Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изучение Cryptosporidium инфекции в 3D Ткани полученных человеческих органоидных систем культуры микроинъекции

9.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59610

⸱

14 сентября 2019 г.

 ,  , 
1Hubrecht Institute, Oncode Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), UMC Utrecht, 2Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 3Janssen Pharmaceutica

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протоколы для подготовки яйцеклеток и очищения спорозоитов для изучения инфекции органов кишечника и дыхательных путей с помощью Cryptosporidium parvum. Мы демонстрируем процедуры микроинъекции паразитов в кишечный органоидный просвет и иммуностоидинг органоидов. Наконец, мы описываем изоляцию генерируемых яйцеклеток от органоидов.

Аннотация

Cryptosporidium parvum является одной из основных причин заболеваний человека диареи. Чтобы понять патологию паразита и разработать эффективные препараты, необходима система культуры in vitro, которая переоценивает условия в хозяине. Органоиды, которые очень похожи на ткани своего происхождения, идеально подходят для изучения взаимодействий хозяина-паразита. Органоиды являются трехмерными (3D) тканевыми структурами, которые получены из взрослых стволовых клеток и растут в культуре в течение длительных периодов времени, не подвергаясь никакой генетической аберрации или трансформации. Они имеют четко определенную полярность как с апиальными, так и с базолатеральными поверхностями. Органоиды имеют различные применения в тестировании на наркотики, био-банкинг, и болезни моделирования и принимающей микробов исследований взаимодействия. Здесь мы представляем пошаговый протокол о том, как подготовить яйцеклетки и спорозоиты криптоспоридия для заражения органов кишечника и дыхательных путей человека. Затем мы демонстрируем, как микроинъекция может быть использована для введения микробов в органоидный просвет. Существует три основных метода, с помощью которых органоиды могут быть использованы для исследований взаимодействия хозяина-микроба – микроинъекций, механического стрижки и покрытия, а также путем создания монослойных. Микроинъекция позволяет успомянить 3D-структуру и обеспечивает точный контроль объемов паразитов и прямого апкиальный боковой контакт для микробов. Мы предоставляем подробную информацию для оптимального роста органоидов для визуализации или производства яйцеклеток. Наконец, мы также демонстрируем, как вновь сгенерированные яйцеклетки могут быть изолированы от органоида для дальнейшей обработки и анализа вниз по течению.

Введение

Разработка лекарств или вакцин для лечения и профилактики инфекции Cryptosporidium была затруднена из-за отсутствия систем in vitro, которые точно имитируют in vivo ситуацию в организме человека1,2. Многие из имеющихся в настоящее время систем либо позволяют краткосрочную инфекцию (Злт;5 дней), либо не поддерживают полный жизненный цикл паразита3,4. Другие системы, которые позволяют полное развитие паразита основаны на увековеченных клеточных линий или раковых клеток линий, которые не точно резюмировать физиологическую ситуацию в организме человека5,6,7 . Органоиды или «мини-органы» являются 3D-структурами, полученными из тканей, которые выращиваются во внеклеточной матрице, дополненной различными специфическими факторами роста тканей. Органоиды были разработаны из различных органов и тканей. Они генетически стабильны и резюмируют большинство функций органов их происхождения и могут поддерживаться в культуре в течение длительных периодов времени. Мы разработали метод заражения органов кишечника и легких человека криптоспоридием, который обеспечивает точную модель in vitro для изучения взаимодействий хозяина-паразита, имеющих отношение к кишечному и респираторному криптоспоридиозу8 ,9,10,11,12,13. В отличие от других опубликованных моделей культуры, органоидная система является репрезентативной для взаимодействия паразитов в реальной жизни, позволяет завершить жизненный цикл, чтобы можно было изучить все этапы жизненного цикла паразита, и поддерживает распространение паразитов на срок до 28 дней10.

