Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Методы тестирования эндокринных нарушений в Drosophila меланогастер

9.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59535

⸱

3 июля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

В этой статье

Краткое содержание

Химические вещества эндокринного разрушителя (ЭДЦ) представляют собой серьезную проблему для организмов и природной среды. Drosophila melanogaster представляет собой идеальную модель для изучения эффектов EDC in vivo. Здесь мы представляем методы для исследования эндокринных нарушений в Drosophila, обращаясь EDC эффекты на плодовитость, плодовитость, время развития, и продолжительность жизни мухи.

Аннотация

В последние годы растет доказательств того, что все организмы и окружающая среда подвергаются воздействию гормоноподобных химических веществ, известных как эндокринные химические вещества-разрушители (ЭДК). Эти химические вещества могут изменить нормальный баланс эндокринной системы и привести к неблагоприятным последствиям, а также увеличение числа гормональных нарушений в популяции человека или нарушенного роста и сокращения воспроизводства в дикой природе видов. Для некоторых ЭДЦ существуют документально подтвержденные последствия для здоровья и ограничения на их использование. Однако для большинства из них до сих пор нет научных доказательств в этом смысле. Для того, чтобы проверить потенциальное эндокринное воздействие химического вещества в полном организме, мы должны проверить его в соответствующих модельных системах, а также в плодовой мухи, Drosophila melanogaster. Здесь мы сообщаем подробные протоколы in vivo для изучения эндокринных нарушений в Drosophila, обращаясь edC эффекты на плодовитость / фертильность, сроки развития, и продолжительность жизни мухи. В последние несколько лет, мы использовали эти черты жизни дрозофилы для расследования последствий воздействия 17-й-этинилэстрадиол (EE2), бисфенол А (BPA), и бисфенол AF (BPA F). В общей сложности, эти анализы охватывает все этапы жизни Drosophila и позволило оценить эндокринные нарушения во всех гормоно-опосредованных процессов. Анализы сроков плодородия/фертильности и развития были полезны для измерения воздействия EDC на репродуктивную производительность мух и на этапы развития, соответственно. Наконец, продолжительность жизни с участием хронических воздействия EDC взрослых и измеряется их выживаемости. Тем не менее, эти жизненные черты также могут зависеть от нескольких экспериментальных факторов, которые должны были быть тщательно контролируется. Итак, в этой работе мы предлагаем ряд процедур, которые мы оптимизировали для правильного результата этих анализов. Эти методы позволяют ученым установить эндокринные нарушения для любого EDC или для смеси различных EDCs в Drosophila, хотя для определения эндокринного механизма, ответственного за эффект, дальнейшие эссе могут быть необходимы.

Введение

Деятельность человека высвобождает в окружающую среду огромное количество химических веществ, которые представляют собой серьезную проблему для организмов и для природных экосистем1. Из этих загрязнителей, по оценкам, около 1000 различных химических веществ могут изменить нормальный баланс эндокринной системы; в соответствии с этим свойством, они классифицируются как эндокринные разрушающие химические вещества (EDCs). В частности, на основе недавнего определения Эндокринного общества, EDCs являются "экзогенным химическим веществом, или смесь химических веществ, которые могут вмешиваться в любой аспект гормонального действия"2. За последние три десятилетия, наблюдается рост научных доказательств того, что EDCs может повлиять на воспроизводство и развитие животных и растений3,4,5,6,7, 8. Кроме того, воздействие EDC было связано с ростом распространенности некоторых заболеваний человека, включая рак, ожирение, диабет, заболевания щитовидной железы, и поведенческие расстройства9,10,11.

Общие механизмы EDC

Из-за своих молекулярных свойств, EDCs ведут себякак гормоны или прекурсоры гормонов 3,4,5,6,8,9, 10,11,12. В этом смысле они могут связываться с рецептором гормона и нарушать эндокринную систему либо, имитируя активность гормонов, либо блокируя эндогенные гормоны, связывающие. В первом случае, после связывания с рецептором, они могут активировать его, как его естественный гормон будет делать. В другом случае, связывание EDC с рецептором предотвращает связывание его естественного гормона, поэтому рецептор блокируется и больше не может быть активирован, даже при наличии его естественного гормона3. Как следствие, EDCs может повлиять на несколько процессов, таких как синтез, секреция, транспорт, метаболизм, или периферийное действие эндогенных гормонов, которые отвечают за поддержание гомеостаза, размножения, развития и / или поведение организма. Связывание рецепторов не является единственным способом действия, описанным до сих пор для EDCs. Теперь ясно, что они также могут действовать путем набора коактиваторов или основных сепрессоров в ферментативных путей или путем изменения эпигенетических маркеров дерегулирования экспрессии генов10,11,12,13 ,14, с последствиями не только для нынешнего поколения, но и для здоровья грядущих поколений8.

