Методическая статья

Взгляд наружу: Изоляция цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и белков

DOI:

10.3791/59590

⸱

27 мая 2019 г.

 , 
1Bioengineering and Synthetic Microbiology Group, Instituto de Investigação e Inovação em Saude, Universidade do Porto, 2Instituto de Biologia Celular e Molecular, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, 4Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описаны протоколы изоляции цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и изоляции их экзопротеомов. Обе процедуры воплощают ключевые шаги для получения полимеров или белков с высокой степенью чистоты, которые могут быть использованы для дальнейшего анализа или применения. Они также могут быть легко адаптированы в соответствии с конкретными потребностями пользователей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цианобактерии могут активно выделять широкий спектр биомолекул во внеклеточной среде, таких как гетерополисачхариды и белки. Идентификация и характеристика этих биомолекул может улучшить знания об их путях секреции и помочь манипулировать ими. Кроме того, некоторые из этих биомолекул также интересны с точки зрения биотехнологических применений. Описаны два протокола для легкой и быстрой изоляции цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и белков. Метод изоляции высвобожденных углеводных полимеров основан на обычных методах осадков полисахаридов в вацвовых растворах с использованием органических растворителей. Этот метод сохраняет характеристики полимера и одновременно позволяет избежать присутствия загрязняющих веществ из клеточного мусора и культуры среды. В конце процесса лиофилизированный полимер готов к использованию или характеристике или может быть подвергнут дальнейшим раундам очистки, в зависимости от конечного предназначенного использования. Что касается изоляции цианобактериального экзопротеома, метод основан на концентрации среды, свободной от клеток, после удаления основных загрязнителей путем центрифугации и фильтрации. Эта стратегия позволяет обеспечить надежную изоляцию белков, которые достигают внеклеточной среды через мембранные транспортеры или внешние мембранные пузырьки. Эти белки могут быть впоследствии идентифицированы с помощью стандартных методов масс-спектрометрии. Представленные здесь протоколы могут применяться не только к широкому спектру цианобактерий, но и к другим бактериальным штаммам. Кроме того, эти процедуры могут быть легко с учетом окончательного использования продуктов, степень чистоты требуется, и бактериальный штамм.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цианобактерии широко признаны в качестве плодовитых источников натуральных продуктов с перспективными биотехнологическими/биомедицинскими применениями. Поэтому понимание механизмов секреции цианобактерий и оптимизация методов извлечения/восстановления необходимы для внедрения цианобактерий как эффективных фабрик микробных клеток.

Многие цианобактериальные штаммы способны производить внеклеточные полимерные вещества (EPS), в основном образованные гетерополисахаридов, которые остаются связаны с поверхностью клетки или высвобождаются в среду1. Эти выпущенные углеводные полимеры имеют различные особенности по сравнению с другими бактериями, которые делают их пригодными для широкого спектра применений (например, противовирусные2, иммуностимулятор3, антиоксидант4, металл-хелатирование5, эмульгирующий6,и агенты доставки лекарств7,8). Методология изоляции этих полимеров во многом способствует не только повышению урожайности, но и повышению чистоты и специфических физических свойств полученного9полимера. Подавляющее большинство из этих методов для изоляции полимеров полагаться на осадки стратегии из культуры среды, которые легко достигается из-за сильной анионической природы полимера9,10. Кроме того, удаление растворителей, используемых в шаге осадков, может быть быстро достигнуто путем испарения и/или лиофилизации. В зависимости от предполагаемого применения, различные шаги могут быть соединены либо после или до выпадения полимера для того, чтобы адаптировать конечный продукт, который включает в себя трихлороацетической кислоты (TCA) лечение, фильтрация, или размер исключения хроматографии (SEC) очистка столбца10.

Цианобактерии также способны выделять широкий спектр белков через пути, зависящие от мембранных транспортеров (классические)11 или опосредованных пузырьками (неклассическими)12. Таким образом, анализ цианобактериального экзопротеома представляет собой важный инструмент, как понять / манипулировать механизмами секреции цианобактерий белка и понять специфическую внеклеточную функцию этих белков. Надежная изоляция и анализ экзопротеомов требуют концентрации внеклеточной среды, так как обилие выделяемых белков относительно низкое. Кроме того, другие физические или химические шаги (например, центрифугация, фильтрация или протеиновые осадки) могут оптимизировать качество полученного экзопротеома, обогащая содержание белка13и избегая присутствия загрязняющих веществ (например, пигменты, углеводы и т.д.. . 14 Год , 15 или преобладание внутриклеточных белков в образцах. Тем не менее, некоторые из этих шагов могут также ограничить набор белков, которые могут быть обнаружены, что приводит к предвзятому анализу.

