерации aqp0a/b двойных мутантов и рерио рыбоводства, д-р Даниэль Дранов для дискуссий, ведущих к генерации transgenics, д-р Брюс Лаборатории Блумберга и доктора Кена Чо для использования их анатомический микроскопов, и д-р Меган Смит за помощью в статистическом анализе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-фенил-2-тиомочевина (PTU)SigmaP7629ОСТОРОЖНО – очень токсичный
4% Параформальдегид водный растворЭлектронная микроскопия SciencesRT 157-4ОСТОРОЖНО – опасность для здоровья, горючий
конфокальный микроскопNikonEclipse Ti-E
CryostatLeicaCM3050SТемпература объектива и камеры установлена на -21 & Град; C
DAPIInvitrogenD1306ОСТОРОЖНО – раздражает глаза и кожу
Диметилсульфоксид (ДМСО)Fisher ScientificD128ОСТОРОЖНО – горюче, проникает в кожу 
Одноразовая базовая формаVWR Scientific15154-631
Одноразовые стеклянные пипетки ПастераFisherbrand13-678-20A
Dumont #5 щипцыDumont & FilsKeep щипцы заточенные
этил-3-аминобензоат-метасульфонат-соль (трикаин)Sigma-AldrichA5040ОСТОРОЖНО - токсичная
чашка для микролунок со стеклянным дном (чашка Петри 35 мм, микролунка 14 мм, покровное стекло #1.5)MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
ГлицеринSigmaG2025
huβ B1cry:mAppleCAAX ДНК-конструктAddgeneID:122451
ImageJWayne Rasband, NIHv1.51n
Low Melt Agarose (LMA)Apex902-36-6
NIS-ElementsNikonV 4.5
NIS-Elements AR программное обеспечениеNikon
Olympus  с моделью 2.1.1.183 контроллерOlympus CorpМикроскоп DP70
Olympus Olympus CorpSZX12
Фаллоидин-Алекса Мука 546Thermo FisherA22283
Феноловый красный индикатор (1% по объему)Ricca Chemical Company5725-16
Фосфатный буферный раствор (PBS)Fisher ScientificBP399
PhotoshopAdobeCS5 v12.0
Программное обеспечение для фотошопаAdobeCS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD объективNikon
Источник питанияWild HeerbruggMTr 22Или аналогичный источник питания 
Подогреватель стекол модель No 26020FSFisher Scientific12-594
Шарики гидроксида натрияFisherScientific S612-3ОСТОРОЖНО - коррозионный/раздражающий для глаз и кожи, целевого органа - дыхательной системы, коррозионный для металлов
Предметное стекло для микроскопа Superfrost/PlusFisher Scientific12-550-15
Sylgard 184 силикон Dow CorningWorld Prevision Instruments
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek4583
Triton X-100 BioXtraSigmaT9284ОСТОРОЖНО – Токсичные, опасные для водной среды, коррозионные
микродиссекционные ножницыVannas Ted Pella Inc1346Острые/острые прямые кончики
Vectashield антивыцветающая среда для мытьяVector laboratoriesH-1000
Агглютинин зародышей пшеницы (WGA)-Alexa Flour-594Life TechnologiesW11262
SYLG184

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
  13. Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12(2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68(2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vivo

Похожие статьи