Гормоны дрозофилы

Потенциальные последствия отдельных ЭДЦ были широко изучены, как в видах дикой природы, так и в нескольких модельных системах, в которых достаточно хорошо известны эндокринные механизмы. Для беспозвоночных эндокринные системы, влияющие на рост, развитие и размножение, широко охарактеризованы насекомыми по нескольким причинам, включая их широкое использование в области биологических исследований, их экономическое значение и наконец, развитие инсектицидов в состоянии вмешиваться конкретно в гормональную систему насекомых-вредителей.

В частности, среди насекомых плодовая муха D. melanogaster оказалась очень мощной модельной системой для оценки потенциальных эндокринных эффектов ЭДЦ. В D. melanogaster, как и у позвоночных, гормоны играют важную роль на протяжении всего жизненного цикла. В этом организме, Есть три основные гормональные системы, которые включают стероидных гормонов 20-гидроксиексидизон (20E)15,16, сесквитерпеноид ювенильный гормон (JH)17, и нейропептидов и пептида / белка гормоны18. Эта третья группа состоит из нескольких пептидов, обнаруженных совсем недавно, но явно участвующих в огромном разнообразии физиологических и поведенческих процессов, таких как долголетие, гомеостаз, обмен веществ, воспроизводство, память, и локомотив ный контроль. 20E является гомологичным для холестерина полученных стероидных гормонов, таких как эстрадиол, в то время как JH разделяет некоторые сходства с ретинойной кислоты; оба они являются наиболее известными гормонами в Drosophila19,20. Их баланс имеет жизненно важное значение в координации линьки и метаморфозы, а также в управлении несколькими постразвития процессов, таких как воспроизводство, продолжительность жизни, и поведение21, таким образом, предлагая различные возможности для тестирования эндокринной нарушения в Дрозофиле. Кроме того, экристероидные гормоны и JH являются основными целями так называемых инсектицидов третьего поколения, разработанных для вмешательства в процессы развития и репродуктивного эндокринных опосредованных у насекомых. Агонист или антагонист режим действия этих химических веществ хорошо известен, и, таким образом, они могут служить в качестве эталонных стандартов для оценки влияния потенциальных EDCs на рост, размножение и развитие насекомых22. Например, метопрена, которая широко используется в борьбе с комарами и другими водными насекомыми23,24, работает как агонист JH и подавляет 20E-индуцированной транскрипции генов и метаморфоз.

В дополнение к гормонам, суперсемейка ядерных рецепторов (NR) в Дрозофиле также хорошо известна; она состоит из 18 эволюционно сохраненных транскрипционных факторов, участвующих в контроле гормонозависимых путей развития, а также воспроизводства и физиологии25. Эти гормоны НР принадлежат ко всем шести NR суперсемейных подтипов, в том числе тех, кто участвует в нейротрансмиссии26, два для ретинойной кислоты НР, и те, для стероидных НР, которые, у позвоночных, представляют собой одну из основных целей EDCs27.

