Методическая статья

Оценка терапевтического ангиогенеза в модели Murine Hindlimb Ischemia

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59582

⸱

8 июня 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiovascular da Universidade de Lisboa, Lisbon School of Medicine of the Universidade de Lisboa, 2Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte, 3Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлена критическая экспериментальная модель ишемии задних конечностей, за которой следует батарея функциональных, гистологических и молекулярных тестов для оценки эффективности ангиогенной терапии.

Аннотация

Критическая ишемия конечностей (CLI) является серьезным заболеванием, которое влечет за собой высокий риск ампутации нижних конечностей. Несмотря на реваскуляризацию, являясь золотым стандартом терапии, значительное число пациентов с КЛИ не подходят ни для хирургической, ни для эндоваскулярной реваскуляризации. Ангиогенные терапии становятся вариантом для этих пациентов, но в настоящее время все еще находятся под следствием. Перед применением в людях, эти терапии должны быть проверены в животных моделях и его механизмы должны быть четко поняты. Модель ишемии задних конечностей (HLI) была разработана путем перевязки и иссечения дистальных внешних подвздошных и бедренных артерий и вен у мышей. Была собрана комплексная группа тестов для оценки воздействия ишемии и предполагаемых ангиогенных методов лечения на функциональном, гистологическом и молекулярном уровнях. Лазерный Доплер использовался для измерения потока и функциональной оценки перфузии. Ткань ответ был оценен путем анализа плотности капилляров после окрашивания анти-CD31 антитела на гистологических участках гастрокнемии мышц и измерения плотности залога сосуда после диафонизации. Выражение ангиогенных генов было количественно RT-PCR ориентации отдельных ангиогенных факторов исключительно в эндотелиальных клеток (ECs) после лазерного захвата микрорассечения из мышц гастрокнемии мышей. Эти методы были чувствительными в выявлении различий между ишемическими и неишемическими конечностями и между обработанными и необработанными конечностями. Этот протокол обеспечивает воспроизводимую модель CLI и основу для тестирования ангиогенных методов лечения.

Введение

Периферийное артериальное заболевание (ПАД) поражает преимущественно нижние конечности. PAD вызвана атеросклерозом, обструкцией артерий, которая может вызвать серьезное ограничение кровотока в нижних конечностях1. Прерывистая claudication является первым проявлением PAD и относится к мышечной боли при ходьбе. CLI является наиболее тяжелой стадии PAD, будучи диагностированы у пациентов, которые показывают ишемическую боль отдыха, язвы или гангрены2. Пациенты с CLI имеют высокий риск ампутации, особенно если не лечить3. В настоящее время реваскуляризация нижних конечностей (либо открытой хирургией, либо эндоваскулярной процедурой) является единственным способом спасти конечности. Тем не менее, около 30% пациентов CLI не подходят для этих процедур, по причинам, которые включают расположение поражений, картина артериальной окклюзии и обширной сопутствующих4,5. Таким образом, новые методы лечения необходимы для этих в противном случае неизлечимых пациентов, с продвижением ангиогенеза является стратегией под более интенсивным расследованием.

Перед тестированием на людях, эффективность и безопасность новых методов лечения in vivo должны быть рассмотрены в животных моделях. Несколько моделей были разработаны для изучения CLI, в основном путем индуцирования ишемии задних конечностей (HLI) у мышей6,7,8,9,10. Тем не менее, эти модели отличаются в нескольких аспектах, включая характер артерий, которые ligated и / или вырезаны и являются ли вены и нервы окружающих вскрыты, а6,7,8, 9,10. Взятые вместе, эти аспекты будут влиять на тяжесть ишемии реперфузии травмы в каждом животном, что делает результаты трудно сравнить. Поэтому крайне важно разработать эффективный протокол, в котором процедура индуцирования ишемии и оценка различных целей должны быть стандартизированы для оценки эффективности данной ангиогенной терапии. Экспериментальный протокол, предназначенный для охвата всех этих аспектов, обеспечит всестороннее понимание механизмов, с помощью которых ангиогенные методы лечения оказывают свое воздействие, и меру их эффективности при каждом из своих результатов. Две различные работы, недавно опубликованные нашей командой являются хорошим примером11,12, в котором различные подходы, чтобы вызвать терапевтический ангиогенез были оценены с использованием того же протокола, который будет описан с более подробно в этом Протокол.

