Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерения внутриклеточного [Na+] в миоцитах предсердий мышей с помощью камер

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59600

⸱

27 мая 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biomedical Engineering and Technology and Department of Physiology, University of Maryland School of Medicine, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

В этой статье

Краткое содержание

Внутриклеточная концентрация Na+ ([Na+]i) в сердечных миоцитах изменяется при сердечных заболеваниях. [На+]i является важным регулятором внутриклеточного Ca2+. Мы представляем новый подход к измерению [Na+]i в недавно выделенных миоцитах предсердий мышей с использованием камеры устройства с заряженной связью, умножающего электроны (EMCCD), и быстрого, управляемого осветителя.

Аннотация

Внутриклеточная концентрация натрия ([Na+]i) является важным регулятором внутриклеточного Ca2+. Его исследование дает представление об активации сарколеммального обменника Na+/Ca2+ , поведении потенциал-зависимых каналов Na+ и Na+,K+-АТФазы. Внутриклеточная передача сигналов Ca2+ изменяется при заболеваниях предсердий, таких как фибрилляция предсердий. В то время как многие механизмы, лежащие в основе измененного внутриклеточного гомеостаза Ca2+ , охарактеризованы, роль [Na+]i и его дисрегуляция при патологиях предсердий плохо изучены. [На+]I в миоцитах предсердий увеличивается в ответ на увеличение скорости стимуляции. Таким образом, реакция на стимуляцию внешним полем имеет решающее значение для измерений [Na+]i в этих клетках. Кроме того, длительная подготовка (загрузка красителя) и продолжительность эксперимента (калибровка) требуют протокола выделения, который позволяет получить миоциты предсердий исключительного качества. Из-за небольшого размера предсердий мышей и состава межклеточного матрикса выделение высококачественных миоцитов предсердий взрослых мышей затруднено. В данной статье мы описываем оптимизированный протокол выделения на основе перфузии Лангендорфа, который неизменно обеспечивает высокий выход высококачественных предсердных мышиных миоцитов.

Натрий-связывающий бензофуранизофталат (SBFI) является наиболее часто используемым флуоресцентным индикатором Na+ . SBFI может быть загружен в сердечный миоцит либо в солевой форме через стеклянную пипетку, либо в виде ацетоксиметилового (AM) эфира, который может проникать через сарколеммальную мембрану миоцита. Внутриклеточно, SBFI-AM деэтерифицируется цитозольными эстеразами. Из-за различий в проникновении через мембрану и цитозольной деэтерификации каждая клетка должна быть откалибрована in situ. Как правило, измерения [Na+]i с использованием целоклеточной эпифлуоресценции SBFI выполняются с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ). Эта экспериментальная установка позволяет одновременно измерять только одну клетку. Из-за длительности загрузки миоцитарного красителя и калибровки после каждого эксперимента выход данных невелик. Поэтому мы разработали метод измерения [Na+]i на основе камеры EMCCD. Этот подход позволяет проводить одновременные измерения [Na+]i в нескольких миоцитах, что значительно увеличивает экспериментальный выход.