Cryptosporidium parvum является апикомплексным паразитом, который заражает эпителий дыхательных путей и кишечных путей, вызывая длительную диарею. Устойчивый экологический этап является яйцей, найденный в загрязненной пище и воде14. После того, как попадает или вдыхается, яйцеклетки excyst и выпускает четыре sporozoites, которые прикрепляются к эпителиальным клеткам. Sporozoites скользить по клеткам хозяев и заниматься рецепторами клеток-хозяев, но паразит не полностью вторгнуться в клетку, и, как представляется, побудить клетку-хозяина, чтобы поглотить его15. Паразит, который интернализирован в внутриклеточном, но экстрацитоплазматном отсеке, остается на апической поверхности клетки, реплицируя в паразитофорном вакуоле. Он проходит два раунда бесполого размножения - процесс, называемый мерогонии. Во время мерогонии, типа I меронты развиваться, которые содержат восемь merozoites, которые выпускаются вторгнуться в новые клетки. Эти мерозоиты вторгаются в новые клетки, чтобы превратиться в меронты типа II, содержащие четыре мерозоита. Эти мерозоиты, когда высвобождаются, заражают клетки и превращаются в макрогамонты и микрогамонты. Микрогаметы высвобождаются и удобряют макрогаметы, производящие зиготы, которые созревают в ооцисты. Зрелые яйцеклетки впоследствии высвобождаются в просвет. Ооцисты либо тонкостены, которые сразу же excyst для повторного заражения эпителия, или толстые стеной, которые высвобождаются в окружающую среду, чтобы заразить следующий хозяин14. Все этапы жизненного цикла Cryptosporidium были определены в системе органоидной культуры, ранее разработанной нашей группой10.

Так как человеческие органоиды верно реплицируют человеческие ткани9,11,13,и поддерживают все репликационные этапы Cryptosporidium10, они являются идеальной системой культуры тканей для изучения Криптоспоридий биологии и принимающей паразит взаимодействия. Здесь мы описываем процедуры заражения органоидов как с Cryptosporidium яйцевидных яйцеклеток и excysted sporozoites, и изоляции новых яйцеклеток, производимых в этой системе культуры тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Вся обработка тканей и резекция проводилась в соответствии с утвержденными протоколами Институционального совета по обзору (IRB) с согласия пациента.

1. Подготовка C. parvum Oocysts для инъекций

ПРИМЕЧАНИЕ: Cryptosporidium ооцисты были приобретены из коммерческого источника (см. Таблица материалов). Эти яйцеклетки производятся в телятах и хранятся в фосфатно-буферном сольном (PBS) с антибиотиками. Они могут храниться в течение 3 месяцев при 4 градусах Цельсия и никогда не должны быть заморожены. Обычно мы используем яйцеклетки в течение одного месяца. Органоиды могут быть инфицированы либо нетронутыми яйцеклетки, или sporozoites могут быть изолированы от excysted яйцевидных яйцеклеток и используется для заражения органоидов, если важно не иметь ооцизтов переноса из оригинального инокулума.

  1. Подготовка Cryptosporidium яйцеклетки для заражения клеток(рисунок 1A).
    1. Держите ооцисты на льду на протяжении всех манипуляций, пока они не добавляются в органоиды.
    2. Рассчитайте количество яйцеклеток, необходимых для полной шести-колодчатой пластины органоидов (обычно около 5 х 105-2,5 х 105 для тарелки). Подсчитайте количество яйцеклеток в гемоситометре, чтобы проверить количество и перенести в центрифужную трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы помочь в визуализации, ооцисты могут быть смешаны 1:1 с ооцизтом конкретных флуоресцентных антител (см. Таблица материалов) перед загрузкой на гемоцитометр. Флюорофор помечены яйцеклетки могут быть легко визуализированы и перечислены с помощью флуоресцентного микроскопа. Мы предлагаем инъекционные около 100-1000 яйцеклеток / органоидов. В целом, 1000-2000 органоидов можно выращивать в шестиколодцной пластине.
    3. Доведите объем ооцизтов до 900 л с помощью PBS. Добавьте 100 зЛ гипохлоритна натрия (например, Clorox) отбеливателя (при 4 градусах Цельсия). Инкубировать 10 мин на льду.
    4. Центрифуга в течение 3 мин в микроцентрифуге при 8000 х г при 4 градусах Цельсия. Ориентируйте трубы в центрифуге с крышкой открытия лицом внутрь. Гранулы может быть трудно увидеть так зная, где паразиты имеют гранулы в трубке имеет важное значение.
    5. Удалите супернатант с пипеткой быть осторожным, чтобы избежать гранулы. Добавьте 1 мл модифицированной среды Eagle (DMEM) и вихря для смешивания.
    6. Центрифуга в течение 3 мин в микроцентрифуге при 8000 х г при 4 градусах Цельсия.
    7. Повторите стих с DMEM еще два раза.
    8. Подготовка расширения среды (OME) или дифференциации органоидной среды (OMD), к которой тауроколат был добавлен к окончательной концентрации 0,5% (w/v) (см. Таблица материалов). Таурохолят всегда следует готовить и добавлять свежим.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы успешно использовали 0,5% таурохолата в наших анализов инфекции, где инокулум нетронутыми яйцеклетки, и увидел улучшение темпов инфекции без пагубного воздействия на клетки хозяина. Тем не менее, таурохолат может иметь непредвиденные последствия для клеток, и более низкие концентрации были успешно использованы в инфекции анализы16.
    9. Resuspend яйцеклетки в 100 л органоидной культуры среды дополнены 0,5% (w/v) натрия таурочолат. Подсчитайте ооцисты снова, как описано в шаге 1.1.2.
    10. Добавьте быстрый зеленый краситель в подвеску, чтобы визуализировать инъекцию.
    11. Заполните советы микро-загрузчика (см. таблицу материалов)с подвеской oocyst и используйте его для заполнения вытащил капилляров.
      ПРЕДЕКТО: Вся процедура должна быть сделана в капюшоне культуры ткани с протоколами безопасности уровня-2. Использование масок рекомендуется, как Cryptosporidium яйцеклетки также может быть инфекционным, когда воздушно-капельным путем.