Дрозофила как модельная система для изучения EDCs

В настоящее время, исходя из молекулярных свойств, несколько природоохранных учреждений во всем мире объясняют возможность вмешательства в эндокринные системы различными антропогенными химическими веществами. С учетом того, что ЭЦП представляют собой глобальную и повсеместную проблему для окружающей среды и организмов, общая цель исследований в этой области заключается в сокращении бремени их болезней, а также в защите живых организмов от их неблагоприятных последствий. Для того, чтобы углубить понимание о потенциальном эндокринных эффектов химического вещества, необходимо проверить его in vivo. С этой целью D. melanogaster представляет собой действительную модельную систему. До настоящего времени плодовая муха широко использовалась в качестве модели in vivo для оценки воздействия нескольких экологических ЭДЦ; было сообщено, что воздействие нескольких EDCs, таких как дибутил фталат (DBP)28, бисфенол A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-терт-октильфенол (4-терт-OP)29, метилпарабен (MP)30, этилпарабен (EP)31, 32, бис-(2-этилгексил) фталат (DEHP)33,и 17-з-этинилэстрадиол (EE2)34, влияет на обмен веществ и эндокринные функции, как в позвоночных моделей. Несколько причин привели к его использованию в качестве модели в этой области исследований. Помимо превосходного знания его эндокринной системы, дальнейшие преимущества включают в себя его короткий жизненный цикл, низкая стоимость, легко манипулируемый геном, долгая история исследований, и несколько технических возможностей (см. сайт FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster также обеспечивает мощную модель для легкого изучения эффектов трансгенерации и реакции населения на факторы окружающей среды8 и позволяет избежать этических вопросов, имеющих отношение к исследованиям in vivo у высших животных. Кроме того, плодовая муха разделяет высокую степень сохранения генов с людьми, которые могли бы сделать возможным для Drosophila EDC анализы, чтобы помочь в прогнозировании или предлагая потенциальные последствия этих химических веществ для здоровья человека. Помимо расширения понимания последствий для здоровья человека, Дрозофила может помочь оценить риски воздействия ЭДК на окружающую среду, такие как утрата биоразнообразия и ухудшение состояния окружающей среды. Наконец, плодовая муха предлагает дополнительное преимущество использования в лабораториях, где факторы, потенциально влияющие на ее развитие, размножение и продолжительность жизни, могут быть под контролем, с тем чтобы отнести любые изменения к веществу, которое должно быть проверено.

Имея это в виду, мы оптимизировали простые и надежные фитнес-анализы для определения эффектов EDC на некоторые причинно-то гормональные черты, такие как плодовитость/фертильность, время развития и продолжительность взрослой жизни. Эти анализы были широко использованы для некоторых EDCs23,24,25,26,27. В частности, мы использовали следующие протоколы для оценки воздействия синтетического эстрогена EE234 и BPA и бисфенола AF (BPA F) (неопубликованные данные). Эти протоколы могут быть легко изменены для изучения последствий данной EDC в то время, а также комбинированные эффекты нескольких EDCs в D. melanogaster.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление пищи

  1. Для поддержания запасов и для роста личинок, используйте среду кукурузной муки, содержащую 3 % порошкообразных дрожжей, 10 % сахарозы, 9 % предварительно приготовленную кукурузную муку, 0,4 % агара, после чего называется Cornmeal medium (CM).
    1. Положите 30 г дрожжей в 100 мл водопроводной воды, довести до кипения и дать ему кипеть в течение 15 минут.
    2. Отдельно хорошо перемешайте 90 г предварительно приготовленной кукурузной муки, 100 г сахара и 4 г агара в 900 мл водопроводной воды.
    3. Доведите раствор до кипения, понизите огонь и варите 5 минут, непрерывно помешивая.
    4. Через 5 минут добавьте горячий дрожжевой раствор и тушите еще 15 минут.
    5. Выключите источник тепла и дайте раствору остыть примерно до 60 градусов по Цельсию.
    6. Добавьте 5 мл/л 10% метил 4-гидроксибензоата в этанол, тщательно перемешайте и дайте ему посидеть 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны с количеством метил 4-гидроксибензоата, учитывая, что высокая концентрация фунгицида может быть смертельной для личинок.
    7. Распределите среду во флаконы/бутылки: 8 мл в каждую флакон мухи (25 мм х 95 мм), 3 мл в каждую флакон мухи (22 мм х 63 мм) и 60 мл в каждую бутылку мухи (250 мл).
    8. Накройте флаконы марлей и дайте им высохнуть при комнатной температуре (RT) в течение 24 ч до хранения.
    9. Калибровать экспериментально правильную консистенцию и гидратацию CM путем изменения либо количества используемого агара и/или времени охлаждения/сушки.
      Примечание: отключенные, упакованные и завернутые флаконы стабильны в течение 15 дней при 4 градусах Цельсия.
  2. Для взрослых Drosophila, используйте средство, содержащее 10% порошкообразных дрожжей, 10% сахарозы, 2% агара, в дальнейшем называется взрослой среде (AM).
    1. Смешайте 10 г порошкообразных дрожжей, 10 г сахарозы, 2 г агара в 100 мл дистиллированной воды.
    2. Доведите эту смесь до кипения два раза, с интервалом в 3 минуты, или до растворения агара, с помощью микроволновой печи.
    3. Как только раствор остынет до 60 градусов по Цельсию, добавьте 5 мл/л 10% метил 4-гидроксибензоата в этанол, тщательно перемешайте и разлейте во флаконах (10 мл на флакон).
    4. Обложка флаконы с марлю и дайте им высохнуть на RT в течение 24 ч до хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: отключенные, упакованные и завернутые флаконы стабильны в течение 15 дней при 4 градусах Цельсия.
  3. Для плодовитости / плодородия асссее, используйте Drosophila томатный сок-кукурузная среда.
    1. Налейте 70 мл теплой кукурузной муки в стакан 100 мл и добавьте 30 мл томатного сока (30% v/v).
    2. Тщательно смешайте с кухонным комбайном и пайптом 3 мл в небольших флаконах.
    3. Накройте флаконы марлей и дайте им высохнуть на RT в течение 24 ч до хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: отключенные, упакованные и завернутые флаконы стабильны в течение 15 дней при 4 градусах Цельсия.
  4. Для сбора эмбрионов используйте агарные пластины, содержащие 3% агара, 30% томатного соуса и 3% сахара.
    ПРИМЕЧАНИЕ: будьте осторожны, чтобы не сделать пузыри при заливке среды в тарелках.