Введение

При заболеваниях предсердий (например, фибрилляции предсердий [ФП]) внутриклеточная передача сигналовCa2+ глубоко изменена1. В то время как многие из основных механизмов «ремоделируемой» внутриклеточной передачи сигналовCa2+ при ФП хорошо охарактеризованы 2,3, роль, которую может играть измененная внутриклеточная концентрация натрия ([Na+]i), плохо изучена. [На+]i является важным регулятором внутриклеточного Ca2+. Изучение [Na+]i может дать представление об активации сарколеммального обменника Na+/Ca2+ (NCX), поведении каналов Na+ и Na+,K+-АТФазы (NKA)4. Ранее мы показали, что высокая частота активации предсердий, как это происходит во время ФП, приводит к значительному снижению [Na+]i 1. Предыдущая работа показала увеличение плотности тока NCX (INCX) и уровня экспрессии белка при ФП3. Такжесообщалось об увеличении поздней составляющей потенциал-зависимого тока Na+ (INa, поздняя) в изолированных миоцитах предсердий у пациентов с ФП 5. Таким образом, имеются данные о глубоких изменениях внутриклеточного Na+ гомеостаза при ФП. Таким образом, для углубления нашего понимания патологии ФП необходимы надежные и воспроизводимые измерения [Na+]i в изолированных миоцитах предсердий. В этой статье мы продемонстрируем, как воспроизводимо изолировать высококачественные миоциты предсердий мышей, пригодные для измерения [Na+]i. Мы сосредоточили наш оптимизированный протокол выделения клеток предсердий на мышиных миоцитах предсердий, поскольку трансгенные (ТГ) мышиные модели фибрилляции предсердий стали жизненно важной частью исследований ФП6. Эти мыши часто доступны только в ограниченном количестве, а предсердия часто фиброзны, что затрудняет выделение клеток.

В общем случае, [Na+]i в жизнеспособных клетках можно измерять с помощью флуоресцентных индикаторов 7,8 или с помощью различных типов микроэлектродов9. Методики на основе микроэлектродов требуют проникновения через сарколеммальную мембрану. Таким образом, этот метод ограничен более крупными клетками и не подходит для малых и узких миоцитов предсердий, целостность клеток которых легко нарушается.

Натрий-связывающий бензофуранизофталат (SBFI) является флуоресцентным индикатором, который претерпевает большой сдвиг длины волны при связывании Na+ 7. SBFI попеременно возбуждается на длинах волн 340 нм и 380 нм, а излучаемая флуоресценция собирается после прохождения через эмиссионный фильтр (510 нм). Отношения сигналов на двух длинах волн возбуждения (F340/380) могут компенсировать локальную длину трассы, концентрацию красителя и независимые от длины волны изменения интенсивности освещения и эффективности детектирования. При проведении калибровки in situ с использованием растворов с известной концентрацией натрия ([Na+]) в каждой ячейке соотношение F340/380, полученное в ходе эксперимента, позволяет получить точные и чувствительные измерения [Na+]i. Как и все индикаторы Na+, SBFI также проявляет некоторое сродство к K+. Использование показанного здесь метода калибровки позволяет надежно «зажать» [Na+]i и внутриклеточную концентрацию калия ([K+]i) в процессе калибровки, чтобы [Na+]i можно было надежно откалибровать, даже когда она составляет <10% от [K+]i 10.

Мы представляем новую технику на основе камеры EMCCD для ратиометрических измерений [Na+]i с использованием SBFI. Камера EMCCD впервые позволяет проводить одновременные измерения (и калибровку) [Na+]i в нескольких ячейках. Это особенно полезно в экспериментальных условиях, где количество животных ограничено (например, на трансгенных моделях мышей). Как правило, измерения [Na+]i с использованием SBFI выполняются с помощью фотоумножителя (ФЭУ) для сбора эпифлуоресценции всей клетки 1,11. В то время как ФЭУ обеспечивают очень хорошее временное разрешение сигнала флуоресценции, пространственное разрешение очень низкое, и эксперименты ограничены одной клеткой за раз.

Наш новый протокол обеспечивает высоковоспроизводимые и чувствительные измерения [Na+]i. Он оптимизирован для одновременной регистрации изменений [Na+]i в нескольких миоцитах предсердий мышей, но может адаптироваться ко многим другим типам клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные здесь методы были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета штата Мэриленд в Балтиморе.