Эта работа описывает эффективные протоколы для изоляции выпущенных углеводных полимеров и экзопротеомов от цианобактерий культуры средств массовой информации. Эти протоколы могут быть легко адаптированы к конкретным целям и потребностям пользователей исследования, сохраняя при этом основные шаги, представленные здесь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Цианобактериальная высвобождение углеводной полимерной изоляции

  1. Полимерная изоляция и удаление загрязняющих веществ
    1. Культивировать цианобактериальный штамм в стандартных условиях , например, 30 градусов по Цельсию при освещении 12 ч (50 мЭм 2с1)/12 г темного режима, с орбитальной тряской при 150 об/мин. Измерьте рост с помощью стандартных протоколов (например, оптическая плотность на 730 нм (OD730nm),хлорофилла, сухого веса и т.д.», затем измерять производство высвобождение полисахаридов в соответствии с фенол-серной кислоты метод16.
    2. Перенос культуры в диализные мембраны (12-14 кДа отсечения молекулярного веса) и диализ против минимум 10 томов деионизированной воды на 24 ч с непрерывным перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от объема культуры для диализа и среднего состава, может потребоваться изменение диализа воды.
    3. Центрифуги культуры на 15000 х г в течение 15 мин при 4 градусах По Цельсию. Перенесите супернатант в новый флакон и отбросьте гранулы (клетки).
    4. Центробежа снова на 20000 х г в течение 15 мин при 4 кв КС, чтобы удалить загрязняющие вещества, такие как мусор стенки клеток или липополисахариды (LPS).
    5. Перенесите супернатант в стеклянный стакан и отбросьте гранулы.
  2. Осадки полимера
    1. Добавьте 2 тома 96% этанола к супернатану.
    2. Инкубировать подвеску при 4 градусах Цельсия, по крайней мере на ночь.
    3. Восстановление полимера
      1. Для небольших или не видимых количеств осажденного полимера: центрифуга подвески при 13000 х г в течение 25 минут при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и отрепретите гранулы в 1 мл или 2 мл автоклавированной деионированной воды. Перенесите свовую подвеску на флакон.
        ВНИМАНИЕ: Супернатант следует отбрасывать осторожно, так как он может стать легко resuspended.
      2. Для видимого/большого количества осажденного полимера: соберите осаждаемый полимер со стерильными металлическими щипками в флакон. Сожмите полимер и отбросьте избыток этанола.
    4. Необязательно: в зависимости от степени требуемой очистки полимера повторите шаг осадков с 96% этанола после повторного перевеса полимеров в деионизированной воде.
  3. Лиофилизация полимера
    1. Держите флаконы с осаждаемым полимером при -80 градусов по Цельсию, по крайней мере на ночь.
    2. Заморозить сухой (лиофилизм) полимер не менее 48 ч (не позволяйте подвеске размораживать сяротку перед замораживанием сушиния).
    3. Храните сушеный полимер при комнатной температуре (RT) до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение полимера в обезвоживание рекомендуется, так как он может поглощать воду с течением времени.