2. Дрозофила EDC Дозинг

  1. Подготовьте соответствующее акционерное решение, растворяющее выбранный EDC в подходящем растворителе. Для EE2 (молекулярный вес 296.403), растворить 1,48 г в 10 мл 100% этанола, чтобы сделать 0,5 М фондовый раствор и хранить при -80 градусов по Цельсию.
    ПРЕДЕКТО: EDC считаются экологическими загрязнителями, и при их обращении следует принять меры предосторожности.
  2. Разбавить раствор eE2 в 10% этанола в воде (v/v) для того, чтобы получить раствор 100 мМ. Сделать следующий разбавления (0,1 мм, 0,5 мм и 1 мм) в см пищи, начиная с самой низкой концентрации и с использованием той же конечной концентрации растворителя для каждой группы лечения. Для управления флаконы использовать тот же объем растворителя в одиночку.
    Примечание: рекомендуется держать окончательную концентрацию растворителя как можно ниже, имея в виду, что конечная концентрация этанола не должна превышать 2% в мухе пищи.
  3. Добавьте раствор, содержащий правильное разбавление выбранной EDC, в продукты на основе кукурузной муки перед затвердеванием, тщательно перемешайте с кухонным комбайном, разделите 10 мл во флаконы, накройте хлопчатобумажной марлей и дайте высохнуть на RT в течение 16 ч перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: используйте этот носитель сразу после его подготовки.
  4. Для взрослого выращивания подготовьте различные рабочие растворы EE2 (10 мМ, 50 мМ и 100 мМ соответственно) в 10% этанола в воде (v/v) и слое 100 л каждого на поверхность АМ, чтобы получить желаемую концентрацию EE2 (0,1 мМ) 0,5 мм и 1 мМ). Для управления используйте тот же объем только растворителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: в качестве альтернативы добавьте раствор, содержащий правильное разбавление выбранного EDC, к небольшому количеству AM в конической трубке 50 мл, вихрь тщательно и выслоите 1 мл его на поверхность ФЛАконов AM.
    1. Накройте флаконы хлопчатобумажной марлей, дайте высыхать на РТ в течение 12-16 ч при нежном возбуждении и использовать их немедленно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: процесс сушки должен быть скорректирован экспериментально, потому что в зависимости от влажности окружающей среды.
  5. Для кормления анализ, добавить как раствор, содержащий право разбавления выбранного EDC (EE2 0,1 мм, 0,5 мМ и 1 мм) и окраски питания (например, красный краситель No 40 на 1 мг/мл)35 до CM до затвердения, смешать сильно с кухонным комбайном, а затем обойтись e во флаконы.

3. Выращивание мух

  1. Используйте надежный изогенный штамм, такой как Oregon R, поддерживаемый несколькими поколениями в лаборатории.
  2. Держите мух в увлажняемом, контролируемом температурой инкубаторе, с естественным 12 ч свет: 12 ч темный фотопериод при 25 градусов по Цельсию во флаконах, содержащих см пищи.
  3. В каждом ассоже, использовать флаконы на RT.

4. Кормление Ассай

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ рекомендуется проверить, если наличие выбранного EDC в среде может повлиять на кормление мух.