2. В экстракорпорной очистке спорозоитов от C. parvum Oocysts

  1. Очистите спорозоиты от Ооцизтов C. parvum после отбеливания и вымывания отбеливателя, как описано выше.
    1. Перенесите яйцеклетки в трубку 15 мл. Resuspend яйцеклетки в комнатной температуре excystation среды (0,75% W / V натрия таурохолата в DMEM) для получения 1 х 107 ооцизтов / мл. Добавление таурохолата улучшает скорость эксцизии яйцеклеток, улучшая урожайность спорозоита.
    2. Инкубировать суспензию яйцеклетки при 37 градусах по Цельсию на 1-1,5 ч.
    3. Проверка образца микроскопически на степень эксцстанции; 60-80% эксцизации является разумным для хорошего восстановления sporozoites. Если уровень эксцстанции низкий, инкубировать дольше (еще 30 мин до 1 ч).
    4. Определите процент эксцстанции относительно количества начальных яйцеклеток. Excystation рассчитывается как:
      % эксцистационная станция No1 (количество нетронутых яйцеклеток/количество яйцеклеток в начале) х 100
    5. Вымойте клетки для удаления реагентов excystation, добавив 14 мл PBS или средних, смешивания и восстановления клеток (нетронутые ооцисты, ооцисты, оиоцитов и sporozoites) центрифугии на 3400 х г в течение 20 минут для восстановления sporozoites. Тщательно аспирируйте, чтобы избежать потери клеток.
    6. Отрежь пеллеты спорозоита в 1-2 мл DMEM, чтобы получить 3 х 107 ооцистых/мл (в зависимости от количества стартовых яйцеклеток).
    7. Чтобы удалить оставшиеся яйцеклетки и оболочки, процедите подвеску через фильтр 3 мкм(рисунок 1B). Используйте 47-мм аппарат для держателей фильтров, оснащенный поликарбонатным фильтром (размер омара), прикрепленным к стволу шприца объемом 10 мл. Поместите аппарат держателя фильтра поверх трубки 15 мл. Поместите сборку в ведро со льдом или в холодную комнату.
    8. Добавьте 7,5 мл спорозоитной подвески в сборку фильтра и дайте фильтруть его гравитацией. Промойте еще 7,5 мл DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения успеха в изоляции sporozoite свежие яйцеклетки и хорошая excystation имеют решающее значение. Если Слишком много неоступимых яйцеклеток, подвеска не будет проходить через гравитацию. Применение давления на шприц может заставить unexcysted ооцистых до конца. Микроинъекция спорозоитов является более сложной задачей, чем у ооцизом, потому что спорозоиты могут слипаться и блокировать капилляры. Чтобы избежать этого, мы рекомендуем сделать более широкий капиллярный наконечник при инъекционных органоидах с поporoзоитами. Для достижения достаточного уровня инфекции, в 2-4 раза больше спорозоитов необходимо вводить в каждый органоид по сравнению с органоидами, инфицированными ооцистами.
    9. Centrifuge фильтрованного спорозоита подвески на 3400 х г с помощью размахивая ротор ведро в течение 20 минут, чтобы гранулы sporozoites.
    10. Повторное в 50-100 ЗЛ ОмЕ или OMD органоидной культуры среды (см. Таблица материалов) дополнены 0,05% (w/v) Быстрый зеленый краситель и L-глютатион, бетаин, L-цистеин, линолевая кислота и таурин-содержащий буфер5 (см. Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубации яйцеклеток слишком долго может привести к лизис спорозоитов и плохое восстановление и, следовательно, следует избегать.