1. Выделение миоцитов предсердий из сердца взрослых мышей

  1. Поместите каждую мышь в прецизионный испаритель и индукционную камеру, насыщенную изофлураном со 100% кислородом.
  2. Установите подачу изофлурана на 1% до тех пор, пока животное не перестанет реагировать, перед внутрибрюшинной инъекцией гепарина (1–1,25 ЕД/г) за 15 минут до эвтаназии.
  3. Глубоко обезболить мышь, увеличив дозу изофлурана до 5% и подтвердить глубокую плоскость анестезии путем щипкования стопы.
  4. Провести эвтаназию путем выполнения быстрой торакотомии12; Используйте щипцы стандартного образца и хирургические ножницы, чтобы открыть грудную клетку. Пассивно мобилизуйте сердце и легкое, изолируйте дугу аорты, задержите щипцами и разрежьте аорту, чтобы удалить сердце.
  5. Поместите сердце в ледяной буфер для выделения свободных клеток Ca2+ ( CIB, табл. 1).
  6. Канюляцию аорты с помощью канюли 22 G и завязку с помощью шелкового шва под световым микроскопом с 3-кратным увеличением в растворе CIB (рис. 1A, B).
  7. Убедитесь, что канюля находится значительно выше аортальных синусов, подав раствор CIB через канюлю, подключенную к шприцу, и подтвердите перфузию коронарных артерий под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для обеспечения надлежащей перфузии предсердной ткани, поскольку было показано, что анатомия коронарных артерий сильно вариабельна у мышей13.
  8. Установите сердце на гравитационную установку Лангендорфа и перфузируйте раствором CIB без Ca2+ в течение 5 минут при 37 °C, чтобы смыть оставшуюся кровь до тех пор, пока элюат не станет прозрачным (Рисунок 1C).
  9. Переключитесь на ферментативный раствор (табл. 2) и перфузируйте в течение 3–5 мин при 37 °С, пока ткань предсердий не станет мягкой и вялой.
  10. Иссеките правое и левое предсердия с помощью щипцов с суперзахватом и маленьких пружинных ножниц и переложите в небольшую чашку для культуры, содержащую ферментативный раствор CIB, используемый на шаге 1.8, но с 0,15 мМ CaCl2 , и поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 5–8 минут (рис. 1D).
  11. Перенесите предсердия в чашку для клеточной культуры, содержащую 4 мл предварительно подогретого (37 °С) раствора для хранения (модифицированный раствор Тироде (табл. 3), содержащий 15 мМ бычьего сывороточного альбумина и 30 мМ 2,3-бутандиона моноксима).
  12. Разрежьте предсердия на небольшие полоски ткани (10–20, в зависимости от размера предсердий) с помощью маленьких пружинных ножниц и щипцов с суперзахватом.
  13. Для механической диссоциации аккуратно отсасывают тканевую суспензию с помощью различных пипеток Пастера с полированным пламя стеклом с отверстиями от 2 до 5 мм. Начните с самого большого наконечника пипетки и переходите к самому маленькому наконечнику пипетки, отсасывая 5–10 раз на пипетку.
  14. Процедите клеточную суспензию через фильтр 200 мкм и добавьте CaCl2 три раза каждые 10 мин до достижения конечной концентрации 0,3 мМ.

2. Оценка качества клеток

  1. Поместите 200 мкл клеточной суспензии, содержащей только что выделенные миоциты предсердий, на стеклянную покровную крышку.
  2. Используйте 10-кратный объектив, чтобы подсчитать все ячейки в поле зрения и классифицировать их как округлые или стержневые. Определите, сколько стержневых ячеек демонстрируют четкую поперечную бороздку (переключитесь на объектив 25x, если это трудно определить, см. рисунок 2C).
  3. Повторите шаги 2.1–2.2.
  4. Рассчитайте процентное соотношение округлых, стержневых и стержневых ячеек с четкими поперечными бороздками.
  5. Модифицируйте процедуру выделения клеток до тех пор, пока 80% клеток не приобретут палочковидную форму с четкой поперечной бороздкой.
  6. Поместите 500 мкл суспензии клеток предсердий на стеклянную защитную крышку с ламининовым покрытием и поместите камеру клетки на инвертированный микроскоп. Дайте ячейкам отстояться в течение 5 минут. Перфузируйте раствором Тирода, содержащим 1,8 мМ Ca2+.
  7. Используйте систему клеточного стимулятора для стимуляции электрического поля (биполярный импульс 2 мс, 30 В) с частотой 0,5 Гц и подсчитайте количество клеток, которые сокращаются в поле зрения объектива с 10-кратным увеличением.
  8. Повторите с стимуляцией внешнего поля с частотой 3 Гц.
  9. Рассчитайте процент клеток, реагирующих на частоту стимуляции 0,5 и 3 Гц (см. рисунок 2B). Совершенствуйте протокол изоляции клеток до тех пор, пока 50% клеток не отреагируют на стимуляцию полем 3 Гц.