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы описать воспроизводимую экспериментальную модель, которая может имитировать эффекты CLI и заложить экспериментальную основу для всесторонней оценки функциональных, гистологических и молекулярных эффектов предпологаемых ангиогенных Агентов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры животных в соответствии с Директивой 2010/63/EU и были одобрены Институциональным органом защиты животных и лицензированы DGAV, португальским компетентным органом по защите животных (лицензионный номер 023861/2013)

ПРЕДЕКТО: Некоторые химические вещества, используемые в протоколах, являются токсичными и вредными. Пожалуйста, используйте все соответствующие методы безопасности и средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторное пальто, брюки в полный рост и обувь с закрытыми ностями)

1. Мурин модель ишемии задних конечностей

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводятся на 22-недельных мышах C57BL/6.

  1. Подготовка решений
    1. Подготовка анестезиологического раствора
      Примечание: Эта анестезия комбинация (медетомидин и кетамин) обеспечивает до 30 мин иммобилизации и хирургическое окно 15 мин. Эффект может быть возвращен администрацией atipamezole.
      1. С чистой, 1 cc шприц, снять 1 мл мететомидина (1 мг / кг массы тела), устранить пузырьки воздуха для точных измерений, и добавить его в 15 мл сокол трубки.
      2. С чистой, 1 куб.см шприц, снять 0,75 мл кетамина (75 мг / кг массы тела), устранить пузырьки воздуха для точных измерений и добавить его в 15 мл сокол трубки, содержащей медетомидин.
      3. Добавьте 8,25 мл стерильного сольника (0,9% NaCl), чтобы получить 10 мл анестезирующегося раствора.
      4. Определите трубку с названием соединений, смешанной датой и сроком годности.
      5. Хранить в темноте при 4 градусах По Цельсию.
    2. Подготовка антиседативного раствора
      1. С чистой, 1 куб.см шприц, снять 1 мл атипамезола (5 мг / кг массы тела), устранить пузырьки воздуха для точных измерений, и добавить его в 15 мл сокол трубки.
      2. Добавьте 9 мл стерильного сольника (0,9% NaCl), чтобы получить 10 мл реверсивного раствора.
      3. Определите трубку с названием соединений, смешанной датой и сроком годности.
      4. Хранить в темноте при 4 градусах По Цельсию.
    3. Подготовка послеоперационного обезболиваемого раствора
      1. С чистым, 1 см шприц, снять 0,5 мл бупренорфина (100 л/15-30 г массы тела), устранить пузырьки воздуха для точных измерений, и добавить его в 15 мл сокол трубки.
      2. Добавьте 9,5 мл стерильного сольника (0,9% NaCl), чтобы получить 10 мл обезболивающегося раствора.
      3. Определите трубку с названием соединений, смешанной датой и сроком годности.
      4. Хранить в темноте при 4 градусах По Цельсию.
  2. Хирургическая индукция ишемии заднеlimb
    1. Для этого вмешательства необходимы хирургические инструменты: заостренные щипцы, пружинные ножницы, держатель офтальмологических игл, хирургические ножницы и держатель иглы. Стерилизовать все хирургические инструменты в автоклаве перед использованием. Используйте ватные тампоны для вскрытия подкожного жира.
    2. Загрузите шприц с анестезией раствор перед проведением мыши.
    3. Сдержите животное, применяя силу за ушами к сетке клетки, удерживая как можно больше кожи, чтобы держать мышь неподвижной.
    4. Держите животное наклоненным с опущенной головой и выполнять интраперитонеальную инъекцию анестезии раствор, сохраняя шприц под углом 45 "с телом мыши.
    5. Проверьте отсутствие рефлектов отмены педалей, оцените глубину анестезии.
    6. Удалите волосы с правой задней конечности с помощью электрической бритвы. Используйте хлоргексидин дезинфицирующее мыло скраб для подготовки кожи. Используйте чистое бумажное полотенце, чтобы удалить пены. Нанесите хлоргексидин хирургического скраб и защитить область кожи с стерильной драпировки перед транспортировкой мышей в хирургический стерильный набор.
    7. Поместите животное в dorsal decubitus и сдержать его с четырьмя конечностями разрознены и обеспечены скотчем.
      ВНИМАНИЕ: Выполните процедуру на нагретой подушечке, чтобы поддерживать стабильную температуру тела животного; хирургическая процедура выполняется с помощью рассечения микроскопа при 10x или 20x увеличение.
    8. Нанесите антисептический раствор хлоргексидина с использованием стерильной марли для завершения подготовки кожи. Используя хирургическое лезвие скальпеля no 11, выполняйте 1-сантиметровый разрез кожи над бедренной костью правой задней конечности.
    9. Блант вскрыть подкожный жир подвергая нервно-сосудистый пучок. Используя остроконечные щипцы, пружинные ножницы и держатель офтальмованной иглы, откройте мембранусную илио-бедренную оболочку, чтобы разоблачить дистальные внешние подвздошные и бедренные сосуды.
    10. Вскрыть и отделить сосуды (артерии и вены) от нерва. Использование 7,0 неабсорбируемых полипропиленовых швов ligate дистальных внешних подвздошной артерии и вены и дистальной бедренной артерии и вены.
    11. Переувайте сегмент илио-бедренной артерии и вен между дистальными и проксимальными узлами с помощью пружинных ножниц.
    12. Закройте разрез абсорбируемым швом (например, шов 5,0 Vicryl).
    13. Загрузите шприц антиседативным раствором и используйте тот же метод, описанный в 1.2.3 и 1.2.4 для выполнения внутриперитонеальной инъекции антиседативного раствора.
  3. Послеоперационный мониторинг
    ПРИМЕЧАНИЕ: за животными тщательно наблюдают сяочить каждые 15-20 минут, чтобы убедиться, что все животные хорошо оправяются от антиседативных; анестезирует животных никогда не оставляют без присмотра.
    1. Оценить восстановление после анестезии: 1) контролировать скорость и глубину дыхания; 2) оценить животные рефлексы (педаль и положение глаз)
    2. Выполняйте подкожную инъекцию послеоперационной анальгезии каждые 8-12 ч.
    3. Мониторинг животных ежедневно после операции записи краткое описание состояния здоровья животного и внешний вид места операции, убедитесь, что все швы закрыты.
    4. Повторношовиразрез разреза, если происходит опознавание. Если неудача, нанесите пленку барьера кожи на разрез для защиты от мочи, фекальные выделения, трение и сдвига кожи и, чтобы помочь процессу заживления.