3. В vitro Культура кишечника кишечника и легких органоидов для микроинъекции

  1. Культура кишечных органоидов в условиях расширения и дифференциации средств массовой информации.
    Примечание:    Детали распространения кишечного и леголегского органоида ранее были описаны в других статьях8,13(см.Таблица материаловдля медиа-рецептов). Здесь мы кратко описываем метод органоидной культуры с конкретной ссылкой на оптимизацию дляCryptosporidiumинъекции и роста. Мы обнаружили, что для визуализации паразитов в органоидов, органоиды, выращенные в среде расширения предпочтительнее тех, в выросли дифференциации средств массовой информации, как есть меньше накопления мусора, чем в органоидов, выращенных в среде дифференциации. Однако, если цель состоит в том, чтобы изолировать ооциды, органоиды, выращенные в средствах дифференциации производят гораздо большее количество яйцеклеток.
    1. Поддержание органоидов в 3D-культурах во внеклеточной матрице (см. Таблицу Материалов)при 37 градусах Цельсия. Добавляйте OME (медиа-расширения) сверху и обновляйте каждый день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для легочных органоидов, у нас нет отдельного расширения и дифференциации средств массовой информации.
    2. Чтобы разделить и пластины органоидов для микроинъекции, удалить средства массовой информации из 6-коловидной пластины, содержащей человеческие органоиды и добавить F12 "(См. Таблица материалов)в колодец и разбить матрицу путем пипетки с 1 мл пипетки отзыв несколько раз. Сбор клеток в трубку 15 мл (2 мл F12) на трубку достаточно для дальнейших процедур).
    3. Добавьте 10-12 мл F12 в еще одну трубку 15 мл и поместите огневую стеклянную трубку в среду, пипетку вверх и вниз 3 раза, чтобы разбить кишечные и легкие органоиды человека.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте длинный стеклянный трубку (20-30 см) и огнем-полить его кратко. Не делайте отверстие (1 мм в диаметре) очень маленьким, потому что органоиды могут быть повреждены. Сделайте кончик трубы гладким, кратко огнеупорных его. Разбейте органоиды на более мелкие кусочки 50 мкм. Органоиды легких имеют более толстую внешнюю мембрану и поэтому требуют более сильного стрижки со стеклянной пипеткой по сравнению со кишечными органоидами. Кроме того, они имеют более медленные темпы роста, чем кишечные органоиды (до 14 дней между каждым проходом).
    4. Добавьте F12 до 5-7 мл и центрифугу на 350 х г в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость центрифугации на этом этапе выше, чем обычно, чтобы сделать хороший клеточной гранулы, которые хорошо отделены от внеклеточной матрицы (см. Таблица материалов). Мы заметили, что по сравнению с мышью тонкой кишечной органоидов, человеческий тонкий кишечник органоидов труднее нарушить.
    5. Удалите как можно больше среды, не нарушая клетки, а затем resuspend гранулы с матрицей поддерживается на 4 градусов по Цельсию; Требуется 200-300 л матрицы на скважину из шестиколодцв. Органоиды должны быть разделены один на три для поддержания довольно высокой плотности клеток.
    6. Плита органоидов в матричных капель около 5-10 л каждый в колодце шестиколодцв пластины. Инкубировать в течение 20-30 мин при 37 градусах Цельсия, а затем добавить расширение среды (OME) на вершине.
    7. Изменение среды каждые 2-3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно через 5-7 дней органоиды, растущие в ЭМ, достигают размера 100-200 мкм и готовы к инъекциям.
    8. Чтобы дифференцировать органоиды, после 5-6 дней в EM, изменить средства массовой информации для дифференциации средств (DM) условия хищных и держать в течение 5-6 дополнительных дней до введения паразитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для расширения органоидов рекомендуется плотно пластинировать органоиды. Для микроинъекций рекомендуется использовать шестиколочные пластины с органоидами, покрытыми при меньшей плотности. Например, пластинные органоиды из трех колодцев шестиколодцв в полную шестискважинную пластину для микроинъекций. Матрица должна быть сохранена при -20 градусов по Цельсию для длительного хранения и размораживаются при 4 градусах Цельсия или на льду перед использованием. Расширение органов легких делается аналогичным образом, но с использованием органов легких конкретных компонентов мультимедиа (Таблица 1)8 .

