Этот метод обеспечивает основу для изучения включения экзогенных жирных кислот из сложных источников хозяина в бактериальные мембраны, в частности золотистый стафилококк. Для этого описаны протоколы для обогащения частиц липопротеинов из куриного яичного желтка и последующего профилирования жирных кислот бактериальными фосфолипидами с использованием масс-спектрометрии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция частиц липопротеинов из куриного яичного желтка для изучения бактериального патогена жирной кислоты Инкорпорации в Мембрана фосфолипиды
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Золотистый стафилококк и другие грамположительные патогены включают жирные кислоты из окружающей среды в мембранные фосфолипиды. Во время инфекции, большинство экзогенных жирных кислот присутствуют в принимающих частиц липопротеинов. Сохраняется неопределенность в отношении резервуаров жирных кислот-хозяев и механизмов, с помощью которых бактерии извлекают жирные кислоты из частиц липопротеинов. В этой работе мы описываем протоколы для обогащения частиц липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) из куриного яичного желтка и определяем, служат ли ЛПНП резервуарами жирных кислот для S. aureus. Этот метод использует объективный липидомный анализ и куриные ЛПНП, эффективную и экономичную модель для исследования взаимодействий между ЛПЛ и бактериями. Анализ интеграции S. aureus экзогенных жирных кислот из ЛПНП проводится с использованием высокой разрешения/точной масс-спектрометрии и тандемной масс-спектрометрии, что позволяет охарактеризовать состав жирных кислот бактериальной мембраны и объективное выявление новых комбинаций жирных кислот, которые возникают в бактериальных мембранных липидах при воздействии ЛПНП. Эти передовые методы масс-спектрометрии предлагают беспрецедентную перспективу инкорпорации жирных кислот, раскрывая конкретные экзогенные жирные кислоты, включенные в фосфолипиды. Методы, изложенные здесь, адаптируются к изучению других бактериальных патогенов и альтернативных источников сложных жирных кислот.
Введение
Метициллин-резистентный S. aureus (MRSA) является ведущей причиной инфекции, связанной с здравоохранением, и связанная с этим устойчивость к антибиотикам является значительной клинической проблемой1,2,3. Поэтому разработка новых терапевтических стратегий является приоритетной задачей. Перспективная стратегия лечения грамположительных патогенов ингибирует синтез жирных кислот, требование для производства мембранного фосфолипида, который, в S. aureus, включает в себя фосфатидилглицерол (ПГ), лисил-ПГ, и кардиолипин4. В бактериях, произв....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол для обогащения частиц ЛПНП из куриного яичного желтка получен из Moussa et al. 200233.
1. Приготовление куриного яичного желтка для обогащения частиц ЛПНП
- Обезвить два больших куриных яйца, промыв скорлупу с 70% раствор атанола и дайте высохнуть.
- Обезврежете яичный сепаратор с помощью 70% раствора этанола и дайте высохнуть. Прикрепите яичный сепаратор на губу стакана среднего размера.
- Трещины каждое яйцо индивидуально в яйцо сепаратора и позволяют альбуман течь в стакан. Нетронутый яичный желток будет сохранен сепаратором.
- Вымойте яичный желток дв....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол для обогащения ЛПНП из куриного яичного желтка иллюстрируется на рисунке 1. Этот процесс начинается с разбавления всего яичного желтка солевом раствором и разделения твердых веществ яичного желтка, называемых гранулами из растворимых или плазменных фракций, содержащих ЛПНП(Рисунок 1)33. Содержание ЛПНП в плазменной фракции еще больше обогащается за счет осадков в размере 30-40 кДА --ливетинов
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
S. aureus включает экзогенные жирные кислоты в мембрану фосфолипидов27,32,43. Синтез фосфолипидов с использованием экзогенных жирных кислот обходит ингибирование FASII, но также изменяет биофизические свойства мембраны27,32,44. В то время как включение экзогенных жирных кислот в фосфолипиды грамположительных патогенов хорошо до.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не раскрытии информации.
Благодарности
Мы благодарим сотрудников лаборатории Hammer за их критическую оценку рукописи и поддержку этой работы. Д-р Алекс Horswill из Университета Колорадо школы медицины любезно при условии AH1263. Доктор Крис Уотерс (Chris Waters Laboratory) из Мичиганского государственного университета предоставил реагенты. Эта работа была поддержана Американской ассоциацией сердца грант 16SDG30170026 и стартовых средств, предоставляемых Мичиганского государственного университета.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Сульфат аммония | Fisher | BP212R-1 | ≥ 99,5% чистота |
| Инкубатор для клеточных культур | Thermo | MaxQ 6000 | |
| Centrafuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR, ротор F14-6x250 LE |
| Costar Пробирная пластина | Corning | 3788 | 96 лунок |
| Фильтровальная бумага | Schleicher & Schuell | 597 | |
| Большое куриное яйцо | Н/Д | Н/Д | Обычное купленное яйцо |
| Микропланшетный спектрофотометр | BioTek | Epoch 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus штамм AH1263 | Н/Д | /Д | Предоставлено Алексом Хорсвиллом из Университета Колорадо |
| Диализная трубка | Пирс | 68700 | 7,000 MWCO |
| Tryptone | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| 0,5 мм гранулы оксида циркония | Next Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24B | |
| Метанол (марка LC-MS) | Fisher | A4561 | |
| Хлороформ (марка реагента) | Fisher | MCX10559 | |
| Изопропанол (марка LC-MS) | Fisher | A4611 | |
| Dimyristoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850345C-25mg | |
| Бикарбонат аммония | Sigma | 9830 | ≥ Формиат аммония 99,5% чистоты |
| Sigma | 70221-25G-F | ||
| Xcalibur программное обеспечение | Thermo Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Масс-спектрометр Velos | Thermo Scientific | высокое разрешение/точность массы MS | |
| Agilent 1260 капиллярная ВЭЖХ | Agilent | ||
| SpeedVac Вакуумные концентраторы | Thermo Scientific |
Ссылки
- Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
- Noskin, G. A., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