2. Изоляция цианобактериального экзопротеома

  1. Средняя концентрация
    1. Выращивайте цианобактерии в стандартных условиях , например, 30 градусов по Цельсию под 12 ч света (50 м2с1)/12 ч темный режим, с орбитальной встряхивания при 150 об/мин. Мониторинг роста цианобактерия с помощью стандартных процедур (например, OD730nm,хлорофилла, сухого веса и т.д.. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
    2. Центрифуга культур на 4000 х г, в течение 10 минут на RT.
    3. Перенесите супернатант в колбу и отбросьте клеточные гранулы.
    4. Фильтр декантированных среды через 0,2 мкм порразмерный фильтр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь на короткий период времени, если среда хранится при 4 градусах Цельсия.
    5. Сосредоточьте среду примерно в 500 раз (учитывая первоначальный объем фильтрованной среды), используя центробежные концентраторы с номинальным молекулярным отсечкой веса 3 кДа. Центрифугация должна работать при 4000 х г (максимум 1 ч процентрифифации раунда) при 15 градусах Цельсия.
      ВНИМАНИЕ: Для большинства концентраторных брендов, фильтр устройство должно быть промыто центрифугации с ультрачистой водой перед использованием. Как только фильтр мокрый, не дайте ему высохнуть. Оставьте достаточно жидкости на резервуаре, когда устройство не используется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение температуры центрифугации до 4 градусов по Цельсию может быть полезно, если цель состоит в том, чтобы изучить активность белка, хотя это увеличит время, необходимое для концентрации образца. Протокол может быть приостановлен между этапами центрифугирования в течение коротких периодов времени, если среда хранится при 4 градусах Цельсия.
    6. Промыть стенки фильтровального резервуара образца устройства с концентрированным образцом и перенести содержимое в микроцентрифугную трубку.
    7. Выполните дополнительную ступень стирки резервуара образца фильтровального устройства с автоклавизированной культурой среды для обеспечения максимального восстановления экзопротеома.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы количественно процент восстановления, следуйте инструкциям конкретного производителя.
    8. Храните образцы экзопротеома при -20 градусов до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление ингибиторов протеазы рекомендуется для длительного хранения.
  2. Анализ экзопротеома
    1. Количественное содержание белка с помощью протеина BCA анализ в 96-наилучшим образом пластины в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Отделите белки натрием dodecyl сульфат-полиакриламид гель электрофоресис (SDS-PAGE), используя стандартные протоколы окрашивания (например, Coomassie синий, серебристый окрашивания).
    3. Вырежьте полосы / гели регионов, представляющих интерес и собирать их в различных микроцентрифуговых труб, содержащих соответствующие объемы ультра-чистой воды.
    4. Продолжить идентификацию и анализ белков с помощью масс-спектрометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематическое представление метода, описанного для извлечения освобожденных углеводных полимеров из цианобактериальных культур, изображено на рисунке 1. Осажденные полимеры от умеренного производителя EPS цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803 и эффективного производителя EPS Cyanothece sp. CCY 0110 показаны на рисунке 2. На рисунке 3показаны лиофилизированные полимеры с разной степенью загрязнения, подчеркивая в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы лучше понять механизмы бактериальной секреции и изучить высвобожденные продукты, крайне важно продемонстрировать эффективную изоляцию и анализ биомолекул, присутствующих в внеклеточной бактериальной среде (например, выпущенных углеводных полимеров и белков).

Цианобактериальные внеклеточные углеводные полимеры чрезвычайно сложны, в основном из-заколичества и доли различных моносахаридов, которые составляют их состав 1. Обычные методы, используемые для изоляции этих...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована Фондом Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) в рамках программы COMPETE 2020 - Operacional Program for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Португалия 2020, а также португальскими фондами через FCT - Funda'o para a Ci'ncia e Текнология/Минстерио да Сьенсия, Tecnologia e Ensino Superior в рамках проекта POCI-01-0145-FEDER-028779 и грант SFRH/BD/99715/2014 (CF).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Диализные мембраныMedicell Membranes Ltd DTV.12000.07Трубка для вискинга Размер 7, Диаметр 23,8 мм, Ширина 39-41 мм 30 м Рулон;
Этанол 96%AGA - Á lcool e Gé neros Alimentares, S.A.4.000.02.02.00Спирт этиловый брожения 96% AGA
PES фильтр 0,2 mFisher Scientific, Lda15206869Шприцевой фильтр полистирол 33MM 0.2&микро; М СТР 
Амикон Ультра-15, Ультрасел-3КMerck Millipore Ltd.UFC900324Центробежные фильтры с номинальной молекулярной массой 3 кДа
Thermo Scientific  Pierce BCA Protein AssayFisher Scientific, Lda10741395Зелено-синий, точный, совместимый с моющими средствами реагент для измерения общей концентрации белка
Brillant Blue G Коллоидный концентрат Сигма Олдрич Куиакут; слюда SLB2025-1EACoomassie blue 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
  2. Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
  3. Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
  4. Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
  5. Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
  6. Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
  7. Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206(2017).
  8. Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
  9. Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
  10. Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
  11. Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
  12. Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
  13. Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
  14. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  15. Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
  16. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
  17. Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
  18. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565(2015).
  19. Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
  20. Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
  21. Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
  22. Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи