Методическая статья

Определение плотности bile Duct в мышечной печени

DOI:

10.3791/59587

⸱

30 апреля 2019 г.

 , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем довольно простой и чувствительный метод для точной количественной оценки плотности желчных протоков в печени мыши. Этот метод может помочь в определении воздействия генетических и экологических модификаторов и эффективности потенциальных методов лечения в мышиных моделях желчных заболеваний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышь широко используется в качестве образцового организма для изучения желчных заболеваний. Для оценки развития и функционирования желчной системы используются различные методы, в том числе химия сыворотки, гистологический анализ и иммуностохинирование для конкретных маркеров. Хотя эти методы могут предоставить важную информацию о желчной системе, они часто не представляют полную картину желчных протоков (BD) дефектов развития всей печени. Отчасти это связано с надежной способностью печени мыши слива желчи даже у животных со значительными нарушениями в желчных развития. Здесь мы представляем простой метод для расчета среднего числа BD, связанных с каждой вены портала (PV) в разделах, охватывающих все доли мутантов / трансгенных мышей. В этом методе, печи установлены и разделены в стереотипном порядке, чтобы облегчить сравнение между различными генотипами и экспериментальных условиях. BDs определены с помощью световой микроскопии цитокератин окрашенных холангиоцитов, а затем подсчитывается и делится на общее количество. присутствует в печени разделе. В качестве примера мы покажем, как этот метод может четко различать мышей дикого типа и мышиную модель синдрома Алагиля. Представленный здесь метод не может заменить методы, которые визуализируют трехмерную структуру желчного дерева. Тем не менее, он предлагает простой и прямой способ количественно оценить развитие BD и степень образования протоковых реакций у мышей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дерево желчных колдеев является важнейшей частью печени млекопитающих, что позволяет проход желчи из гепатоцитов в кишечник. Интрахепатические желчные протоки (БД) образуются холангиоцитами, которые отличаются от бипотенциальных гепатобластов через Нотч и TGF, сигнализирующих1,2. Правильная спецификация и приверженность холангиоцитов и их сборки в зрелые БД имеют решающее значение для развития внутрипеченочного желчного дерева. По мере того как печенка растет во время развития или на регенерации органа, желчьная система должна превратиться вдоль печенки для того чтобы обеспечить правильный дренаж желчи. Кроме того, ряд синдромных и несиндромных заболеваний приводят к нехватке внутрипечеачных БД3. Кроме того, ряд острых и хронических заболеваний печени приводят к так называемым протокическим реакциям в печени, которые определяются как наличие значительного количества клеток, которые выражают желчных маркеров, но не обязательно возникают из желчных клеток или формы патент BDs4. При многосистемном расстройстве синдром Алагиля (ALGS), гаплоинстоцификция нот лиганда jagged1 (JAG1) приводит к плохой формации BD и холестаз5,6. Наша лаборатория недавно показала, что ранее сгенерированный Jag1 heterozygous мыши линии7 является животной моделью BD скудости в ALGS8. В этой мышиной модели ALGS, холангиоциты все еще присутствуют. Тем не менее, они не в состоянии взять на себя обязательство по включению в зрелые, патентНые БД8. Поэтому анализ печени в модели скудности БД требует большего, чем кажущееся наличие или отсутствие холангиоцитов. Важно точно оценить степень присутствия зрелых БД в печени.

При анатомической патологии существуют принятые количественные методы оценкитого, существует ли нехватка БД 9. Например, исследования по ALGS у пациентов часто количественно BD портал вены (PV) соотношение путем анализа по крайней мере 10 портал судов на биопсию печени9,10. Анализ формы и общего наличия или отсутствия патентных БД, в сочетании с химией сыворотки, может предоставить ценную информацию о развитии БД у мышей11,12,13. Тем не менее, мыши могут потерять значительное количество BDs только скромное увеличение уровня билирубина сыворотки8. Соответственно, количественный метод, который оценивает количество БД, присутствующих на П.В. может обеспечить более прямой показатель степени скудности БД у мышей. В недавнем докладе, мы количественно количество БД на П.В. во всех долях печени и сообщили о значительном снижении соотношения БД к. в Jag1 /- животных8. В ходе нашего анализа, мы заметили, что, несмотря на значительные различия в степени воспалительных реакций и протоковых реакций, Соотношение БД к П.В. не показывает большой изменчивости8. Кроме того, количественная оценка соотношения БД к П.В. позволило нам продемонстрировать, что удаление одной копии гена гликозилтрансферазы Poglut1 в Jag1 '/-животные могут значительно улучшить их скудость BD8. На фоне Jag1/', условная потеря Poglut1 в сосудистых гладких мышечных клетках приводит к постепенному увеличению числа БД, что является скромным (20-30%) на P7, но становится видным у взрослых8. Опять же, этот метод позволил нам показать, что даже при P7, увеличение плотности BD у этих животных является статистически значимым. Следует отметить, что увеличение плотности BD в этом генотипе в возрасте четырех месяцев было подтверждено с помощью анализа бросок по миске, а также. 8 Эти наблюдения и другие отчеты, которые измеряли плотность BD в различных моделях мыши ALGS14,15 побудило нас включить этот метод в нашу общую стратегию для анализа желчных дефектов в различных мутантов и трансгенных мышей.

Здесь мы подробно простой метод, который может быть использован для изучения степени Скудобы BD в мышиных моделях заболевания печени(рисунок 1). В этом методе, совместное окрашивание с холангиоцитов маркеров цитокератин (CK) 8 и CK19 (в дальнейшем широкий спектр CK, wsCK) используется для визуализации BDs и неинкорпорированных холангиоцитов в печени мыши. Антитела против альфа-гладкой мышечной актина (ЗСМА) добавляется к окрашиванию для обозначения сосудов. Систематический анализ соотношения БД и П.В. в разделе, охватывающем все доли печени, гарантирует, что для каждого генотипа анализируется большое количество П.В. Так как наш метод опирается на количественную оценку BD s и PVs в 2D изображениях, он не подходит для изучения влияния данной мутации на 3D-структуру желчного дерева или целостность небольших желчных каналов. Тем не менее, он обеспечивает простую и объективную стратегию для исследователей для оценки желчного развития в мыши.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все животные были размещены в барьер животных объекта в Бейлор колледж медицины в институциональных животных уход и использование Комитета руководящих принципов и в соответствии с утвержденными протоколами животных.

1. Коллекция мышечной печени Ткань

  1. Приготовление мыши для сбора печени
    1. Эвтанизировать мышь с помощью изофлуран.
    2. Выполните вывих шейки матки мыши, чтобы обеспечить смерть.
    3. Сделайте поперечный разрез примерно на дюйм ниже грудной клетки.
    4. Вынаняем всю вентральную поверхность печени.
  2. Сбор печени мыши
    1. Осторожно, с помощью небольших ножниц, прорезать связки, соединяющие печень с другими органами в животе.
    2. Вырезать через общий BD, чтобы отделить печень от кишечника.
    3. Тщательно удалите печень, держась за желчный пузырь и сразу же поместите в трубку 50 мл, заполненную до трех четвертей на 4% параформальдегида (ПФА).

2. Фиксация и встраивание печени в Парафин

  1. Фиксации
    1. Исправить ткани печени в течение 48 ч в 4% ПФА при 4 КС.
    2. Вымойте ткань с 70% EtOH для 1 ч при 4 градусах Цельсия.
    3. Вымойте ткань дважды с 95% EtOH для 1 ч каждый при 4 c.
    4. Вымойте ткань дважды с 100% EtOH для 1 ч каждый при 4 градусах Цельсия.
  2. Очистка
    1. Вымойте ткань печени с клиринговым агентом(Таблица материалов) три раза в течение 30 минут каждый при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Печень должна чувствовать себя жесткой после третьей стирки.
  3. Встраивание в парафин
    1. Поместите тканевую кассету в тканевую форму в парафиновый воск на 3 явки, 30 мин каждый. Воск следует разогреть до 60 градусов по Цельсию.
    2. Заполните ткань плесени с парафиновой воск до трех четвертей высоты и держать на нагревательный блок при 60 градусов по Цельсию.
    3. Поместите печень в форму с брюшной стороной вверх.
    4. Аккуратно снимите форму с нагревательного блока.
    5. Поместите верхнюю часть кассеты на форму и сверху с горячей жидкой парафина.
    6. Разрешить плесень и блок для охлаждения до комнатной температуры на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань блоки теперь могут храниться при комнатной температуре.