4. Микроинъекция ооцистых/спорозоитов в органоидный люмен

  1. Микроинъекционные паразиты в апическую сторону 3D органоида(рисунок 2).
    1. Подготовка стеклянных капилляров диаметром 1 мм с помощью выдвижного микропипетта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки, используемые на выдвижной микропайпот (см. Таблица материалов) являются: Тепло No 663, Тянуть No 100, Скорость 200, Время 40 мс. Настройки должны быть скорректированы в соответствии с инструкциями пользователя для конкретной машины.
    2. Вырезать кончик капилляра с щипцами. Размер/диаметр конца капилляра измеряет около 9-12 мкм; это позволяет легко течь яйцеклеток (размер 4-5 мкм).
    3. Заполните капилляры с ооцизтом или спорозоит подвески с помощью микро-загрузчик советы.
    4. Загрузите заполненный яйцей капилляр на микроинжектор.
    5. Микроинъекция 100-200 nL подвески в каждом органоидов под перевернутым микроскопом при 5x увеличение, сохраняя давление постоянным. После микроинъекции, освежить носители с OME или OMD каждый день и поддерживать пластину при 37 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не используем микроманипулятор для микроинъекции. Использование одного и того же капилляра рекомендуется для всего эксперимента, чтобы обеспечить равную инъекцию в каждом образце.

5. Иммунофлуоресценция Окрашивание органоидов

  1. Соберите органоиды (1-2 х 24 скважины) с пипеткой P1000 в трубку 15 мл, содержащую холодный F12.
  2. Пеллетные органоиды при 300 х г в течение 2 мин, удалить супернатант, не нарушая гранулы, и осторожно пайпел гранулы свободно в оставшийся объем.
  3. Добавьте 5 мл 2% параформальдегида в PBS. Чтобы органоиды не прилипли к стене, не инвертировать трубку. Разрешить органоидов, чтобы осесть на дно трубки и исправить на 4 КС ночь или 1 ч при комнатной температуре.
  4. Удалить фиксатор и добавить 10 мл буфера пермяки (0,2% Тритон в PBS).
  5. Поверните трубку при комнатной температуре в течение 20 минут (это гарантирует, что все органоиды остаются в суспензии).
  6. Пелле органоидов на 300 х г в течение 2 мин, а затем отбросить супернатант.
  7. Приостановите органоиды мягко в 500 л блокирующего раствора (см. таблицу материалов)и перенесите в микроцентрифугную трубку 2 мл.
  8. Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре на шейкере. Разрешить органоидов, чтобы осесть на дно трубки под действием силы тяжести. Замените блокирующий раствор первичным антителом (см. таблицу материалов)и инкубация для 1-2 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
  9. Вымойте 3x с PBS, содержащим 0,1% Tween. Пусть органоиды оседают каждый раз и удалить супернатант.
  10. Добавьте вторичный раствор антител (см. таблицу материалов)и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
  11. Вымойте 3x с PBS, содержащим 0,1% Tween. Оставьте 50 Л PBS после третьей стирки.
  12. Гора на слайде путем pipetting органоидов приостановлено в 50 Л PBS на слайде. Удалить избыток PBS, добавить каплю монтажного агента (см. таблицу материалов) и добавить coverslip на вершине. Запечатайте стороны лаком для ногтей и дайте ему высохнуть.