3. Индикаторная нагрузка Na+ свежевыделенных миоцитов предсердий мышей

  1. Используйте в качестве клеточного перцензента ацетоксиметиловый (АМ) эфир флуоресцентного индикатора натрия-связывающего бензофуранизофталата (SBFI-AM).
  2. Для облегчения диспергирования красителей и достижения однородной нагрузки в клетках растворяют SBFI в диметилсульфоксиде (ДМСО) и подходящих полиолах поверхностно-активных веществ (например, плуроновых) для достижения конечной концентрации 10 мкМ SBFI в клеточной суспензии.
  3. Загрузите элементы с SBFI на 60 мин в защищенном от света месте на коромысле при комнатной температуре.
  4. Дайте клеткам отстояться в течение 30 минут, удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу в накопительном растворе (1–2 мл).
    Примечание: Эксперименты должны быть проведены в течение 4 часов после выделения клеток. BDM вымывается перфузией раствором Tyrode до начала экспериментов14.

4. Контрольно-измерительные приборы, измерения [Na+]i и калибровка [Na+]i

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3 показана схема пути света для экспериментального прибора.

  1. Приготовьте калибровочные растворы с возрастающими концентрациями Na+ , как описано в таблицах 4–6.
  2. В каждый калибровочный раствор добавляют проникающий агент грамицидин D (10 мкМ; из исходного раствора, хранящегося при -20 °С) и ингибитор Na+, K+ АТФазы строфантидин (100 мкМ, из исходного раствора, хранящегося при -20 °С). Хорошо проведите вихрь, или используйте ультразвуковую терапию, чтобы убедиться, что грамицидин и строфантидин полностью растворились.
  3. Заполните многоцилиндровую перфузионную систему калибровочными растворами, содержащими увеличивающийся [Na+]o, приготовленный на этапах 4.1 и 4.2. Подключайтесь к камере ячейки с использованием медленной скорости перфузии (~1 мл/мин; скорость перфузии может варьироваться в зависимости от объема камеры ячейки).
  4. Подключите отсос к камере камеры и соберите перфузат в соответствующую (стеклянную) емкость на полу.
  5. Остановите перфузию и отсасывание.
  6. После 30-минутной деэтерификации SBFI поместите 100 мкл концентрированной (шаг 3,5) суспензии клеток, загруженной красителем, на стеклянную защитную крышку с ламининным покрытием над полем зрения объектива инвертированного микроскопа с 40-кратным увеличением.
  7. Используйте быстро переключающийся осветитель с ксеноновым источником света мощностью 300 Вт. Получение широкоугольной визуализации с двумя длинами волн возбуждения (340 нм и 380 нм) с помощью быстро переключающихся сканирующих зеркал и узкополосных фильтров возбуждения (340 нм ± 10 нм; 380 нм ± 10 нм).
  8. Оптимизируйте поле зрения камеры EMCCD. Чем больше область наблюдения, тем больше времени кадра. Более длительное время кадрирования приводит к большему обесцвечиванию индикатора. Таким образом, сбалансируйте размер поля зрения и время кадра, чтобы не произошло заметного обесцвечивания пробника.
  9. Определите, что в подмножестве клеток предсердий, которые не загружены SBFI, существует только минимальная внутренняя флуоресценция, убедившись, что внутренняя флуоресценция клеток аналогична фоновой флуоресценции (как показано на рисунке 4).
  10. Определите подходящую частоту дискретизации в зависимости от плана эксперимента (частота дискретизации может быть низкой, поскольку изменения [Na+]i происходят относительно медленно (например, одна точка данных собирается каждые 10–20 с).
  11. Ослабляйте возбуждающий свет с помощью соответствующих фильтров нейтральной плотности (ND) и соответствующего снижения интенсивности источника света (например, путем изменения интенсивности в операционном программном обеспечении).
  12. Соберите излучение света на длине волны 510 ± 40 нм с помощью соответствующих фильтров с камерой EMCCD, подключенной к инвертированному микроскопу.
  13. Определите область интереса (ROI) для каждой ячейки и фоновую ROI (см. рис. 4). Вычтите фон из записанных сигналов F340 и F380 (в режиме онлайн или во время анализа данных).
  14. Запустите сбор данных.
  15. Возобновите перфузию и отсасывание. Перед началом эксперимента проводят в течение 10–15 мин раствором Тайрода, содержащим 1,8 мМ Ca2+ и регистрируют стабильный исходный уровень F340/380 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно запишите стабильную базовую линию в течение 10–15 минут. Если происходит обесцвечивание (например, снижение базовой линии F340/380 ), попытайтесь еще больше ослабить интенсивность освещения либо путем увеличения плотности нейтрального фильтра, либо уменьшения интенсивности светового сигнала возбуждения и/или времени захвата кадра (см. шаги 4.10–4.11).
  16. Начните измерение [Na+]i в соответствии с вопросом исследования.