3. Разделив ткани печени

  1. Подготовка блока для секционирования
    1. Поместите форму на лед в течение 5 минут, прежде чем удалить блок из формы.
    2. Поместите блок на лед с лабораторной бумагой ткани присутствует между блоком и льдом.
    3. Держите блок на льду, когда не секции для лучших результатов нарезки тканей.
  2. Секция блоков печени
    1. Использование микротома, начать с раздела через поверхностные, псовой стороне печени. Разделы должны быть 5 мкм.
    2. Проверьте поверхностные разделы под микроскопом вскрытия, чтобы убедиться, что разделы не стрижки или сложены.
    3. Возьмите раздел печени, который включает в себя доли caudate.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для некоторых блоков, вы будете иметь левую, медиальную, правую и caudate доли на том же ломтике ткани.
    4. Для тех блоков, где все четыре доли не присутствуют на одном слайде, продолжайте нарезать до тех пор, пока левая, медиальная и правая доли присутствуют на одном слайде.

4. Иммуногистохимия для WSCK и ЗСМА

  1. Обработка слайдов для иммуногистохимии
    1. Выберите один слайд для анализа генотипа.
    2. Вымойте слайд в течение 15 минут в Xylene, 100% EtOH, 95% EtOH и, наконец, 70% EtOH (3 х 5 мин в каждом растворе).
    3. Вымойте слайд в течение 5 минут в деионизированных H2O.
    4. Погрузите слайд в раствор извлечения антигена (Tris-based, высокий рН).
    5. Тепло под давлением в скороварке в течение 3 мин при 10 пси.
    6. Дайте слайду остыть до комнатной температуры (примерно 35 мин).
  2. Блокирование секций тканей
    1. Используя Перо Pap, напишите разделы на слайде.
    2. Нанесите фосфат-буферированный солен (PBS) - 0,1% Tween, чтобы покрыть секцию дважды, по 5 мин каждый.
    3. Сделать блокирующий буфер, смешивая нормальную сыворотку козы (NGS) в 1:50 в PBS 0,3% Тритон. Чтобы иметь достаточно буфера как для блокирования, так и для первичного применения антител, достаточно 100 кЛ на секцию.
    4. Нанесите 100 зл блокирующего раствора на секцию.
    5. Инкубировать слайды, покрытые блокирующим раствором при 4 градусах по Цельсию на 1 ч.
  3. Окрашивание для wsCK и ЗСМА
    1. Разбавлять анти-CK8 и анти-CK19 антитела16 (Исследования развития Hybridoma Bank, TROMA-I и TROMA-III, соответственно) 1:20 в блокирующем буфере для окрашива для wsCK. Разбавить анти-ЗСМА антитела17 (Таблица материалов) до 1:200 в том же буфере.
    2. Нанесите 100 л разбавленного раствора антитела, содержащего все три антитела к каждому разделу.
    3. Инкубировать слайды, покрытые раствором антител при цене 4 градусов по Цельсию на ночь.
    4. Вымойте слайды с PBS 0,1% Тритон три раза, 5 мин каждый.
    5. Разбавлять вторичные антитела (анти-крыса-Alexa488 и анти-мышь-Cy5) 1:200 в PBS 0,3% Тритон.
    6. Нанесите на слайды 100 л вторичного раствора антител, содержащего как вторичные антитела, так и вторичные антитела.
    7. Инкубировать при комнатной температуре 1 ч.
  4. DAPI ядерного окрашивания и монтажа
    1. Вымойте слайды три раза, 5 мин каждый.
    2. Нанесите 100 кЛ DAPI (1:3000) на каждый раздел в течение 10 минут.
    3. Применить Antifade Монтаж Medium (Таблица материалов) на слайды и место стеклянной крышкой на верхней части ткани разделов. Оставьте слайды на 4 градуса Цельсия на ночь. Печать слайдов на следующий день.
    4. Храните слайды при 4 градусах Цельсия и изображение в течение 1 недели после монтажа.