6. Изоляция ооцисты от органоидов

  1. Изолировать новообразованные ооцисты из органоидного просвета.
    Примечание:    Ооцисты изолированы от органоидов путем иммуномагнитного разделения с помощью комплекта изоляции яйцеклеток (см.Таблица материалов) с изменениями, описанными ниже. Изолированные яйцеклетки могут быть проанализированы с помощью иммунофлуоресценции и электронной микроскопии.
    1. Начните с дифференцированных органоидов, которые были сохранены в OMD в течение 5-7 дней и которые не инфицированы, инфицированы в течение 1 дня и инфицированы в течение 5 дней. Используйте первые два в качестве отрицательного элемента управления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обнаружили, что дифференцированные органоиды производят больше яйцеклеток, чем легкие или расширение кишечных органоидов10.
    2. Собирайте органоиды в центрифугные трубки мощностью 15 мл. Центрифуга органоидов в течение 20 мин при 3000 х г и 10 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта высокая скорость необходима, чтобы убедиться, что не яйцеклетки теряются из любых органоидов, которые могут быть нарушены.
    3. Удалите органоидные носители и замените его 5 мл воды.
    4. Нарушить органоиды путем повторного энергичного пипетки с огневой полированной стеклянной пипеткой Pasteur.
    5. Если сгустки видны, перенесите органоидную суспензию в стекло dounce гомогенизатор, и гомогенизировать, пока органоиды хорошо нарушены. Выбросить гомогенизатор не повлияет на ооцисты.
    6. После того, как Есть нет видимых сгустков, добавить 5 мл буфера А из комплекта изоляции яйцеклеток. Смешайте, а затем добавить 120 л магнитных бусин, покрытых анти-ооцист IgM.
    7. Инкубировать клеточную подвеску и магнитные бусы на 2 ч при комнатной температуре с непрерывным смешиванием на рокерной платформе.
    8. В конце инкубации поместите трубки, содержащие клетки и бусы, на магнитной сепаратной стойке, рассчитанной на 15 мл труб.
    9. Поверните трубки в магнитной стойке разделения вручную в течение 3 мин. Бисер будет придерживаться стороны трубки рядом с магнитом.
    10. Осторожно, с 10 мл пипетки, удалить супернатант из бисера. Приготовьбуте бисер в 450 л буфера B и перенесите в микроцентрифугную трубку 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите супернатант до тех пор, пока не подтвердится изоляция яйцеклеток.
    11. Чтобы собрать все оставшиеся бусы и ооцисты, промойте трубку 15 мл с 450 л буфера B и добавьте эту стирку в магнитные бусы в микроцентрифуге трубки.
    12. Повторите шаг 6.1.11 еще раз. Все бусы и захваченные ооцисты теперь должны быть перенесены в микроцентрифугую трубку.
    13. Поместите микроцентрифугную трубку на магнитную сепаратную стойку, предназначенную для хранения микроцентрифуговых труб.
    14. Поверните трубку в магнитной стойке разделения вручную в течение 3 мин.
    15. Аккуратно удалите супернатант с пипеткой в новую трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите супернатант до тех пор, пока не подтвердится изоляция яйцеклеток.
    16. Удалите микроцентрифугную трубку, содержащую магнитные бусы и яйцеклетки, из магнитной стойки разделения.
    17. Добавьте 100 л 0,1 N HCl к магнитным бусинкам, чтобы выяснять яйцеклетки от бисера. Вихрь за 30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вихрь должен быть установлен на чуть меньше, чем максимальная скорость.
    18. Инкубировать бусы в 0,1 N HCl в течение 10 минут при комнатной температуре.
    19. Снова вортекс. Затем поместите трубку обратно на магнитную стойку разделения. Подождите, пока шарики прилипут к стороне трубки, а затем перенесите супернатант в новую микроцентрифуговую трубку.
    20. Повторите шаги 6.1.17 через 6.1.19 и объедините второй eluate с первым elution.
    21. Нейтрализуем унитес с 20 зл и 1 N NaOH, или другой нейтрализующий буфер, такой как 1 M Tris, pH 8.
    22. Чтобы подсчитать яйцеклетки, возьмите 10 л элюат, свяжете его с 10 злистоками антител, специфичных для яйцеклеток (см. таблицу материалов)и посчитайте флуоресцентные яйцеты на гемоцитометре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные яйцеклетки могут храниться при 4 градусах Цельсия или использоваться сразу для иммунофлюоресценции или электронной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представленные здесь протоколы приводят к эффективной очистке ооцизтов и спорозоитов(рисунок 1А),готовых к микроинъекциям. Протокол эксцистанции приводит к освобождению спорозоитов примерно от 70-80% яйцеклеток, поэтому важно отфильтровать оставшиеся ооцисты и оболочки через фильтр 3 мкм. Фильтрация приводит к почти 100% очистке спорозоита(рисунок 1B). Кроме того, добавление зеленого красителя помогает обеспечить инъекцию всех органоидов и позволяет визуализиров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Культура паразитов Cryptosporidium в кишечных и дыхательных органах обеспечивает точную модель для изучения взаимодействия хозяина-паразита10, но также имеет много других применений. Например, современные методы отбора и распространения генетически модифицированных паразитов Cryptosporidium требуют прохождения у мышей19, что не позволяет изоляции паразитов, которые имеют изменения, необходимые для инфекции in vivo. Органоидная культура Криптоспоридиума...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы признательны Деборе А. Шефер из Школы животных и сравнительных биомедицинских наук, Колледжа сельского хозяйства и наук о жизни, Университета Аризоны, Тусона, ак, США за помощь в производстве и анализе яйцеклеток. Мы также благодарим Франчески Микроскопия и Imaging центр и Д. Л. Mullendore в Университете штата Вашингтон для TEM подготовки и визуализации изолированных органоидных ооц.