2. Оценка ангиогенного эффекта

ПРИМЕЧАНИЕ: После индукции ишемии, применять терапевтический агент в исследовании и достичь следующих процедур. Меры, предпринятые в других точках времени, подробно описаны в соответствующем разделе.

  1. Лазерная доплеровская перфузионная визуализация
    1. Удалите волосы с обеих задних конечностей за день до анализа с помощью электрической бритвы с последующим кремом для депиляции.
    2. Анестезируйте мышей с помощью анестезируемого раствора.
    3. Поместите животное на грелку 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут, чтобы гарантировать, что температура не изменится во время процедуры
    4. Поместите животное в положение на спине с ногами, закрепленными в расширенном положении. Измерьте расстояние между правыми и левыми ногами и ногами для каждого животного, так как позиционирование животного должно быть одинаковым всякий раз, когда процедура должна быть повторена, чтобы следовать изменениям в перфузии задних конечностей с течением времени.
    5. Начните получать данные с помощью лазерного доплероводного перфузийного изображения.
    6. После завершения приобретения, вернуть анестезию с анти-седативным раствором.
    7. Откройте программное обеспечение для анализа изображений и нарисуйте область интереса (ROI) вокруг ишемической hindlimb и сопоставимой рентабельности инвестиций вокруг неишемической hindlimb.
    8. Наблюдайте значения потока и определите перфузию как отношение перфузии в ишемической конечности к тому в неишемической конечности. Изменения в соотношении перфузии измеряются с течением времени.
  2. Иммуногистохимия и анализ плотности капилляров
    1. После анестезии, пожертвовать мышей шейки матки дислокации.
    2. Для сбора гастрокнемиозных мышц обеих ног, во-первых, удалить кожу с обеих задних конечностей.
    3. Определите ахиллово сухожилие и отделите сухожилие от кости с помощью 11-лезвия скальпеля.
    4. Держите ахиллово сухожилие и отделить мышцы от голени и малоберцовой кости до коленного сустава с пружинными ножницами.
    5. Отделить бицепс фемориса от гастрокнемии мышцы.
    6. Используйте пружинные ножницы, чтобы сократить вставки гастрокнемии мышц на уровне коленного сустава.
    7. Поместите собранные гастрокнемиозные мышцы в поперечную ориентацию на небольшой пробковый диск с помощью 10% трагаканта.
    8. Привязать заморозить образцы в жидком азоте охлажденный иопентан и хранить их при -80 градусов по Цельсию до секции.
    9. Вырезать 7 мкм участки мышц образцы на криостат и смонтировать на стеклянных слайдах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
    10. Исправьте стеклянные горки в бутылке, содержащей охлажденный чистый ацетон (примерно 50 мл) в течение 10 мин, при -20 градусов по Цельсию.
    11. Добавьте перекисовую перекистину водорода 0,3%, разбавленный метанолом (50 мл) в течение 30 мин при комнатной температуре.
    12. Дважды вымойте фосфатно-буферизированный солен (PBS) (50 мл) в общей сложности 10 мин.
    13. Используйте гидрофобную ручку вокруг секций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование гидрофобной ручки позволяет уменьшить количество растворов, израсходованных во время протокола. Для всех инкубаций используйте 100 л всех растворов, на секцию.
    14. Нанесите блокирующий раствор 5% сыворотки кролика в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре.
    15. Инкубировать образцы в течение 1 ч при комнатной температуре с анти-CD31 крысы моноклонального антитела разбавленного в 1:500 в 1 % бычьего сыворотки альбумина (BSA) в PBS.
    16. Вымойте три раза в PBS в общей сложности 30 минут.
    17. Добавить вторичные биоинтиниляции кролика анти-крысы IgG антитела в 1:200 в 1% BSA в PBS и 5% кролика сыворотки в течение 30 минут при комнатной температуре.
    18. Вымойте в PBS, как и раньше, и добавить помечены avidin-конъюгированный комплекс пероксидазы в течение 30 минут при комнатной температуре.
    19. Промыть 3 раза в PBS в течение 5 мин и добавить диаминбензидин (DAB) пероксидазы подстрат комплект еще 5 мин.
    20. Противопокой разделы с гематоксилином в течение 10 с перед монтажом.
    21. Измерьте плотность капилляров с помощью вертикального яркого поля микроскопа (т.е. количество капилляров на количество миоцитов) в 2 различных участках 4 различных анатомических областей в каждом образце.