5. Калибровка [Na+]i

  1. После завершения эксперимента (шаг 4.16) выполните калибровку сигнала F340/380 в каждой ячейке in situ.
  2. Откалибруйте сигнал F340/380 путем перфузии миоцитов, загруженных SBFI, с калибровочными растворами (приготовленными на шагах 4.1–4.3).
  3. Перфузируйте ступенчато для повышения [Na+]o от 0 до 20 мМ. Дождитесь стабильного сигнала F340/380 перед переходом к следующей концентрации (~5 минут в зависимости от расхода; см. Рисунок 3B и Рисунок 5A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение между сигналом F340/380 и [Na+] калибровочных растворов должно быть линейным для корректной калибровки сигнала F340/380 (Рисунок 5 и Рисунок 6).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оценка качества клеток предсердий
Свежевыделенные миоциты предсердий оценивали на основе морфологии клеток и их реакции на полевую стимуляцию, как указано в протоколе, в шести последовательных выделениях клеток предсердий. Данные, представленные на рисунке 2 , показывают очень высокий процент палочковидных миоцитов предсердий, которые сохраняют четкую поперечную бороздку. Точно так же около 50% клеток предсердий реагируют на высокие скорос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе мы представляем новую методику на основе камеры EMCCD для одновременного количественного измерения [Na+]i в множественных жизнеспособных миоцитах предсердий с использованием изофталата бензофурана, связывающего натрий (SBFI). Описанный здесь подход является первым, который позволяет одновременно измерять [Na+]i в нескольких клетках. Основными преимуществами этого нового протокола являются (i) значительное увеличение эксперимента...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом на развитие ученых от Американской кардиологической ассоциации (14SDG20110054) для MG; грант NIH на междисциплинарное обучение в области биологии мышц (T32 AR007592) и грант NIH на обучение сердечно-сосудистым заболеваниям (2T32HL007698-22A1) LG; грант на развитие ученых от Американской кардиологической ассоциации (15SDG22100002) для LB и гранты NIH R01 HL106056, R01 HL105239 и U01 HL116321 для WJL.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,3-бутандион моноксим (BDM)Sigma-AldrichB0753
340 ФильтрChromaET40X25 мм
380 Фильтр возбужденияChromaET80X25 мм
510 Фильтр излученияChromaET510/80m25 мм
Бычья сыворотка Альбумин (BSA)Sigma-AldrichA7906