  1. Положите 15 молодых мух во флаконы, содержащие CM дополнены различными концентрациями выбранного EDC и окраски пищи. Разрешить мух кормить на средства массовой информации в течение 1 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ:Например, используйте красный краситель No 4035 (1 мг/мл).
  2. Положите 15 молодых мух во флаконы, содержащие CM дополнены растворителем в одиночку и окраски пищи для контроля. Разрешить мух кормить на средства массовой информации в течение 1 дня.
  3. Анестезируйте индивидуально каждую группу мух с эфиром.
    1. Передача мух каждой группы в цилиндрический стеклянный контейнер (эфиризатор) с воронкой, вставленной в открытый конец, инвертируя флакон над воронкой и осторожно нажав два контейнера вместе, чтобы мухи попадают в эфир.
      ПРИМЕЧАНИЕ:  Воронка предотвратит их выход из эфиризатора.
    2. Knock летит вниз, осторожно нажав эфир на мягкой поверхности, такие как коврик для мыши, и быстро заменить воронку с эфиром пропитанной хлопка и марлевой вилки.
    3. Подождите около 1 минуты, пока мухи не упадут на дно и не перестанут двигаться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: не превышать времени или мухи умрут.
  4. Поместите обездвижемых мух под стерео-микроскоп и сравните окраску брюшной полости каждой группы лечения по отношению к контрольной группе.

5. Fecundity/Fertility Assay

  1. Для каждой концентрации EDC, подготовить 3 флакона мух, затем называется родительских флаконов, с 8 женщин и 4 мужчин в 10 мл CM / EDC пищи; для контроля подготовить 6 флаконов мух с 8 самок и 4 самцов в 10 мл см пищи дополняется растворителем. Задняя мухи в инкубаторе при 25 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: избегайте перенаселенности личинок во время их развития и попытаться использовать последовательные личиночной плотности через процедуры.
  2. Через 4 дня удалите родителей и верните флаконы в инкубатор еще на 5 дней.
  3. Во второй половине дня дня 9, удалить все вновь мухи из флаконов и положить флаконы в инкубатор на 18 градусов по Цельсию на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это удаление должно быть сделано очень тщательно, проверка поверхности среды хорошо.
    1. Утром 10, для каждой группы лечения, собирать девственных женщин и молодых мужчин в две группы, под легким CO2 анестезии. Случайно разделить каждую группу мух в небольших подгруппах (10 самок и 20 самцов на флакон) в независимых флаконах, наполненных свежим соответствующим СМ.
      1. Повторите шаг 5.3.1 заботясь как тщательно удалить все мухи из флаконов 8-10 ч до сбора и оставить флаконы при 18 градусов по Цельсию, пока получить по крайней мере 30 девственных женщин и 30 мужчин для каждой концентрации EDC и по крайней мере 90 девственных женщин и 90 мужчин для контроля.
    2. Размещать эти группы мух при 25 градусах Цельсия до тех пор, пока они не состарятся 4 дня после окончания эклюзии, передавая их в новые флаконы, содержащие свежие соответствующие среды каждые два дня.
      Примечание: 4 дня достаточно времени для мух, чтобы стать зрелыми взрослыми, но это очень далеко от начала сенесценции.
    3. Через два дня убедитесь, что во флаконах самок нет личинок. Если они делают, мухи не могут быть пригодны для удостаиваться, потому что они не девственницы и должны быть отброшены.
  4. Используйте 20 одиночных мух каждого пола для каждой группы лечения, чтобы создать 20 одиночных крестов в небольшие флаконы, содержащие свежие CM-помидорной среды без EDC, как описано ниже.
    1. Для каждой группы лечения назначают сявать различные ряды последовательных чисел, которые однозначно идентифицируют ее и маркируют соответствующие флаконы; например, группа 1 (только растворитель) от 1 до 20, группа 2 (концентрация EDC x) от 20 до 40 и так далее.
    2. Сделайте таблицу плодородности для того чтобы записать различные серии, каждое соответствуя к группе обработки.
    3. Для каждого пола анестезируют всех мух, принадлежащих к каждой группе лечения под легким CO2 и случайным образом переводят их следующим образом.
      1. Перенесите одну самку, обработанную растворителем, в небольшой флакон, содержащий свежий CM-томатный носитель без EDC, и добавьте одного мужчину, обработанного растворителем, для контрольного креста.
        Примечание: томатный сок следует добавлять в среду во время его приготовления, потому что темная среда увеличивает контраст с белыми эмбрионами.
      2. Передача одного EDC лечение женщины в небольшой флакон, содержащий свежие CM-помидор без EDC и добавить один растворитель обработанных мужчин для каждого лечения.
      3. Передача одного EDC лечение мужчины в небольшой флакон, содержащий свежие CM-помидор среды без EDC и добавить один растворитель обработанных женщин для каждого лечения.
    4. Дом все эти одиночные кресты при 25 градусах Цельсия.
  5. Перенесите каждую спаривающуюпару пару в свежие ФЛАконы CM-помидоры без EDC каждый день в течение последующих десяти дней. Этикетка реплицированных флаконов каждой серии последовательно; например, 1-а, 1b, 1c...... 20a, 20b, 20c и сообщить эти номера на таблице плодородности.
  6. Визуально осматривайте каждый флакон каждый день на наличие яиц и сообщайте их номер в таблице фертильности.
  7. Сохранить каждый флакон и, когда вновь мухи начинают появляться, а также записывать ежедневное количество взрослых потомков в течение 10 дней. Через 10 дней после первоначального спаривания удалите родителей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: отбросить флакон, в котором один или оба родителя умерли; в случае побега одного или обоих родителей, включите в анализ все данные до дня их потери.
  8. Сумма ежедневное количество яиц и ежедневное количество взрослых потомков из каждой группы лечения, чтобы получить общую плодовитость / плодовитость, среднее яйцо и взрослого потомства производства мухи в течение десяти дней, и отношение общего потомства к общему количеству отложенных яиц. Рассчитайте различия в процентах от значений каждого лечения по отношению к контролю.
  9. Проведите три независимых эксперимента для каждой группы мух, используя не менее 10 мух для каждой группы лечения.
  10. Выполните статистический анализ для сравнения различных групп.