  3. Контрастный агент перфузии
    1. Анестезируйте мышей с помощью анестезируемого раствора.
    2. Выполните среднюю лапаротомию с помощью лезвия скальпеля номер 15.
    3. Выставляют брюшную аорту и каву чонду вену, после втягивания боковой тонкой кишки и использования пружинных ножниц.
    4. Вставьте один 26-калиберный катетер, черепно в брюшную аорту, а другой в каудальную полу вены в том же направлении.
    5. Безопасные катетеры на месте с помощью 5/0 шелковый шов для выполнения пребывания шов.
    6. Вымойте сосудистую систему сольистым раствором 37 градусов, содержащим гепарин (500 единиц/100 мл), витуемым в брюшную аорту с помощью шприца 10 мл. Продолжайте нежную перфузию до тех пор, пока не будет видно четкое решение, выходящее из катетера, помещенного внутрь каудальной полы вены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для промывки сосудистой системы взрослой крысы требуется от 30 до 40 мл гепаринов.
    7. Вводят смесь аденозина (1 мг/л) и папаверина (4 мг/л) в течение 2 мин.
    8. Вводят в аортатический катетер 10 мл смеси 50% сульфата бария и 5% желатина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен храниться при 60 градусах Цельсия, чтобы избежать утолщения.
    9. Оставьте мышей при - 4 градуса х, по крайней мере 4 ч, для того, чтобы сосудистый литые затвердеть.
    10. Удалите кожу из нижней части тела каждой мыши.
  4. Диафонизация - Техника Спалтехольц
    1. Исправить мышей путем погружения в 10% раствор формальдегида, по крайней мере 72 ч.
    2. Отбеливайте мышей путем погружения в 30% раствор перекиси водорода в течение 24 ч.
    3. Обезвоживать мышей с помощью техники замены замораживания. Эта методология состоит из представления мышей последовательных проходов (в среднем четыре) чистого ацетона при - 20 градусов по Цельсию на 24 ч каждый.
    4. Уточните мышей, погрузив его в раствор, содержащий смесь 100% бензил бензоат и 100% метил-салицилат в пропорции 3:5 (эта смесь также известна как раствор Spalteholz) 13.
    5. Оставьте мышей погруженными в раствор Spalteholz внутри в вакуумной камере, пока он не станет диафрагмы, которая обычно занимает от 5 до 7 дней.
    6. Замените раствор, если стемнеет до того, как образец станет ясным.
  5. Количественная оценка сосуд
    1. Наблюдайте за мышами, подвешенными в растворе Spalteholz под трансиллионом, с помощью стереотаксического микроскопа. Используйте микрохирургические щипки, чтобы аккуратно схватить и переместить его.
    2. Фотографируй все конечности с помощью цифровой камеры, подключенной к микроскопу.
    3. Получить все конечности фотографии с помощью соответствующего программного обеспечения.
    4. Выполните ручную сегментацию сосудов, выделяя их с помощью соответствующего программного обеспечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сосуды-сосуды определяются в соответствии с определением Лонгленда, определенным стеблем, средней зоной и повторно абитуриентом, диаметром от 20 до 300 мкм, за исключением бедренных, сафенозных и поплиновых артерий и всех венозных структур.
    5. Определите ROIs в каждой мыши в той же анатомической области в аддуктора, окружающих и ниже хирургического окклюзии.
    6. Количественная плотность сосуда (CVD) в эквивалентной рентабельности инвестиций, соответствующая 20% от общей площади конечностей. ССЗ рассчитывается как соотношение между сосудистой областью и областими ROIs. Все измерения плотности выполняются с помощью программного обеспечения ImageJ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагается, что значение ССЗ неишемической конечности для каждой мыши соответствует 100%, чтобы исключить изменения в процедурах анатомии, перфузии или диафонизации. Таким образом, процент ССЗ в ишемической конечности был рассчитан по отношению к неишемическому.
    7. Определить процент увеличения ССЗ, как разница между сДЗ процент между ишемической и неишемической конечностей.
  6. Лазерный захват микрорассечения капилляров
    1. После анестезии, пожертвовать мышей шейки матки дислокации.
    2. Для сбора гастрокнемиозных мышц обеих ног, удалить кожу с мышей обех задних конечностей.
    3. Определите ахиллово сухожилие и отделите сухожилие от кости с помощью 11-лезвия скальпеля.
    4. Держите ахиллово сухожилие и отделить мышцы от голени и малоберцовой кости до коленного сустава с пружинными ножницами.
    5. Отделить бицепс фемориса от гастрокнемии мышцы.
    6. Используйте пружинные ножницы, чтобы сократить вставки гастрокнемии мышц на уровне коленного сустава.
    7. Поместите собранные гастрокнемиозные мышцы в поперечную ориентацию на небольшой пробковый диск с помощью 10% трагаканта.
    8. Привязать заморозить образцы в жидком азоте охлажденный иопентан и хранить их при -80 градусов по Цельсию до секции.
    9. Вырезать на криостат 12 мкм разделы мышц образцы и смонтировать на стеклянных слайдах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для защиты РНК возьмите предварительно охлажденный слайд и коснитесь задней стороны слайда пальцем (перчатками), чтобы согреть только область для размещения раздела. Передача раздела от криостата нож, касаясь с разогретой области и сухой при -20 градусов по Цельсию в криостат в течение 2-3 мин. Протокол можно приложить здесь.
      1. Исправьте стеклянные горки в бутылке, содержащей охлажденный чистый ацетон (примерно 50 мл) в течение 5 мин при -20 градусов по Цельсию и высушите их.
      2. Используйте гидрофобную ручку вокруг секций.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Использование гидрофобной ручки помогает сократить количество растворов, потраченных во время протокола. Для всех инкубаций используйте 100 л всех растворов, на секцию.
      3. Регидратировать с 2 M NaCl / PBS при 4 КС и инкубировать образцы на ночь при 4 КС с анти-CD31 крысмоноклональных антител в 1:500 в 2M NaCl / PBS.
      4. Вымойте дважды в 2M NaCl/PBS в общей сложности 6 мин.
      5. Добавить вторичное биоинтинилапотированное анти-крыса кролика IgG антитела в 1:200 в 2M NaCl / PBS и 5% кролика сыворотки в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия.
      6. Вымойте в 2 M NaCl /PBS, как и раньше, и добавить помечены avidin-конъюгированный комплекс пероксидазы в течение 30 минут при 4 кв С.
      7. Промыть и добавить DAB пероксидаза подлодки комплект для 5 мин.
      8. Обезвоживать участки в ледяной 90% этанола следуют 100% этанола и оставить их высохнуть.
      9. Рассекать 10 000 капилляров на мышей с помощью лазерной системы микродиссекции оснащены импульсным твердотельным лазером 355 нм и катапульты расчлененных капилляров в микрофуг трубки клея-шапка.
  7. Экстракция РНК, синтез кДНК, предусилительация и РТ-ПЦР
    1. Изолировать общую РНК из микрорассеченных капилляров с помощью соответствующего комплекта, общая полученная РНК составляет от 1,5-3 нг/Л.
    2. Используйте набор синтеза кДНК для синтеза и два раунда предварительного усиления, используя грунтовки, описанные в таблице 1.
    3. Выполните RT-PCR для тех же целей, описанных на предыдущем этапе. Используйте программу, состоящую из первоначального шага денатурации на 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем 50 циклов при 95 градусах по Цельсию в течение 15 с и при 60 градусах по Цельсию в течение 1 мин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя описанный протокол, мезенхимальные стволовые клетки пуповины и низкодозное ионизирующее излучение (LDIR) были протестированы как индиантные ангиогенные терапии 11,12. Лазерные показания перфузии доплера были получены до индукции ишемии и в заранее определенные временные точки, начиная от непосредственно после индукции ишемии до 45 дней после ишемии. Пролифынные показания с помощью лазерного доплера были записаны как цветные изображения, при этом перфузи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Murine модели CLI в основном состояли в перевязке бедренной артерии просто дистальный к происхождению profunda бедрарис 4,5,6,7,8,9. Это показало, чтобы оставить большую часть залога циркуляции нетронутыми, который восстанавливает приток крови к конечности в течение 7 дней 9. Удаление залоговой кровати...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Хосе Рино и Танию Карвалью, руководителей Биоimaging фонда и гистологии и сравнительной патологии лаборатории Института Медицины Молекулярной Jo'o Лобо Antunes, соответственно. Мы также благодарим Вячеслава Сущика из кафедры анатомии Новой медицинской школы/Факулдаде-де-Сьончиас Медикас, Университет Нова-де-Лисбоа.