Д.Д. является получателем гранта VENI от Нидерландской организации научных исследований (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. является получателем гранта VENI от Нидерландской организации научных исследований (NWO-ALW, 863.14.002) и поддерживается стипендией Марии Кюри от Европейской комиссии (Предложение 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Исследования, приведшие к этим результатам, получили финансирование от Европейского исследовательского совета в соответствии с Соглашением о расширенных грантах ERC No 67013 и от NIH NIAIH в соответствии с R21 AT009174 в RMO. Эта работа является частью Института Oncode, который частично финансируется Голландским онкологическим обществом и финансируется за счет гранта Голландского онкологического общества.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Экстракт базальной мембраны (внеклеточный матрикс)amsbio3533-010-02  Антитело
Crypt-a-Glo (специфическое антитело к ооцисте)Waterborne, IncA400FLR-1XКонечная концентрация = Используйте 2-3 капли/слайд
Магнитные шарики с покрытием Crypto-Grab IgMWaterborne, IncIMS400-20 
Стойка Dynamag 15Thermofisher Scientific12301D 
Dynamag 2 стойкиThermofisher Scientific12321D 
EMD Millipore  Мембранные фильтры из поликарбоната Isopore - 3&микро; mEMD-MilliporeTSTP02500 
Быстрый зеленый красительSIGMAF7252-5G    
Микроинъектор Femtojet 4iEppendorf5252000013 
Стеклянные капилляры диаметром 1 ммWPITW100F-4 
Матригель (внеклеточный матрикс)Corning356237 
Микрофуге пробирка 1,5 млEppendorfT9661-1000EA 
Наконечники для микрозагрузчиковEppendorf612-7933 
Съемник микропипеток P-97Затвор инструментаP-97 
Нормальная сыворотка для осликовBio-RadC06SB 
PenstrepGibco15140-122 
Гипохлорит натрия (использование 5%)Clorox50371478 
Супер стик горкиWaterborne, IncS100-3 
Swinnex-25 47 мм Держатель фильтра из поликарбонатаEMD-MilliporeSX0002500 
Таурохолевая кислота натрия соль гидратSIGMAT4009-5G 
Твин-20Merck8221840500 
Монтажный агент VectashieldVector LabsH-1000 
Vortex Genie 2Scientific industries, IncSI0236 
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)    Final amount
DMEMInvitrogen12634-010500 мл
PenstrepGibco15140-1225 мл запаса по 500 мл DMEM
GlutamaxGibco350500385 мл запаса по 500 мл DMEM
HepesGibco156300565 мл запаса по 500 мл DMEM
<сильная> КИШЕЧНАЯ ОРГАНОИДНАЯ СРЕДА-ОМЕ (среда расширения)<сильная>    <сильный>Конечная концентрация
A83-01Токрис2939-50мг0,5 и микро; M
Adv+++  составляет до 100 мл
B27Invitrogen175040441x
EGFPeprotechAF-100-1550 нг/мл
GastrinTocris3006-1mg10 нМ
NACSigmaA9125-25G1,25 мМ
NICSigmaN0636-100G10 мМ
Noggin CMВ доме* 10%
Ингибитор P38 (SB202190)SigmaS7076-25 мг10 & микро; M
PGE2Tocris2296/1010 нМ
PrimocinInvivoGenant-pm-11 мл/500 мл
медиа RSpoI CMВ доме* 20%
Wnt3a CMВ доме* 50%
На дому* - сотовые линии будут предоставлены по запросу;  
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Дифференцировочная среда)  Для дифференцировки органоидов расширяющегося тонкого кишечника выращивали в среде, богатой Wnt, в течение шести-семи дней после расщепления, а затем выращивали в среде для дифференцировки (изъятие Wnt, никотинамида, SB202190, в среде для дифференцировки (изъятие Wnt, никотинамида, SB202190, простагландина E2 из среды, богатой Wnt, или OME)