Пузырьковая ловушкаBD Medical Technologies904477изготовлен на заказ из шприца Luer Lok объемом 5 мл, который расположен в пути трубки от перфузионного раствора до канюли
CaCl2 раствораSigma-Aldrich21115
CanjulaBD Medical Technologies305167изготовлен на заказ из иглы размером 22 G x 1 1/2 дюйма. Разрежьте до 1 дюйма и отшлифуйте дистальный кончик толщиной 1 мм.
Камера-ячейкаизготовлена по индивидуальному заказу с отверстием, которое может надежно удерживать стеклянную крышку толщиной 25 мм, и с крышкой, которая имеет входной и выходной порт для перфузии.
Циркуляционная водяная баняVWR
Коллагеназа IIWorthingtonLS004176Специфическая активность 290 ед/г
креатининаSigma-AldrichC0780
DG5-plus ОсветительSutter InstrumentLambda DG-4/DG-5 Plus
DMSO Thermo FischerBP231
EGTASigma-AldrichE4378
Фотоаппарат EMCCDPrinceton InstrumentsProEM-HS
Fine HemostatsFine Science Tools130-20
Fine ScissorsFine Science Tools14060-10
Щипцы SupergripFine Science Tools00632-11
Стекло Cover SlipsVWR4838089круг 25 мм
ГлюкозаSigma-AldrichG7528
Грамицидин DSigma-AldrichG5002
HEPESSigma-AldrichH3375
Внутренняя силиконовая трубкаVWRVWRизбранная марка силиконовая трубка
Инвертированный микроскопNikonInstruments NikonTE 2000 U
Изоляционные инструменты
K ГлюконатSigma-AldrichP1847
KCISigma-AldrichP5405
KH2PO4Calbiochem529568
Langendorff перфузионный аппарат
MgCl2.6H2O *Sigma-AldrichM0250
Стимулятор клеток MyoPacerIonOptix
na GluconateSigma-AldrichS2054
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS9390
Натуральный мышиный ламинин<em>Thermo Fischer<em>23017015<em>0,5-2,0 мг/млНаружная
трубкаVWR
чашка Петри 35X10 ммFalcon351008
PowerLoadThermo FischerP10020
Протеаза XXIVSigma-AldrichP8038
SBFI-AMThermo FischerS1264
Шелковый шовFine Science Tools18020-500,12 мм диаметр
Маленькие пружинные ножницыFine Science Tools15000-03
Щипцы стандартного образцаFine Science Tools11000-12
строфантидинSigma-AldrichG5884
Хирургические ножницы Tough CutFine Science Tools14054-13
Щипцы для наложения швовFine Science Tools00272-13
TaurineSigma-AldrichT0625
TrisbaseSigma-AldrichTRIS-RO
TrypsinSigma-AldrichT0303
UVFS Отражающий 0,1 ND фильтрThorlabsNDUV01B25 мм
UVFS Отражающий 0,2 ND фильтрThorlabsNDUV02B25 мм
UVFS Отражающий 0,3 ND фильтрThorlabsNDUV03B25 мм
UVFS Отражающий 0,5 ND фильтрThorlabsNDUV05B25 мм
UVFS Отражающий 1 ND фильтрThorlabsNDUV010B25 мм
возбуждения