Справка о финансировании: проект, финансируемый UID/IC/0306/2016 Funda'o para a Ci'ncia e a Tecnologia. Паула де Оливейра поддерживается стипендией (SFRH/BD/80483/2011) от Фунданьо пара Ci'ncia e Tecnologia.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
7500 Быстрая ПЦР в реальном времениПрикладной биосистемныйинструмент
ацетонМерк1000141000реагентом; Осторожно - легковоспламеняющийся
АденозинВальдефарм
Реактив АтипамезолОрионPharmaРеактив
сульфат бария (Микропака)Геберт8671404 (ссылка Infarmed)Реактив
БупренорфинРихтерФармаРеактив
Carl Zeiss Opmi-1 FC Хирургический микроскопCarl Zeiss, ГерманияПрибор
кДНК RT2 PreAMP набор для синтеза кДНКQiagen7335730реагент
Cryostat Leica CMLeica Microsystems3050SИнструмент
DAB пероксидазный субстратDAKO; Vector LaboratoriesK3468Реагент
Пероксидаза водородаMerk1072090250Реагент; Осторожно - ноциф
гидрофобной ручкиDako411121Реактив; Осторожно - токсичный
кетамидорRichterpharmaCN:580393,7 630/01/12 DfvfРеагент
Лазерный допплеровский перфузионный имиджер moorLDI2-HIRMoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK5710Инструмент
Leica DM2500 вертикальный светлопольный микроскопLeica MicrosystemsInstrument
MedetorVirbac037/01/07RFVPTРеагент
метанолVWRUN1230; Осторожно - токсичный и легковоспламеняющийся
ПапаверинЛабесфальРеактив
Пентано Иссо Мерк1060561000Реагент; Осторожно - легковоспламеняющиеся
Power SYBR® GreenApplied Biosystems4309155Реагент
Очищенный крысиный антимышиный CD31Pharmingen550274Реагент
RNeasy Micro KitQiagen74004Реагент
Surgic-Pro 6.0Medtronic (Coviden)VP733XШовный материал
VECTASTAIN ABC HRP Kit (Пероксидаза, Rat IgG)Vectastain ABC kit; Vector LaboratoriesPK-4004Реагент
Vicryl5.0/ Vicryl 6.0Medtronic (Covidien)UL202/ UL101Шовный материал
Zeiss PALM MicroBeam Лазерная микродиссекционная системаCarl Zeiss, Германия1023290916Инструмент
Стереотаксический микроскопCarl Zeiss Микроскопия, ГерманияИнструмент
Цифровая камераLinuxинструмент
Реагент

Ссылки

  1. Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
  2. Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
  3. Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
  4. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
  5. Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
  6. Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
  7. Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
  8. Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
  9. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  10. Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
  11. Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
  12. Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145(2016).
  13. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD31

Похожие статьи