Здесь мы представляем протокол для свободно плавающей непрямой иммунофлуоресценции анализ на биопсии кожи разделов, что позволяет для выявления болезни конкретных вариантов конформации альфа-синуклеина, участвующих в болезни Паркинсона и несколько белков периферической нервной системы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ориентация Альфа Синуклеин Агрегаты в кожных периферных нервных волокон по свободно плавающей иммунофлуоресценции Анализ
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
На сегодняшний день для большинства нейродегенеративных заболеваний доступна только посмертная гистопатологическая диагностика. Для болезни Паркинсона (PD), диагноз по-прежнему опирается только на клинические признаки двигательной участия, которые появляются позже в течение болезни, когда большинство дофаминергических нейронов уже потеряны. Таким образом, существует острая потребность в биомаркере, который может идентифицировать пациентов в начале заболевания или на риск его развития. За последние несколько лет биопсия кожи оказалась отличным исследовательским и диагностическим инструментом для периферических заболеваний нервов, таких как небольшая клетчатка невропатии. Интересно, что небольшие волокна невропатии и альфа-синуклеин (Зин) нервных отложений были показаны биопсии кожи у пациентов PD. Действительно, биопсия кожи имеет большое преимущество быть легкодоступной, минимально инвазивной и безболезненной процедурой, которая позволяет анализировать периферические нервные ткани, склонные к патологии. Кроме того, возможность повторения биопсии кожи в ходе наблюдения за тем же пациентом позволяет изучать продольную корреляцию с прогрессированием заболевания. Мы создали стандартизированный надежный протокол для исследования наличия агрегатов «Syn» в волокнах нервов кожи пациента PD. Этот протокол включает в себя несколько коротких шагов фиксации, криотомосирование, а затем свободно плавающей иммунофлуоресценции двойное окрашивание с двумя конкретными антителами: анти протеин ген продукт 9.5 (PGP9.5), чтобы отметить кожные нервные волокна и анти 5G4 для обнаружения «Синтез агрегаты. Это универсальный, чувствительный и простой в исполнении протокола, который также может быть применен для ориентации других белков, представляющих интерес для нервов кожи. Способность маркировать агрегаты «Syn» является еще одним шагом вперед к использованию биопсии кожи в качестве инструмента для установления предсмертной гистопатологической диагностики PD.
Введение
Биопсия кожи приобрела большое значение в качестве диагностического иисследовательского инструмента в области неврологических расстройств 1. Действительно, эпидермис и дерма содержат обильные соматические сенсорные нервные волокна (миелинированные и немиелинированные), ноцицептивные свободные нервные окончания, сенсорные рецепторы и вегетативную инвенвацию потовых желез, сосудов, сальных желез и мышечных арфистых пилорумов 2.
В середине 20-го века, установка для иммуногистохимии PGP9.5 антитела позволили доказательства обширной иннервации человеческой эпидермис кожи млекопитающих
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол был одобрен Кантональным комитетом по этике, и все зачисленные субъекты дали письменное информированное согласие на исследование.
1. Коллекция биопсии кожи
- Пусть квалифицированный врач выполняет биопсию кожи в соответствующих клинических условиях.
- Выберите область для выполнения биопсии кожи и очистить его с алкоголем тампон.
- Приготовьте обезостереженое раствор с 1 кубиком лидокаина 2%.
- С иглой параллельно области, вводят местную анестезию подкожно.
- После проверки эффекта анестезии, принять 3 мм одноразовый пунш и применять вращательное и деликатное понижательное давление, чтобы пов....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Следуя описанной процедуре(Рисунок 1), мы обнаружили ,Syn агрегаты, помеченные 5G4 антитела, в дермальных нервных фасциклов иннерватирования вегетативных структур PD пациентов. Морфология альфа-синуклеина появляется как пунктирный сигнал вдоль аксонов дермальных нервов(рисунок 2). Действительно, используя этот протокол в 19 PD пациентов и 17 контроля в биопсии кожи на трех анатомических сайте (шейка матки, бедра и дистальной ноги) мы обнаружили, что 5G4 было 81%.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы описываем свободно плавающий иммунофлуоресценционный анализ биопсии кожи для диагностики PD: он использует двойное иммуносохранение с анти-PGP9.5 антитела, panaxonal маркер, и анти-5G4, конформации конкретных антител, который признает агрегированной форме из «Син».
Большие преимущества биопсии кожи для диагностических целей в PD и, возможно, в других белковых конформанформальных расстройств являются: 1) прямой доступ к нервной ткани склонны к болезни с легкаю инвазивной техникой и, таким об.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Паркинсона Швейза и ABREOC (Консультативный совет по научным исследованиям Кантонале Энте Оспедедеро) за финансовую поддержку этого исследования.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 5G4 (античеловеческий &альфа; Syneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Мышь моноклональная |
| AlexaFluor 488 Козий антикролик IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 мг/мл |
| AlexaFluor 594 козий анти мышиный IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 мг/мл |
| раствор гидрофосфата натрия | Merk Millipore | 106586 | |
| этиленгликоль | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| глицерин | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-лизин моногидрохлорид | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| параформальдегид | Aldrich Chemistry | ||
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Кролик поликлональный |
| хлорид натрия | Sigma | S3014 | |
| Моногидрат дигидрофосфата натрия | Merck Millipore | 106346 | |
| натрия (мета)периодат | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| База Тризма Sigma | T1503 | ||
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Монтажный материал |
Ссылки
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