6. Сроки развития

ПРИМЕЧАНИЕ: В двух следующих альтернативных протоколах время развития оценивается путем подсчета как количества кунп( которые образуются в день, так и числа взрослых потомства в день.

  1. Протокол эклозионного ассиса 1
    1. Для каждой группы лечения, создать 10 флаконов молодых (Злт;2 дней), здоровых мух, каждый из которых 6 женщин и 3 мужчин в 10 мл кукурузной муки без EDC.
    2. Пусть летит на пищу в течение 24 ч, и позволить им спариваться.
    3. Подготовьте 10 параллельных флаконов на одну группу лечения с 10 мл каждой свежей кукурузной муки, дополненной различными концентрациями EDC или только растворителем для контроля. Передача спариваемых мух в эти новые флаконы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: для каждой группы лечения назначаем различные ряды последовательных чисел, которые однозначно идентифицируют его и маркируют соответствующие флаконы.
    4. Сделайте электронную таблицу для записи различных серий.
    5. Разрешить мухам откладывать яйца в течение 16 ч. Затем удалите родителей из флаконов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Родительские мухи могут быть использованы для повторения шага 6.1.5, переведя их на другие соответствующие флаконы.
    6. Инкубировать флаконы в течение 3-4 дней при 25 градусах Цельсия, или до тех пор, пока не более pupae форме. Каждый день подсчитывайте количество новых куколок в каждом флаконе и сообщайте об этом в таблице развития. Чтобы избежать подсчета одного и того же кулачки дважды, напишите номер в последовательности на каждой куске с постоянным маркером на внешней стороне флакона.
    7. Начиная с 9-го дня, подсчитайте ежедневно число новых взрослых, пока не появилось больше взрослых, и сообщите об этом в таблице развития.
    8. Из этих необработанных данных, вычислить средний период личинки, средний период pupal, а также различия в процентах от каждого лечения в отношении контроля.
    9. Проведите три независимых эксперимента для каждой группы мух, используя не менее 5 флаконов для каждой группы лечения.
    10. Выполните статистический анализ для сравнения различных групп.
  2. Протокол эклозионного ассиса 2
    1. Задняя молодая и здоровая самка (около 150) и самец (около 50) мухи на коллекционной клетке(Таблицаматериалов) с агар-помидорной средой, дополненной дрожжевой пастой свежего пекаря (3 г пекарских дрожжей в 5 мл воды), после чего называется укладка лотка, в течение 2 дней при 25 градусах Цельсия.
    2. В течение этих 2 дней, позволяют мухам акклиматизироваться к клетке в темном, тихом месте, перед началом сбора яиц, и изменить укладку лоток два раза в день.
    3. На третий день сначала поменяйте поднос. После 1 ч замените поднос для укладки, отбросив эти отложенные яйца.
    4. Разрешить мухам отложить яйца в течение 2 ч и заменить свежим подносом для укладки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: К 3-му дню хороший поднос должен производить 100-200 яиц в 2 ч.
    5. Для каждой группы лечения, подготовить серию из трех 60 мм блюда, содержащие томатную кукурузную муку продукты питания дополняется соответствующей концентрации EDC или с растворителем в одиночку и сообщить о каждой серии в таблице времени развития. Кроме того, если предпочтительнее, используйте флаконы вместо блюд.
    6. Аккуратно подобрать яйца под микроскопом с помощью кисти или зонда и передать их в верхней части среды в каждом блюде / флакон. Для того, чтобы облегчить подсчет, на кладущих подносах, расположить яйца в 5 групп по 10 каждый и передать их по одному.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаг 6.2.4 столько раз, сколько необходимо для получения достаточного количества эмбрионов.
    7. Размещать все эти блюда/флаконы при 25 градусах Цельсия. Храните также каждый кладучий лоток при 25 градусах Цельсия, и подсчитайте общее количество отложенных яиц.
    8. После 24-30 ч проверьте каждое блюдо/флакон под стереомикроскопом и подсчитайте как количество белых, неоплодотворенных яйцеклеток, так и количество темных мертвых эмбрионов.
    9. Вычтите количество белых, неоплодотворенных яйцеклеток из 50 перенесенных яйцеклеток, чтобы получить значение «общей эмбрионов» на блюдо/флакон. Количество темных мертвых эмбрионов может быть использовано для определения потенциальных токсических эффектов EDC во время эмбриогенеза.
    10. Повторите шаги 6.1.6-6.1.10 Протокола эклозионного опрокидки 1.

