Мы представляем протокол для функционализации атомной силы микроскопа (AFM) кантилеверс с одной Т-клетки и частицы биса для иммунологических исследований. Показаны процедуры зондирования однопартной Т-дендритной связывания клеток AFM и мониторинга клеточной реакции макрофагов в реальном времени на одну твердую частицу с помощью флуоресценции.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Функционализация атомной силы Микроскоп Кантилеверс с одно-T-клеток или одночастицы для иммунологической одноклеточной силы спектроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Атомная силовая микроскопия на основе одноклеточной силовой спектроскопии (AFM-SCFS) является мощным инструментом для изучения биофизических свойств живых клеток. Этот метод позволяет зондировать прочности взаимодействия и динамики на мембране клетки в реальном маштабе времени, включая те между клетками, приемными устройствами и ligands, и наряду со многими другими изменениями. Он также работает как механизм для доставки физического или биохимического стимула на одиночных клетках в пространственно контролируемой манере, что позволяет конкретной активации клеток и последующих клеточных событий, которые будут контролироваться в режиме реального времени в сочетании с живой клеткой флуоресценция. Ключевым шагом в этих измерениях AFM-SCFS является функционализация AFM-cantilever, или, другими словами, присоединение предмета, интересующего к кантилевер. Здесь мы представляем методы модификации AFM кантилеверов с одной Т-клеток и одной бустирой полистирола соответственно для иммунологических исследований. Первый включает в себя биосовместимый клей, который пары одного Т-клеток на кончике плоского кантилевера в растворе, в то время как последний опирается на эпоксидный клей для одной саженки биса в воздушной среде. Предусмотрены также два иммунологических применения, связанных с каждой модификацией кантилевера. Описанные здесь методы могут быть легко адаптированы к различным типам клеток и твердым частицам.
Введение
Атомная микроскопия силы (AFM), универсальный инструмент, нашелмного применений в исследованиях клеточной биологии 1,2,3,4. Помимо своей высокой возможности изображения разрешения, родная функция зондирования силы позволяет биофизические свойства живых клеток, которые будут исследованы непосредственно на месте на одноклеточном уровне6,7. К ним относятся жесткости субклеточныхструктур или даже целые клетки 8,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол эксперимента мыши следует за директивами по внимательности животных университета Tsinghua
1. Функционализация кантилеев с одними Т-клетками
- Подготовка клеток селезенки мыши
- Пожертвуйте мышью (8-16 недель (либо пол); например, штамм C57BL/6 с использованием двуокиси углерода, а затем вывихшей шейки матки.
- Очистите мышь с 75% этанола и сделать разрез кожи средней линии следуют спленэктомии.
- Гомогенизировать селезенку в 4 мл PBS, содержащего 2% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) с помощью стеклянных слайдов и удалить агрегаты и мусор, пройдя клеточной подвески через 70 мкм сетки нейло....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 4A показаны типичные кривые силового расстояния от связывающего взаимодействия между одно-Т-клеточной и однодневкой в одном цикле подхода-оттягивания. Светло-красная кривая — кривая расширения, а темно-красная — кривая опровержения. Поскольку кривая расширения обычно используется для отступов или анализа жесткости, здесь для срапа ячеек требуется только кривая опровержения. Минимальное значение (зеленый круг) в кривой дает меру максимальной силы сц.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Спектроскопия одноклеточной силы на основе AFM превратилась в мощный инструмент для решения биофизических свойств живых клеток. Для этих приложений, кантилевер должен быть функционировал должным образом для того, чтобы зондировать конкретные взаимодействия или свойства на клетках, представляющих интерес. Здесь описаны методы соединения одноклеточных Т-клеток и одномикронного размера биса с кантилевером без кончика, не содеяняемого. Чтобы прикрепить одну Т-клетку к кантилеверу, в качестве клея был выбран биосовместимый кл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая Общей программы (31370878), Государственной ключевой программы (31630023) и Инновационной исследовательской группы программы (81621002).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <прочный>Материал | |||
| 10 μ l наконечник для пипетки | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 мл туба | Corning | 430791 | |
| диаметром 6 см чашка для культуры | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-луночная культуральная пластина | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | безнаконечниковая консоль |
| β-меркаптоэтанол | Sigma | 7604 | |
| Биосовместимый клей | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ Т-клеточная изоляция Коктейль | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 клеточная линия | Подарок от К. Рока (Медицинская школа Массачусетского университета, Вустер, Массачусетс) | ||
| Магнитные частицы с покрытием из декстрана | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 мл | |
| Эпоксидная | смола ERGO | 7100 | |
| Этанол | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| Блокатор FcR | STEMCELL | 18731 | |
| Стеклянный покровный стекал | местный продавец (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | диаметр 24 мм, толщина 0,17 мм |
| Стеклянные предметные стекла | Отдел управления лабораторией и оборудованием JinThong, Haimen | Н/Д | специализированный |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4Sino | pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma 51558 | ||
| Магнит | STEMCELL | 18000 | |
| Меш нейлоновое ситечко | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | клонирован в лаборатории | |
| Мышь CD25 Набор для положительной изоляции T-клеток | STEMCELL | 18782 | Компонент: Блокатор FcR, Регуляторный коктейль положительного отбора Т-клеток, Коктейль выбора ПЭ, Декстран RapidSpheres, |
| CD4+ Набор для изоляции Tcell | STEMCELL | 19852 | Компонент: Коктейль для изоляции CD4+Т-клеток, стрептавидин RapidSpheres, Сыворотка для крыс |
| NaOH | Lanyi Chemical Products co., LTD? Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE отборный коктейль | STEMCELL | 18151 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Гиклон | SV30010 | |
| PLC&дельта;-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Полистирольные микросферы 6.0μ m | Polysciences | 07312-5 | |
| полистирольная круглая донная трубка | BD Falcon 352054 | ||
| Сыворотка крови крысы | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Рекомбинантный человеческий интерлейкин-2 | Peprotech Peprotech | , 200-02-1000 | |
| Буфер для лизиса эритроцитов | Beyotime | C3702 | |
| Регуляторный коктейль положительного отбора Т-клеток | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Камера для образцов | Домашнее производство | ||
| Покрытые стрептавидином магнитные частицы | STEMCELL | 50001 | |
| Набор для трансфекции | Clontech | 631318 | |
| Трипсин 0,25% ЭДТА | Life | 25200114 | |
| Пинцет | JD | N/A | |
| Name | Company | Каталожный номер< | strong>Comments |
| Equipment | |||
| 20x объектив NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Атомно-силовой микроскоп | JPK | cellHesion200 | |
| Центрифуга | Beckman Coulter | Allegra X-12R | |
| Флуоресцентная визуализация | самодельный объектив полного внутреннего отражения флуоресцентный микроскоп на базе стенда микроскопа Zeiss Увлажненный | ||
| CO2 инкубатор | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Микроскоп с инвертированным светом | Zeiss | Observer A1 manual |
Ссылки
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