5. Визуализация и количественная оценка БД

  1. Изображение секций печени
    1. Перед визуализацией ослепите генотип образца с помощью одного из членов лаборатории. Убедитесь, что все файлы изображений лишены генотипа или другой конкретной идентифицирующей информации, кроме номера животного/образца.
    2. Используя флуоресцентный микроскоп, возьмите 20x изображения в 1x зум каждого раздела и убедитесь, что каждый фотовежжей через печень изображен. Включите левую, медиальную, правую и каудатские доли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы находим 60-90 порталных трактов на одно животное в зависимости от размера печени.
    3. Чтобы оповестить pVs, ищите sMA plus wsCK окрашивания. Структуры, которые являются положительными, но отсутствие wsCK окрашивания не являются портальные структуры.
  2. Идентификация и подсчет БД
    1. Создайте электронную таблицу со следующими столбцов: номер животных/образец, номер изображения, количество фотоаппаратов и количество BD.
    2. Проходя через каждое изображение, определить и записать количество фотоаппаратов на изображение.
    3. Определите патентные БД на каждом изображении по наличию холангиоцитов (wsCK), окружающих определяемый просвет. Структуры должны быть различны и отделены мезенхимом от других ячеек wsCK.
    4. Подсчитайте каждый патент BD и поместите в ту же колонку, что и номер изображения.
    5. Сделайте это для каждого изображения, сделанного PV.
    6. Рассчитайте сумму всех П.И. и всех БД в образце печени.
    7. Рассчитайте соотношение BD к П.В. для образца печени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранее мы задокументировали желчные дефекты в Jag1 '/-животных, мыши модели ALGS8. Чтобы определить соотношение BD к П.В., мы разделили печень мыши P30 и совместно запятнали их для CK8 и CK19 (wsCK) вместе с сосудистым маркером ЗСМА. Затем мы смогли сделать все п.п. в каждой из долей печени. Как показано на рисунке 2A, мы определили. как ЗМА-окрашенные сосуды, которые имеют смежные wsCK окрашивания (стрелы). Окрашенные в зСМА с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ развития и ремонта БД у мышей является важным инструментом в изучении патогенеза и механизма холестатических расстройств. Кроме того, разработка новых методов лечения частично зависит от создания воспроизводимого и предпочтительно поддающегося количественной оценке фенотипа. Текущий фенотипирование в моделях мышей обычно включает в себя химию сыворотки, гистологии печени и иммуностоинга для клеточного типа конкретных маркеров. Хотя эти методы генерируют ценную информацию о структуре и функции желчной системы, они ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH) (R01 GM084135 и R01 DK109982), пилот / Доступность премии от Техасского медицинского центра пищеварительной болезни центр под NIH P30 DK56338, и Алагил синдром Ускоритель премии от Медицинский фонд.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Изотезия (изофлуран)Henry Schein11695-6776-2
DesiccatorBel-Art16-800-552
10% PFAЭлектронная микроскопия Sciences15712
50 мл пробиркаThermoScientific339653
70% этанолDecon Laboratories2401
95% этанолDecon Лаборатории2801
100% этанолDecon Laboratories2701
HistoChoiceVWR Life SciencesОчищающий агентH103-4L
Omnisette Tissue CassetteFisher HealthCare15-197-710E
MacrosetteSimportM512
Paraplast X-TRAMcCormick Scientific39503002Плесень для парафиновой
тканиFisher Scientific62528-32
МикротомMicromHM 325
Superfrost Plus МикроскопСлайды Fisher Scientific12-550-15
КсилолFisher ScientificC8H10
Поиск антигена на основе трисаVector LaboratoriesH-3301
Pressure Плитабыстрого приготовленияLux Mini Mini
Pap PenLife Technologies8877
Полиоксиэтилен 20 Сорбитан Монолаурат (Tween-20)J.T. BakerX251-07
Октилфенолэтоксилат (Triton-X-100)J.T. BakerX198-07
Нормальная козья сывороткаJackson Immunoresearch005-000-121
anti-CK8Исследования развития Hybridoma BankTROMA-IИдентификатор реестра антител AB531826
анти-CK19Исследования развития Hybridoma BankTROMA-IIIИдентификатор реестра антител AB2133570
анти-αSMASigma AldrichA2547, клон 1A4
анти-крыса-Alexa488ThermoFisherA21208
анти-мыши-Cy5Jackson Immunoresearch715-175-151
DAPIVector LaboratoriesH-1000
22 x 50 мм2 микрозащитное стеклоVWR Life Sciences48393 059
Флуоресцентный микроскопLeicaDMI6000 B
KimwipesKimtech Science05511
VECTASHIELDVector LaboratoriesH-1000Защитная от выцветания монтажная среда

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
  2. Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
  3. Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
  4. Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
  5. Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235(1997).
  6. Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243(1997).
  7. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  8. Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
  9. Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
  10. Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
  11. Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
  12. Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
  13. McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
  14. Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
  15. Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
  16. Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
  17. Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
  18. Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526(2010).
  19. Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
  20. Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
  21. Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
  22. Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
  23. Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
  24. Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
  25. Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
  26. Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272(2012).
  27. Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
  28. Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SMA

Похожие статьи