7. Протокол продолжительности жизни

  1. Установите 20 флаконов мух с 8 самками и 4 самцами и дом на 25 градусов по Цельсию в CM (10 мл каждый).
  2. Через 4 дня отбросьте мух и поместите флаконы обратно в инкубатор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: эти мухи могут быть использованы, чтобы начать снова, чтобы получить другие возрастные синхронизированные когорты мух.
  3. Во второй половине дня 9 дня удалите всех вновь вылетных мух из флаконов и верните флаконы в инкубатор.
    Примечание: несколько взрослых должны начать притежовать уже на девятый день; отбрасывание этих мух позволяет собрать максимальное количество синхронизированных мух, избегая небрежного выбора ранних возникающих.
  4. 16-24 ч спустя, передача взрослых мух (1 день) обоих полов в четыре группы 250 мл бутылки, содержащие AM пищи дополняется тремя различными концентрациями EDC и один с растворителем в одиночку. При необходимости соберите еще одну партию на следующий день.
  5. Поддерживайте мухи при 25 градусах по Цельсию в течение 2-3 дней, чтобы позволить им спариваться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: день передачи в AM пищевые флаконы соответствует первому дню взрослой жизни.
  6. После двух-трех дней сортируйте каждую когорту мух по полу на две группы под легкой анестезией CO 2. Случайно разделить каждый пол на пять флаконов на лечение при плотности 20 человек на флакон, пока Есть три реплики 5 параллельных флаконов для каждого пола на каждое лечение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с небольшими группами мух, чтобы предотвратить возможные долгосрочные проблемы со здоровьем из-за длительного воздействия CO2.
  7. Подготовьте таблицу продолжительности жизни, в которой количество погибших мух вычитается из числа выживших мух до предыдущей передачи, таким образом, чтобы автоматически получить число выживших при каждом переводе.
  8. Передача летает в новые флаконы, содержащие соответствующие продукты питания каждые 3 дня в то же время и проверить на смерть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: передача должна проходить без анестезии, которая может иметь долгосрочное негативное влияние на долголетие мух.
    1. При каждом переводе фиксируются возраст мух и количество погибших мух.
      ПРИМЕЧАНИЕ: количество выживших мух автоматически рассчитывается в таблице, но рекомендуется проверить его визуально. Мухи, которые случайно как бежать или умереть во время передачи не следует рассматривать. Будьте осторожны, чтобы не считать дважды мертвых мух, перевозимых в новый флакон отчетности эту записку в таблице.
    2. Повторите шаги 7.8 и 7.8.1 до тех пор, пока все мухи не умрут.
  9. Для каждой группы лечения, создать кривую выживания, как показано на рисунке 6, для того, чтобы отобразить вероятность выживания мухи в любое конкретное время.
  10. Выполните три независимых эксперимента для каждой группы лечения мух, используя 100 новых закрытых мух для каждого эксперимента.
  11. Подготовьте таблицу, в которой можно будет сообщить о средней продолжительности жизни (средние дни выживания всех мух для каждой группы), половину времени смерти (период времени в днях, необходимых для достижения 50% смертности) и максимальную продолжительность жизни (максимальное количество дней, необходимых для достижения 90% смертности).
  12. Рассчитайте различия в процентах между каждой группой лечения по отношению к контрольной группе.
  13. Выполните статистический анализ для сравнения различных групп лечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом разделе основные шаги вышеуказанных протоколов сообщаются в виде упрощенных схем. Учитывая, что мухи, как правило, чтобы избежать неприятных соединений, первое, что нужно сделать, это, чтобы рассказать вкус выбранного EDC. Это можно сделать путем смешивания пищевой краситель (например, красный пищевой краситель No 40)35 с пищей, дополненной выбранным EDC в различных дозах или с растворителем в одиночку. Мухи, питаемые этими носителями, рассматриваются под стереомикроскопом, и потребление пи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Плодовая муха D. melanogaster широко используется в качестве модели системы in vivo для изучения потенциальных последствий экологических EDC, таких как DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33, и EE234. Несколько причин привели его использование в качестве модели в этой области исследований. Помимо своих неоспоримых преиму...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Орсолину Петильо за техническую поддержку. Авторы благодарят доктора Марианасорию Алетту (CNR) за библиографическую поддержку. Авторы благодарят д-ра Густаво Дамиано Миту за то, что он познакомил их с миром EDC. Авторы благодарят Leica Microsystems и Pasquale Romano за помощь. Это исследование было поддержано проектом PON03PE-00110-1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Комманент: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Проект PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NanoTECNOLOGIE".

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
17α-этинилэстрадиолSigmaE4876-1G
агар для Drosophila mediumBIOSIGMA789148
Bisphenol ASigma239658-50G
Bisphenol AFSigma90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl EtherSigma
Флаконы с дрозофиламиBIOSIGMA78900825 мм x 95 мм
Флаконы с дрозофиламиBIOSIGMA78900929 мм x 95 мм
Флаконы с дрозофиламиKaltek18722 мм x 63 мм
Клетка для сбора эмбрионовCraftsPlexiglass цилиндр (12,5 мм x 7 см) с открытым концом и другим концом, закрытым прямоугольным основанием, в которое имеется прорезь, позволяющая вставить специальные лотки для укладки
этанолаFLUKA2860
EtherizerCraftsцилиндрический стеклянный контейнер с ватной пробкой
Стеклянная бутылка250 мл Бутылки
Стеклянные флаконы Стеклянные флаконыMicrotechST 10024Плоское дно Трубка 100 x 24
Ручной блендер PimmyArieteкухонный комбайн
Instant Успех дрожжейESKAПорошкообразные дрожжи
Поднос для укладкиПоделкииз оргстекла Лотки (11 см х 2,6 см) в которые насыпать среду для укладки
Метил4-гидроксибензоатSIGMAH5501
Чашка Петри Falcon35101660x5
Красный краситель No 40SIGMA16035
Стереомикроскоп со светодиодной подсветкойLeicaS4E
СахарозаHIMEDIAMB025
Томатный соусCirio

Ссылки

  1. Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
  2. Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
  3. Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
  4. Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
  5. Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
  6. Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
  7. Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
  8. Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
  9. Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. , United Nations Environment Programme and the World Health Organization. (2013).
  10. Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
  11. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
  12. Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
  13. Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
  14. Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
  15. Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
  16. Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
  17. Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
  18. Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
  19. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
  20. Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
  21. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
  22. Weltje, L. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. Matthiessen, P. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 100-115 (2013).
  23. Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
  24. Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
  25. Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
  26. Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 899-939 (1993).
  27. Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
  28. Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
  29. Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
  30. Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
  31. Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
  32. Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
  33. Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
  34. Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
  35. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
  36. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
  37. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
  38. Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
  39. Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
  40. Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
  41. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
  42. Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
  43. Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
  44. Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38(2009).
  45. Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
  46. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
  47. Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068(2013).
  48. Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

EDC
Методы тестирования эндокринных нарушений в Drosophila меланогастер
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.