LUNG ORGANOID MEDIA-LOM (дифференцировочная среда)<strong>    Конечная концентрация
Adv+++  составляет до 100 мл
ALK-I A83-01Tocris2939-50mg500 нМ
B27Invitrogen175040440,076388889
FGF-10Peprotech100-26100 нг/мл
FGF-7Peprotech100-1925 нг/мл
N-ацетилцистеинSigmaA9125-25G1,25 мМ
НикотинамидSigmaN0636-100G5 мМ
Noggin UPEU-Protein Express Contactкомпания напрямую10%
p38 MAPK-ISigmaS7076-25 мг1 & микро;
M PrimocinInvivoGenant-pm-11:500
RhoKI Y-27632Abmole BioscienceM1817_100 мг2,5 &; m
Rspo UPEU-Protein Express Contactкомпания напрямую10%
Восстановительный буфер (для ресуспензии ооцист и спорозоитов для инъекций)    ><сильный>Конечная концентрация
L-глутатион восстановленSigmaG4251-10MG0,5 g/μ L бетаина OME/OMD/LOM
Sigma619620.5 μ g/μ L OME/OMD/LOM
L-CysteineSigma168149-2.5G0.5 μ g/μ Л линолевой кислоты OME/OMD/LOM
SigmaL1376-10MG6.8 μ г/мл OME/OMD /LOM
ТауринSigmaT0625-10MG0,5 μ g/μ L OME/OMD/LOM
strong>Blocking Buffer (для иммунофлуоресцентного окрашивания)    Final Concentration
Donkey/Goat сывороткаBio-RadC06SB2%
PBSThermo-Fisher70011044Составлять до 100 мл
Tween 20MerckP13790,1%
Список используемых антител      
Alexa 568 козий анти-кроличийInvitrogenA-11011Dilution-1:500; RRID: AB_143157
Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Меченое флуоресцеином антитело Crypto-GloWaterborne, IncA400FLKDilution - 1:200
Crypta-Grab IMS Beads - Магнитные шарики, покрытые моноклональными антителами реактивнымиWaterborne, IncIMS400-20Dilution-1:500
DAPIThermo Fisher ScientificD1306Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482
Phalloidin-Alexa 674InvitrogenA22287Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155
кролика к gp15, полученное R. M. O' Коннор (соавтор).По запросуПо запросуРазбавление-1:500
Sporo-GloWaterborne, IncA600FLR-1XРазбавление- 1:200
< антитело

Ссылки

  1. Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
  2. Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
  3. Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
  4. Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
  5. Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
  6. DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
  7. Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
  8. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).
  9. Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  12. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  14. O'Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
  15. Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
  16. Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
  17. O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
  18. Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
  19. Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
  20. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3D
Изучение Cryptosporidium инфекции в 3D Ткани полученных человеческих органоидных систем культуры микроинъекции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.