Ссылки

  1. Greiser, M., et al. Tachycardia-induced silencing of subcellular Ca2+ signaling in atrial myocytes. Journal of Clinical Investigation. , (2014).
  2. Greiser, M., Lederer, W. J., Schotten, U. Alterations of atrial Ca(2+) handling as cause and consequence of atrial fibrillation. Cardiovascular Research. 89, 722-733 (2011).
  3. Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125, 2059-2070 (2012).
  4. Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415, 198-205 (2002).
  5. Sossalla, S., et al. Altered Na(+) currents in atrial fibrillation effects of ranolazine on arrhythmias and contractility in human atrial myocardium. Journal American College of Cardiology. 55, 2330-2342 (2010).
  6. Wan, E., et al. Aberrant sodium influx causes cardiomyopathy and atrial fibrillation in mice. Journal of Clinical Investigation. 126, 112-122 (2016).
  7. Minta, A., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. Journal of Biological Chemistry. 264, 19449-19457 (1989).
  8. Donoso, P., Mill, J. G., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. Fluorescence measurements of cytoplasmic and mitochondrial sodium concentration in rat ventricular myocytes. Journal of Physiology. 448, 493-509 (1992).
  9. Friedman, S. M., Jamieson, J. D., Hinke, J. A., Friedman, C. L. Use of glass electrode for measuring sodium in biological systems. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 99, 727-730 (1958).
  10. Harootunian, A. T., Kao, J. P., Eckert, B. K., Tsien, R. Y. Fluorescence ratio imaging of cytosolic free Na+ in individual fibroblasts and lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 264, 19458-19467 (1989).
  11. Despa, S., Islam, M. A., Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Intracellular [Na+] and Na+ pump rate in rat and rabbit ventricular myocytes. Journal of Physiology. 539, 133-143 (2002).
  12. Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. Journal of Phsiological Sciences. 57, 327-335 (2007).
  13. Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. Journal of Anatomy. 199, 473-482 (2001).
  14. Yu, Z. B., Gao, F. Non-specific effect of myosin inhibitor BDM on skeletal muscle contractile function]. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 21, 449-452 (2005).
  15. Levi, A. J., Lee, C. O., Brooksby, P. Properties of the fluorescent sodium indicator "SBFI" in rat and rabbit cardiac myocytes. Journal of Cardiovasc Electrophysiology. 5, 241-257 (1994).
  16. Baartscheer, A., Schumacher, C. A., Fiolet, J. W. Small changes of cytosolic sodium in rat ventricular myocytes measured with SBFI in emission ratio mode. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 3375-3383 (1997).
  17. Despa, S., Tucker, A. L., Bers, D. M. Phospholemman-mediated activation of Na/K-ATPase limits [Na]i and inotropic state during beta-adrenergic stimulation in mouse ventricular myocytes. Circulation. 117, 1849-1855 (2008).
  18. Correll, R. N., et al. Overexpression of the Na+/K+ ATPase alpha2 but not alpha1 isoform attenuates pathological cardiac hypertrophy and remodeling. Circulation Research. 114, 249-256 (2014).
  19. Hinke, J. Glass micro-electrodes for measuring intracellular activities of sodium and potassium. Nature. 184 (Suppl 16), 1257-1258 (1959).
  20. Thomas, R. C. New design for sodium-sensitive glass micro-electrode. Journal of Physiology. 210, 82P-83P (1970).
  21. Thomas, R. C. Membrane current and intracellular sodium changes in a snail neurone during extrusion of injected sodium. Journal of Physiology. 201, 495-514 (1969).
  22. Slack, C., Warner, A. E., Warren, R. L. The distribution of sodium and potassium in amphibian embryos during early development. Journal of Physiology. 232, 297-312 (1973).
  23. Eisner, D. A., Lederer, W. J., Vaughan-Jones, R. D. The control of tonic tension by membrane potential and intracellular sodium activity in the sheep cardiac Purkinje fibre. Journal of Physiology. 335, 723-743 (1983).
  24. Despa, S., Kockskamper, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. Na/K pump-induced [Na](i) gradients in rat ventricular myocytes measured with two-photon microscopy. Biophysical Journal. 87, 1360-1368 (2004).
  25. Kornyeyev, D., et al. Contribution of the late sodium current to intracellular sodium and calcium overload in rabbit ventricular myocytes treated by anemone toxin. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310, H426-H435 (2016).
  26. Szmacinski, H., Lakowicz, J. R. Sodium Green as a potential probe for intracellular sodium imaging based on fluorescence lifetime. Annals of Biochemistry. 250, 131-138 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

SBFIEMCCD
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.